VOLBA OPTIMÁLNÍ METODY Jak nalézt z velkého množství metod nejlepší ( fit for purpose ) postup? Jak na to? 1. Identifikovat problém požadovaná informace (kvalitativní či kvantitativní analýza, ). 2. Nalézt faktory, které je nutné posuzovat (kritéria: jaká přesnost, správnost, ). 3. Identifikace interferencí. 4. Volba metody (vyhledání vhodných metod v literatuře, normách, modifikace existujících metod). 5. Provedení validace metody. 6. Volba strategie vzorkování. 1
Zvažované faktory I PŘESNOST a SPRÁVNOST obvykle nejsou limitujícím faktorem pro stopovou analýzu. Důležitou roli hrají u výsledků blízko limitní hodnoty. MEZ DETEKCE A STANOVITELNOSTI důležité zejména u stopové analýzy. Mez detekce by měla být 10x menší než běžně analyzované koncentrace. Naopak nehrají roli u analýzy makrosložek. CITLIVOST míra schopnosti metody rozlišit dva vzorky směrnice kalibrační přímky. PRACOVNÍ ROZSAH ROZSAH OPERACÍ, POŽADOVANÉ VYBAVENÍ Zvažované faktory II RYCHLOST ANALÝZY CENA ANALÝZY BEZPEČNOST radiochemické analýzy a experimenty, toxická rozpouštědla, KCN, klinické a biologické vzorky, ROBUSTNOST necitlivost metody na malé odchylky v postupu či složení vzorků. SELEKTIVITA selektivní metoda: stanovení analytu v určité matrici není závislé na přítomnosti omezeného množství určitých příměsí. Zcela selektivní metoda pro analyt nebo skupinu analytů specifická. 2
Selektivita Signál vzorku: S samp = k.c A citlivost x koncentrace analytu S samp = S A S I = k A.c A k I.c I citlivosti a koncentrace Analytu a Interferentu Koeficient selektivity míra citlivosti metody na přítomnost interferentu (může nabývat kladných i záporných hodnot) K A,I = k I /k A Je-li K A,I větší než 1 či menší než 1 je metoda selektivnější k interferentu než analytu. S samp = k A (c A K A,I.c I ) Je nutné rozhodnout, které faktory jsou nezbytné, které užitečné a které nedůležité. Užitečná je konzultace se zadavatelem. VYHLEDÁVÁNÍ METOD (postupů): Odborná literatura, časopisy. Aplikační listy dodávané s přístrojem. Postupy od profesních organizací (Association of Official Analytical Chemists). Standardizační orgány: ČSN, ISO, EPA, SÚKL. Metody vyvinuté v laboratoři jejich modifikace. 3
VÝVOJ POSTUPU Po zvolení optimální metody je nezbytné vyvinout postup pro konkrétní podmínky 1. Eliminace interferencí (z matrice vzorku): většinou nesnadný úkol, protože interferent ani jeho koncentrace není předem známa. Obvykle se se vzorky zpracovává slepý pokus. 2. Kalibrace a standardizace. Standardizace = potvrzení matematického vztahu mezi množstvím analytu a signálem metody. 3. Vypracování strategie vzorkování: správné vzorkování zabezpečuje, že vzorek je reprezentativní. 4. Validace: proces ověřující, že postup či metoda poskytuje přijatelné výsledky. 4
VALIDACE (analytické) METODY Validace = potvrzení platnosti VALIDACE proces, při němž se určuje vhodnost použití daného (analytického) systému pro získání relevantních dat. Při validaci posuzujeme, zda jsou parametry metody srovnatelné s požadavky na výsledky. Hledáme vztah mezi požadavky na výsledek a vlastnostmi metody. Jsou-li požadavky na výsledek špatně definovány nebo nerealistické, může se stát, že i validovaná metoda neposkytne žádoucí výsledky. 5
Validační plán Specifikace požadavků Volba metody Nalezení validačních údajů (standardizovaná metoda) Volba rozsahu validace Validační experimenty vyhodnocení Při splnění požadavků bezpečné používání metody Validované parametry Konfirmace identity tzn. že měřená odezva může být přiřazena danému analytu a že nepochází od interferujících složek. Specifičnost metody udává rozsah, do kterého může být analyt stanoven v komplexní směsi, aniž by došlo k interferenci s ostatními složkami směsi. Pracovní rozsah (u kvantitativní analýzy) linearita kalibrační závislosti. Mez detekce a mez stanovitelnosti. Přesnost metody. Odchylka (pravdivost) metody, výtěžnost. Robustnost vliv malých odchylek v postupu na výsledek. 6
