Využití DNA sekvencování v taxonomii prokaryot Mgr. Pavla Holochová, doc. RNDr. Ivo Sedláček, CSc. Česká sbírka mikroorganismů Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita, Brno
Molekulárně-biologické metody v taxonomii prokaryot analýza genotypu - DNA, RNA, proteinů DNA: RFLP, PFGE, DNA-DNA hybridizace PCR metody, ribotypizace, DNA sekvencování SEKVENCOVÁNÍ EKVENCOVÁNÍ přímá metoda pro detekci sekvenčních polymorfismů nejvyšší rozlišovací schopnost sledování evolučního vývoje organismů tvorba fylogenetických stromů
DNA sekvencování využití geneticky stabilních genů (housekeeping gene) - nepodléhají přestavbám (delece, inzerce, inverze) - nízká pravděpodobnost bodových mutací v průběhu času Geny vhodné pro sekvencování: 16S rrna 23S rrna gen pro elongační faktor Tu geny pro RNA polymerázu (rpod, rpob) reca hsp60 gyrb
Konstrukce fylogenetického stromu PCR amlpifikace sekvence sekvence uloženy v databázích: GenBank, Ridom databáze, cpn60 databáze,... srovnání sekvencí počítačovými programy: srovnání sekvencí počítačovými programy: ClustalW, PHYLIP, MEGA4, MUSCLE konstrukce dendogramu - neighbor-joining (Saitou a Nei, 1987), - maximum likelihood (Felsenstein, 1981) - minimum evolution - ověření správnosti větví bootstrap analýza evoluční vzdálenost vyjádřena procentem podobnosti výsledky nutno potvrdit dalšími metodami polyfázový přístup
NEVÝHODY DNA SEKVENCOVÁNÍ nekvalitní, chybné sekvence problém databází řešení: kontrola sekvencí, využití specializovaných databází chyby při tvorbě fylogenetických stromů řešení: konstrukce více typů stromů srovnání výsledků finanční náročnost
Rod Aeromonas gram-negativní tyčky, fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní 16 validně popsaných druhů výskyt ve vodách, infekce studenokrevných živočichů, průjmovitá onemocnění u lidí řazení některých druhů do komplexů (A. caviae, sobria, hydrophila) 16S rrna - nízká rozlišovací schopnost další geny: gyrb, rpod, cpn60 (hsp60/groel) Phylogenetic analysis and identification of Aeromonas species based on sequencing of the cpn60 universal target. David Miñana-Galbis, Aintzane Urbizu-Serrano, Maribel Farfán, M. Carmen Fusté and J. Gaspar Loren. Int J Syst Evol Microbiol (2009)
Sekvencování u rodu Aeromonas: cpn60 zpracováno 47 kmenů rodu Aeromonas sekvence dostupné v databázi chaperoninů cpndb (http://cpndb.cbr.nrc.ca) sekvenace firmou Eurofins MWG Operon, Německo počítačové programy: ClustalW, MEGA4 fylogenetický strom neighbor-joining ověření správnosti větví bootstrap analýza příslušnost k druhu: 3,5 % příslušnost k rodu: 3,7-16,9 %
A. caviae komplex druhy: encheleia eucrenophila media caviae zdroj: říční voda / krasová voda / klinický materiál Výsledek: 3 potvrzení druhu 5 zařazení do druhu v komplexu A. caviae 2 zařazení do jiného druhu
A. hydrophila komplex druhy: hydrophila popoffii bestiarum salmonicida poddruhy A. hydrophila: hydrophila ranae dhakensis zdroj: říční voda / krasová voda / klinický materiál Výsledek: 8 potvrzení druhu a upřesnění poddruhu 4 zařazení do druhu v komplexu A. hydrophila 2 zařazení do jiného druhu identifikace A. hydrophila subsp. dhakensis (P1097) z klinického materiálu
A. salmonicida poddruhy A. salmonicida: pectinolytica achromogenes salmonicida masoucida smithia nelze odlišit zdroj: říční voda / krasová voda / izoláty z ryb Výsledek: 9 potvrzení druhu 2 zařazení do jiného druhu
A. sobria komplex druhy: sobria jandaei veronii biovar Sobria veronii biovar Veronii enterpelogenes shubertii zdroj: říční voda / krasová voda / izoláty z ryb / klinický materiál Výsledek: 3 potvrzení druhu 3 zařazení do druhu v komplexu A. sobria 4 zařazení do jiného druhu - druh A. diversa - CCM 7325 (klinický materiál) - nový druh CCM 7641 (krasová voda)
Vyhodnocení výsledků 47 kmenů: 23 vzorků - potvrzení druhu a upřesnění poddruhu (49 %) 12 vzorků - zařazení do druhu v rámci v komplexu (26 %) 10 vzorků - zařazení do jiného druhu (21 %) 2 kmeny potvrzení nových druhů
Závěr pro taxonomii rodu Aeromonas - sekvence genu cpn60 vhodnější než sekvence 16S rrna vysoká rozlišovací schopnost potvrzení zařazení kmenů do druhu identifikace druhu uvnitř komplexu identifikace poddruhů aplikovatelnost na kmeny klinické i kmeny z prostředí odlišení nových druhů
Děkuji za pozornost