NÁVOD K POUŽITÍ MÉDIA NA MISKÁCH URČENÁ K OKAMŽITÉMU POUŽITÍ PA-254058.06 Rev.: April 2013 BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) ÚČEL POUŽITÍ Médium BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) se používá při diskových difuzních testech citlivosti na antibiotika pro klinické izoláty rodu Haemophilus, jak je popsáno ve schváleném standardu M2 publikovaném společností Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 1 ZÁSADY A VYSVĚTLENÍ POSTUPU Mikrobiologická metoda. Agar Mueller Hinton s přídavkem 1% hemoglobinu a 1% obohacení IsoVitaleX (čokoládový agar Mueller Hinton) bylo dříve doporučované médium pro Haemophilus influenzae. 2 Rozsáhlé studie, které provedl Jorgensen a spol. vedly k vývoji agarového testovacího média pro hemofily (HTM). 3,4 Toto médium je agar Mueller Hinton s přídavkem faktoru X (hemin nebo hematin), faktor V (nikotinamid adenin dinukleotid, NAD) a kvasničného extraktu. Hlavní výhodou agaru HTM v porovnání s čokoládovým agarem Mueller Hinton je optická čistota, umožňující měření průměrů zóny inhibice z dolní strany misky, což je standardní postup testu pro nenáročné organismy na agaru Mueller Hinton. Agar HTM dále obsahuje nízké koncentrace thymidinu a proto je vhodný pro testování citlivosti na trimethoprim/ sulfametoxazol. Interpretační kritéria pro testování citlivosti na antibiotika jsou uvedena v dokumentu CLSI Document M100 (M2), který je součástí dokumentu CLSI Document M2. 1 Pro další podrobnosti je nutné si pročíst tento dokument. BD Haemophilus Test Medium Agar (Agarové testovací médium BD pro hemofily) se skládá z agaru Mueller Hinton s přídavkem faktoru X (hemin nebo hematin), faktoru V (nikotinamid adenin dinukleotid, NAD) a kvasničného extraktu. ČINIDLA BD Haemophilus Test Medium Agar Složení* na jeden litr čištěné vody Hovězí výtažek 2,0 g Kyselý hydrolyzát kaseinu 17,5 Škrob 1,5 Agar 17,0 Kvasničný extrakt 5,0 Hematin 0,015 Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) 0,015 ph 7,3 ± 0,1 *Upraveno anebo doplněno dle požadavků tak, aby byla splněna kritéria účinnosti. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ. Pouze k odbornému použití. Pokud misky vykazují známky mikrobiální kontaminace, změny zabarvení, vysušení, popraskání nebo jiné známky poškození, nepoužívejte je. Nadměrné svraštění tohoto média následkem vysušení může vést k nesprávným výsledkům citlivosti. Pokyny pro aseptickou manipulaci, informace týkající se biologického nebezpečí a pokyny pro likvidaci použitého produktu naleznete v dokumentu VŠEOBECNÉ POKYNY K POUŽITÍ. SKLADOVÁNÍ A ŽIVOTNOST Po převzetí skladujte misky až do doby těsně před použitím v originálním pouzdru, v temnu a při teplotě 2 až 8 C. Systém nesmí zmrznout nebo se přehřát. Misky lze očkovat až do data platnosti (viz štítek na obalu) a inkubovat je lze po doporučenou dobu inkubace. PA-254058.06-1 -
Misky z otevřených sad po 10 kusech lze použít po dobu jednoho týdne, pokud jsou uloženy v čistém prostředí při teplotě 2 až 8 C. KONTROLA KVALITY UŽIVATELEM Při kontrole kvality uživatelem je nutné dodržet příslušné normy CLSI 1 nebo státní normy, pokud se uplatňují. V zásadě je nutno sledovat postupy popsané níže v části Provedení testu, včetně referenčních kmenů uvedených v části Materiál, který není součástí dodávky. Správné fungování misek BD Haemophilus Test Medium Agar (Agarové testovací médium BD pro hemofily - HTM) a antibakteriálních terčíků kontrolujte nejméně dvakrát týdně. Vzhled nenaočkovaného média: světle oranžová. POSTUP Dodaný materiál BD Haemophilus Test Medium Agar (90mm misky Stacker). Mikrobiologicky kontrolováno. Materiál, který není součástí dodávky 1. Očkovací živná půda ve zkumavkách, např. BD Trypticase Soy Broth (živná půda s výtažkem sójového kaseinu) nebo živná půda Mueller Hinton II (s upravenými kationty) v objemech po 5 ml pro přípravu standardního nátěru a sterilní živná půda nebo fyziologický roztok pro zředění nátěru. 2. Porovnávací standard síranu barnatého (0,5 ml 0,048 M BaCl 2 [1,175% w/v BaCl 2. 2H 2 O] v 99,5 ml 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1% v/v]). 3. Fotometrické zařízení pro úpravu zakalení očkovací suspenze tak, aby odpovídalo McFarlandově normě o hodnotě 0,5. 