Specifičnost metody Selektivita metody se mění v závislosti na koncentraci stanovovaného analytu, v závislosti na koncentraci ostatních komponent matrice. Použitelnost metody by měla být studována pomocí různých vzorků od čistých etalonů po směsi s komplexními matricemi. Metodický postup: 1. Analyzujeme n-krát (n > 10) vzorek čistého analytu střední hodnota. 2. Analyzujeme n-krát vzorek čistého analytu s přídavkem příměsi v takových koncentracích, které jsou přibližně stejné jako v reálné matrici střední hodnota. 3. Testování shody středních hodnot. Pokud je zamítnuta hypotéza o shodě, vypočteme korekční faktor. Pracovní rozsah kalibrace, linearita Kalibrace (metrologický slovník) Soubor úkonů, kterými se stanoví za specifikovaných podmínek vztah mezi hodnotami veličin, které jsou indikovány přístrojem nebo měřícím systémem a odpovídajícími hodnotami, které jsou realizovány etalony. V praxi má kalibrační závislost obecně sigmoidní charakter, přičemž na počátku (v blízkosti 0) a při vysokých koncentracích limituje k rovnoběžce s osou koncentrace. Metodický postup (pro pracovní rozsah): 1. Změříme závislost analytického signálu na koncentraci v nejširším možném intervalu koncentrací včetně slepého pokusu. 2. Zobrazíme závislost vhodným statistickým programem. 3. Na základě subjektivní úvahy zvolíme předpokládanou lineární oblast. 4. V této oblasti znovu experimentálně metodu kalibrujeme, přičemž uvažujeme vliv matrice a kalibrujeme při optimální kombinaci významných faktorů. 7
Pracovní a lineární rozsah Linearita Zjištění lineární části kalibrační závislosti se provádí s využitím regresní diagnostiky. Po vyhodnocení získáme přímkový regresní model Y reg = b 0 b 1 c. Metodický postup 1. Proměření kalibrace dle experimentálního plánu: i c Y 1 Y 2 Y 3 Y 4 Y 5 Y 6 Y 7 Y 8 Y 9 Y 10 1 c 1 * * * * * * * * * * 2 c 2 * 3 c 3 * * n-1 c n-1 * n c n * * * * * * * * * * 2. Testování homogenity rozptylů s 12 a s n2. 3. V části kalibrační křivky, kde je prokázána shoda rozptylů se testuje linearita nejčastěji některým z F testů. 8
Mez detekce a stanovitelnosti Mez detekce (Limit of Detection) nejnižší množství analytu ve vzorku, které jsme schopni detekovat, ale které není nutně kvantifikovatelné jako exaktní hodnota. Mez stanovitelnosti (Limit of Quanification) nejnižší množství analytu ve vzorku, které jsme schopni stanovit jako exaktní hodnotu se stanovenou přesností. K odhadu mezí lze využít několika experimentálních přístupů: Odhad na základě experimentálního vyhodnocení variability měření slepých vzorků. Opakovaně se měří signál slepého vzorku nebo vzorku s velmi malým množstvím analytu. Mez detekce je vázána ke koncentraci analytu ve vzorku, který v použitém detekčním systému vykazuje zvolený poměr signál k šumu (hodnota 2 až 5). Vyhodnocení na základě statistického testování hypotéz rizika chyby 1. a 2. druhu u regresní závislosti Mez detekce a stanovitelnosti y LOD = y blank (1,64s blank 1,64s blank 9
Mez detekce a stanovitelnosti Pro výpočet meze detekce ze směrodatné odchylky měření slepého vzorku s 0 se často používá konvence zpracovaná Kaiserem (zejména ve spektroskopických metodách): y LOD = y blank 3s blank / y LOQ = y blank 10s blank Novější koncepce (doporučení IUPAC 1995): při interpretaci měření je nežádoucí uvádět přítomnost analytu, když ve vzorku není (chyba 1. druhu) a rovněž neuvádět negativní výsledek, když vzorek analyt obsahuje (chyba 2. druhu). V normě DIN 32 645 je předpokladem pro využití kalibrační závislosti k odhadu meze detekce skutečnost, že poměr koncentrace nejvyššího bodu kalibrační přímky a kritické úrovně nepřesahuje 10! Při uvádění meze detekce metody je bezpodmínečně nutné, aby byla jasně uvedena použitá konvence pro výpočet této hodnoty!!! Kvalitativní metody: prahová koncentrace Prahová koncentrace pod ní, je pozitivní identifikace zkoušky nespolehlivá. Koncentrace [µg/g] 200 100 75 50 25 0 Počet opakování 10 10 10 10 10 10 Pozitivní/negativní 10/0 10/0 5/5 1/9 0/10 0/10 10