4. Jako alternativu výše uvedených materiálů (1-3) lze použít očkovací systém BD Prompt Inoculation System (zařízení pro titrační přípravu nátěru). 5,6 5. Kontrolní kultury - Haemophilus influenzae ATCC 49247, ATCC 49766 a ATCC 10211. 6. Papírové terčíky impregnované předepsaným množstvím antibakteriálních látek, např. terčíky pro testování citlivosti BD Sensi-Disc. 7. Zásobník, např. 6-ti místné zařízení Sensi-Disc. 8. Pravítko nebo jiné zařízení pro měření velikosti zóny v milimetrech. 9. Inkubátor, který produkuje atmosféru obsahující 5% CO 2 nebo jiné zařízení, které je schopno produkovat aerobní atmosféru s obohacením o CO 2. 10. Činidlo pro provedení rychlého ß-laktamázového testu, jako např. disky BD Cefinase. 11. Pomocná kultivační média, činidla a laboratorní vybavení dle potřeby. Typy vzorků Tento produkt se používá pouze k testování citlivosti čistých kultur rodu Haemophilus izolovaných z klinických vzorků (viz také Specifické vlastnosti účinnosti a Omezení postupu). Provedení testu 1. Před zahájením testování citlivosti na antibiotika si připravte Gramovo barvení pro potvrzení čistoty kultury a pro potvrzení předběžné identifikace druhu Haemophilus. 2. Jako zdroj inokula použijte několik dobře izolovaných kolonií odebraných přímo z misky čokoládového agaru inkubovaného přes noc (preferuje se 20 až 24 hodin). 3. Rychlý ß-laktamázový test je nutné provést pro rychlou detekci kmenů, které jsou rezistentní na penicilin, ampicilin nebo amoxicilin. 4. Připravte si suspenzi testovaného organismu v živné půdě Mueller Hinton Broth, živné půdě Mueller Hinton II nebo v 0,9% fyziologickém roztoku. Tuto suspenzi je nutné upravit na zákal o hodnotě 0,5 McFarlandova standardu s použitím fotometrického zařízení. Tato suspenze bude obsahovat přibližně 1-4 x 10 8 CFU/mL. Při přípravě této suspenze dávejte pozor, protože vyšší koncentrace inokula mohou vést k falešně rezistentním výsledkům u některých ß-laktamových antibiotik, zvláště v případech testování kmenů H. influenzae produkujících beta-laktamázu. 1 5. Bylo zjištěno, že pro účely běžného testování bakterií, včetně H. influenzae jsou přijatelné alternativní metody přípravy nátěru pomocí zařízení, která umožňují přímou standardizaci nátěru bez úpravy zakalení, například očkovací systém BD Prompt Inoculation System. 5,6 PA-254058.06-2 -
6. Do 15 minut od úpravy zakalení inokula ponořte do řádně rozpuštěného inokula sterilní tampón a několikrát jím ráznými pohyby otáčejte proti horní vnitřní stěně zkumavky, aby se vyloučilo nadměrné množství tekutiny. 7. Celý povrch misky s BD Haemophilus Test Medium Agar (agarové testovací médium BD pro hemofily) naočkujte třikrát a mezi nátěry přitom otáčejte miskou o 60 tak, aby bylo dosaženo rovnoměrného rozočkování. 8. Víčko může zůstat otevřené po dobu 3 až 5 minut a miska může zůstat při pokojové teplotě po dobu maximálně 15 minut, což umožní absorbování případné povrchové vlhkosti před aplikací terčíků napuštěných léčivem. 9. Pomocí vypouštěcího zařízení antibakteriálních terčíků aplikujte terčíky a použijte přitom dodržujte aseptická bezpečnostní opatření. Většina antibiotik produkuje větší inhibiční zóny při testování účinku na kmeny Haemophilus v porovnání s dalšími organismy. Proto se na jednu 100mm misku nesmí pokládat více než čtyři antimikrobiální terčíky, a zároveň ne více než šest následujících terčíků: cefalosporiny třetí generace (např. cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxon, ceftizoxim), aztreonam, imipenem nebo ciprofloxacin. Po uložení misek na agar kotouče přitlačte sterilní jehlou nebo pinzetou, aby byly v úplném kontaktu s povrchem média. 10. Během 15 minut po aplikaci terčíků obraťte misky a inkubujte je po dobu 16 až 18 hodin při teplotě 35 C v aerobní atmosféře s obohacením o 5% oxid uhličitý. 11. Naočkujte misku BD Haemophilus Test Medium Agar kmenem H. influenzae ATCC 10211 a inkubujte spolu s miskami pro testování citlivosti na antibiotika pro určení, zda médium podporuje dostatečný růst. Výsledky 1. Po 16 až 18 hodinách inkubace misky zkontrolujte. Měl by být přítomný slévající se povlak rostoucí flóry. Rostou-li pouze izolované kolonie, nátěr byl příliš slabý a test je nutno opakovat. 2. Pomocí posuvného měřítka, pravítka nebo šablony připravené pro tento účel změřte průměr zón úplné inhibice (při posouzení prostým okem) včetně průměru terčíku na nebližší celý milimetr. Měřidlo přidržte u zadní části misky oproti černému neodrážejícímu povrchu, aby osvětlení dopadalo shora. 3. Za hraniční bod je nutno považovat oblast, která při zjištění prostým okem nevykazuje zjevný viditelný růst. Slabého růstu drobných kolonií, které lze zjistit jen s obtížemi u okraje zjevné zóny inhibice, si nevšímejte. U trimetoprimu a sulfonamidů mohou stopy antagonistů v médiu zapříčinit mírný růst, proto si nevšímejte mírného růstu (20 % povlakového růstu nebo méně) a průměr zóny změřte pouze podle zřetelného okraje. Výpočet a interpretace výsledků Pokyny pro interpretaci výsledků získaných z klinických izolátů kmenů Haemophilus naleznete v dokumentu CLSI Document M100 (M2). 1 Výsledky je možné hlásit jako rezistentní, středně citlivé nebo citlivé v závislosti na získaných průměrech zón inhibice. Organismy s pozitivním testem na produkci beta-laktamázy je nutné považovat za rezistentní na ampicilin bez ohledu na získané průměry zón inhibice. Je nutné uvést, že byly popsány ampicilin-rezistentní kmeny H. influenzae s nedostatečnou aktivitou ß-laktamázy. 7 Pokud tedy průměr zóny inhibice naznačuje rezistenci na ampicilin, izoláty je nutné hlásit jako rezistentní na toto léčivo, i když byl ß-laktamázový test negativní. Kontrolní kultury je nutné zahrnout při každém provedení testu citlivosti nebo v týdenních intervalech, pokud je možné zdokumentovat uspokojivou účinnost v souladu se standardem CLSI Standard M2, který obsahuje tabulky (M100) se správnými průměry zón inhibice. 1 Poznámka: Pravidelně vycházejí informační dodatky k dokumentu M2 normy CLSI nebo revidované verze obsahující revidované tabulky antibakteriálních terčíků a interpretačních norem. Pro současná doporučení je nutno použít nejnovější tabulky. Celou normu a informační dodatky lze objednat od Národního výboru pro klinické laboratorní normy na adrese Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA. Telefon: ++1-610-688-1100. PA-254058.06-3 -
SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚČINNOSTI A OMEZENÍ POSTUPU A. Studie reprodukovatelnosti 8 Tři výrobní šarže BD Haemophilus Test Medium Agar (agarové testovací médium BD pro hemofily) byly vyhodnoceny pomocí postupu diskových testů citlivosti na antibiotika (M2-A4), které v dané době doporučila organizace NCCLS. 9 Ve studii bylo použito 12 antimikrobiálních látek (amoxicilin/klavulanát, ampicilin, ampicilin/sulbaktam, cefaklor, cefonicid, ceftriaxon, cefuroxim, chloramfenikol, ciprofloxacin, rifampin, tetracyklin, trimethoprim/sulfamethoxazol) a 14 kmenů H. influenzae. Ze 14 kmenů byl sedm z Americké databáze typových kultur (American Type Culture Collection - ATCC) a zbývajících sedm kmenů bylo zásobních, z nichž šest byly klinické izoláty a jedna průmyslová kultura pro kontrolu kvality. Průměry zón inhibice získané u každé ze tří šarží média byly porovnány s interpretačními kritérii (tabulka 2A) v dokumentu M2-A4. 9 V pouze šesti případech byly u jedné šarže získány takové průměry zón, které vytvářely odlišnou interpretační kategorii v porovnání s dalšími dvěma šaržemi. Z těchto šesti rozdílů byly čtyři u tetracyklinu, jeden u cefakloru a jeden u cefuroximu. V případě tetracyklinu byl vytvořen výsledek s interpretační kategorií citlivé nebo středně citlivé (drobná chyba). U cefakloru a cefuroximu, došlo k rozdílu 1 mm, což mělo za následek kategorii středně citlivé nebo rezistentní, rovněž drobná chyba. V této studii bylo pět kmenů H. influenzae, které produkují beta-laktamázu. U každého z těchto kmenů produkovala každá šarže HTM takové průměry zón inhibice u ampicilinu, které by byly interpretovány jako rezistentní. Dva z pěti kmenů rovněž produkovaly chloramfenikolacetyltransferázu (CAT). Zóny inhibice u chloramfenikolu, které byly získány u těchto dvou kmenů, by byly konzistentní s rezistencí na chloramfenikol. 10,11 B. Porovnání s čokoládovým agarem Mueller Hinton 8 Postup s terčíky dle NCCLS byl proveden u 213 klinických izolátů H. influenzae na agaru HTM a čokoládovém agaru Mueller Hinton. 9,12 Testovanými antimikrobiálními látkami byly ampicilin, ampicilin/sulbaktam, amoxicilin/klavulanát a chloramfenikol. Tyto látky byly jedinými antimikrobiálními látkami, u kterých byly definovány interpretační kritéria zóny inhibice na čokoládovém agaru Mueller Hinton. 