Odchylka bias (pravdivost) Pravdivost v laboratoři zjišťujeme: pomocí CRM nebo pomocí laboratorního etalonu, jehož referenční hodnota byla získána primární metodou, testováním výtěžnosti, Srovnáním s nezávislou (primární) metodou. Metodický postup (CRM): 1. Analýza slepého pokusu (s matricí!) a CRM opakována 10x. 2. Korekce analytického signálu CRM o hodnotu signálu slepého pokusu. 3. Výpočet obsahu (koncentrace) analytu v CRM a vyhodnocení: -2σ D x - µ 2σ D 2 2 2 slab σd = σcrm n Odchylka (pravdivost) Testování výtěžnosti (spike recovery): Výtěžnost: csp cb R = 100 [%] c sp je pozorovaná koncentrace po přídavku standardu (spike), c b je koncentrace analytu ve vzorku, c ref je skutečná koncentrace (z údajů o referenčním materiálu, změřená definitní metodou). Výtěžnost je třeba zásadně sledovat při několika koncentracích a provést několik opakování. c ref 11
Přesnost Metodický postup: Provádí se opakovaná analýza (alespoň 10x) CRM či vnitrolaboratorních etalonů při různých koncentracích analytu, obvykle následovně: 1. Stejný analytik, stejný přístroj, stejná laboratoř, krátké časové rozmezí. Výpočet směrodatné odchylky opakovatelnosti. 2. Různí analytikové, popř. různé přístroje, stejná laboratoř, různé koncentrace, dlouhé časové rozpětí. Výpočet směrodatné odchylky a zanesení do RD přesnosti vnitrolaboratorní reprodukovatelnost pro každou koncentraci. 3. Různé laboratoře v režimu mezilaboratorního testu, různé koncentrace. Vyhodnocení výsledků ANOVA pro každou koncentraci mezilaboratorní reprodukovatelnost (udaná směrodatnou odchylkou). Různé míry přesnosti 12
Robustnost Test robustnosti Yodenův test (7 parametrů) Kritické parametry měření a jejich tolerance musí být známy pro každý analytický postup (např.: ph, teplota, čistota a stáří činidel, vlhkost). V testu se zkoušejí pozměněné objemy, časy, navážky, vlivy různých šarží činidel apod. Parametry 1 2 3 4 5 6 7 8 A/a A A A A a a a a B/b B B b b B B b b C/c C c C c C c C c D/d D D d d d d D D E/e E e E e e E e E F/f F f f F F f f F G/g G g g G g G G g Výsledky měření s t u v w x y z Testování robustnosti Schéma pro test robustnosti: V A = 1/4(s t u v) 1/4(w x y z) V B = 1/4(s t w x) 1/4 (u v y z) V C = 1/4(s u w y) 1/4(t v x z) V D = 1/4(s t y z) 1/4(u v w x) V E = 1/4(s u x z) 1/4(t v w y) V F = 1/4(s v w z) 1/4(t u x y) V G = 1/4(s v x y) 1/4(t u w z) Test robustnosti spočívá v testu hypotézy H 0 : V i = 0; oproti H 1 : V i 0předpokládá, že všechny kontrasty V jsou nulové. 13
Testování robustnosti Test robustnosti spočívá v testu hypotézy H 0 : V i = 0; oproti H 1 : V i 0předpokládá, že všechny kontrasty V jsou nulové. Vypočteme-li IS kontrastu jako s L1,2 = Vi ± t(1 α / 2;7) 2 a obsahuje-li IS bod nula, potom je kontrast statisticky nevýznamný a metoda je pro daný parametr robustní. t(1-α/2;7) = 2,365 pro α = 0,05 Validované parametry u různých typů analýz Parametr Kvalitativní analýza Hlavní složky Stopová analýza Fyzikální vlastnosti Přesnost Odchylka Selektivita Robustnost Linearita / citlivost LOD LOQ 14
Plánování validace u různých typů metod Parametr Standardní metoda (ČSN) Metoda vyvinutá v laboratoři Empirická metoda Validovaná metoda s jinou matricí Přesnost Odchylka Selektivita Robustnost Linearita / citlivost ()? LOD ()? LOQ ()? VÝVOJ analytické metody VALIDACE analytické metody Zlatá pravidla validace validovat celou metodu před analýzou reálných vzorků lze provádět již při vývoji metody validovat celý rozsah koncentrací validovat v rozsahu všech uvažovaných matric (pesticidy: jablka a jahody jiná matrice) 15
Shrnutí Validace metod je nezbytná, abychom získali smysluplné výsledky. Rozsah validovaných parametrů se může lišit. Validační studii je třeba plánovat a provádět v souladu s analytickými požadavky. Vhodné způsoby validování závisí na aplikační oblasti. Pracovníci by měli rozumět jednotlivým validačním parametrům. 16