13,14 Byly získány následující výsledky. Čokoládový agar Mueller Hinton BD Haemophilus Test Medium Agar (Agarové testovací médium pro hemofily) S I R S 808 1 2 I 0 0 0 R 0 0 41 Shoda: 99,6 % C = citlivý I= středně citlivý R = rezistentní U ampicilinu se vyskytly dvě velké chyby a jedna drobná chyba. U obou velkých chyb došlo na BD Haemophilus Test Medium Agar (Agarové testovací médium BD pro hemofily) k produkci rezistentního výsledku, zatímco u čokoládového agaru Mueller Hinton došlo k produkci citlivého výsledku. Oba tyto izoláty byly pozitivní na beta-laktamázu. Z tohoto důvodu byl správný rezistentní výsledek. Drobná chyba se vyskytla u izolátu, který produkoval středně citlivý výsledek na agaru HTM a citlivý výsledek na čokoládovém agaru Mueller Hinton. C. Omezení postupu U některých kombinací organismů a antibakteriálních látek nemusí mít zóna inhibice ostře ohraničený okraj, což může vést k nesprávné interpretaci. Nesprávná koncentrace nátěru může vést k nepřesným výsledkům. Je-li nátěr příliš silný, mohou být zóny inhibice příliš malé, a je-li nátěr příliš slabý, mohou být tyto zóny příliš velké a těžko měřitelné. Nevhodné uskladnění antibakteriálních terčíků může způsobit ztrátu účinnosti a zdánlivě rezistentní výsledek. Citlivost organismu na určitou antibakteriální látku in vitro nemusí nutně znamenat, že tato látka bude účinná také in vivo. Pokyny pro interpretaci výsledků naleznete v příslušných odkazech na literaturu. 2,15 PA-254058.06-4 -
ODKAZY 1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 2. Thornsberry, C., T.L. Gavan, E.H. Gerlach. 1977. Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society for Microbiology, Washington, D.C 3. Jorgensen, J.H., J.S. Redding, L.A. Maher, and A.W. Howell. 1987. Improved medium for antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 25:2105-2113. 4. Jorgensen, J.H., A.W. Howell, and L.A. Maher. 1990. Antimicrobial susceptibility testing of less commonly isolated Haemophilus species using Haemophilus test medium. J. Clin. Microbiol. 28:985-988. 5. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson. 1983. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17:450-457. 6. Marsik, F., G. Evans, J. Fowler, and L. Thompson. 1989. Comparison of the BBL Prompt system, Abbott A-Just, and visual method for the preparation of Haemophilus influenzae inoculum for the Bauer-Kirby procedure, abstr. C-67, p. 404. Abstr. 89th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1989. 7. Doern, G.V., J.H. Jorgensen, C. Thornsberry, D.A. Preston, T.A. Tubert, J.S. Redding, and L.A. Maher. 1988. A national collaborative study of the prevalence of antimicrobial resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 32:180-185. 8. Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1990. Approved standard: M2-A4. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 4th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 10. Azemun, P., T. Stull, M. Roberts, and A.L. Smith. 1981. Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 20:168-170. 11. Doern, G.V., G.S. Daum, and T.A. Tubert. 1987. In vitro chloramphenicol susceptibility testing of Haemophilus influenzae: disk diffusion procedures and assays for chloramphenicol acetyltransferase. J. Clin. Microbiol. 25:1453-1455. 12. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1984. Approved standard: M2-A3. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 3rd ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 13. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1987. Second Informational Supplement: M100-S2. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 14. Doern, G.V. and R.N. Jones. 1988. Antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 32:1747-1753. 15. Woods, G.L., and J.A. Washington. 1995. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p. 1327-1341. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. USA. BALENÍ/DOSTUPNOST BD Haemophilus Test Medium Kat. č. 254058 Médium na miskách k okamžitému použití, 20 kusů v balení DALŠÍ INFORMACE Další informace vám poskytne místní zástupce společnosti BD. PA-254058.06-5 -
Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ Prompt is a trademark of 3M ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. 2013 BD PA-254058.06-6 -