Mykotoxiny a jejich konjugáty v potravinářských surovinách a krmivech: trendy, rizika dietární expozice, možnosti prognózy osudu při zpracování

Klasifikace: Draft Pro vnitřní potřebu VVF ponovaný draft Pro vnitřní potřebu VVF Finální dokument Pro oficiální použití Deklasifikovaný dokument Pro veřejné použití Název dokumentu: Mykotoxiny a jejich konjugáty v potravinářských surovinách a krmivech: trendy, rizika dietární expozice, možnosti prognózy osudu při zpracování Poznámka: Zpracovali: Prof. Ing. Jana ajšlová, CSc. ve spolupráci s Ing. Milenou Zachariášovou, Ing. Alexandrou Malachovou, Ing. Martou Kostelanskou, Doc. Ing. Vladimírem Kocourkem CSc. a Doc. Dr. Ing. Janem Poustkou Výzkumný ústav rostlinné výroby,v.v.i., Drnovská 507, 161 06 PRAA 6 - Ruzyně Tel.: +420 233 022 324, fax.: +420 233 311 591, URL: http://www.phytosanitary.org 1

Souhrn Mikroskopické vláknité houby rodu Fusarium jsou významnými patogeny mnoha zemědělských plodin. Mezi nejčastěji se vyskytující druhy patří F. graminearum, F. culmorum. Tyto patogeny napadají vegetativních i reprodukčních orgány rostlin a způsobují jejich poškození a případně úhyn. U cereálií způsobují poškození klasů a následně zrna, u kukuřice pak poškození palic. Fusariové vláknité houby mohou způsobovat i takzvané asymptomatické infekce, jejichž důsledkem je výskyt mykotoxinů v zrnech obiloviny zdánlivě dobré jakosti. Fusariové houby produkují velké množství toxických sekundárních metabolitů, které jsou řazeny do několika skupin. Především se jedná o skupinu trichothecenů, fumonisinů a zearalenon. Kromě volných forem mykotoxinů však existují i formy vázané, většinou konjugáty se sacharidy, jež jsou výsledkem detoxifikačního procesu rostlin. Tyto mykotoxinové konjugáty jsou často označovány jako maskované, protože díky své zvýšené polaritě, unikaly běžné analytické detekci. Nejznámějším a doposud nejprobádanějším konjugátem trichothecenů je deoxynivalenol-3-glukosid, který se v obilovinách vyskytuje v koncentracích odpovídajících až 30 % koncentrace volného DN. Jeho přítomnost na relativně vysokých hladinách byla dále prokázána v mnoha produktech na bázi cereálií, zejména fermentovaných. Tato studie shrnuje nejnovější poznatky týkající se nejrozšířenějšího trichothecenového mykotoxinu deooxynivalenolu (DN) a jeho majorotní konjugované formy, deoxynivalenol-3- glukosidu (DN-3-Glc). Jsou zde ilustrovány moderní analytické metody využívané pro stanovení volných i konjugovaných mykotoxinů, které jsou založené na kapalinové chromatografii s hmotnostně spektrometricou detekcí (LC-MS), i rychlé screeningové imunochemické metody Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Studie dále ilustruje dynamiku volných i vázaných mykotoxinů v průběhu technologického zpracování potravin, konkrétně v průběhu pekárenských a sladařsko-pivovarských technologií. VŠCT PRAA 2

Summary Microscopic filamentary fungi Fusarium genera are significant pathogens of large amount of agricultural crop plants. Most widespread Fusarim species are F. graminearum and F. culmorum. Those pathogens cause plant diseases like Fusarium ead Blight (FB) of small grain cereals and or Fusarium Ear Rot (FER) of maize. Fusarium fungi can also cause so called asymptomatic infections, which means that mycotoxins occur in grains of relatively good quality. Fusarium fungi produce high amount of toxic secondary metabolites, which are divided into several groups, e.g. trichothecenes, fumonisins and zearalenon. In addition to free mycotoxins, there are some mycotoxin conjugates with sugars, which results from the plant detoxification process. Those mycotoxins conjugates are often called as masked. Their different physiochemical properties, especially enhanced polarity, caused that they escaped to routine analytical detection. The most well-known trichothecene conjugate is deoxynivalenol-3- glucoside, which occur in crops in concentrations reaching up to 30% of free DN contamination. Relatively high amounts of DN-3-Glc were documented in many cereal based product, especially fermented. This study summarizes the latest research concerning the most well known trichothecene mycotoxin - deoxynivalenol (DN) and its major conjugated form - deoxynivalenol-3-glucoside (DN-3-Glc). Modern analytical methods for mycotoxins determination are illustrated (methods based on liquid chromatography coupled to mass-spectrometry (LC-MS) and rapid screening Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)). The study further summarizes changes in free and conjugated mycotoxins content during the technological processing of foods, in particular during milling, malting and brewing technologies. VŠCT PRAA 3

bsah 1. Úvod... 5 2.... 5 3. Producenti fusariových mykotoxinů... 6 4. Fusariové mykotoxiny... 7 1.1 Trichotheceny... 7 1.2 Fumonisiny... 11 1.3 Zearalenon... 11 1.4 Maskované mykotoxiny... 12 5. Vliv primárního zpracování plodin na obsah fusariových mykotoxinů... 18 1.5 Podmínky ovlivňující předsklizňové období... 18 1.5.1 Přírodní faktory... 18 1.5.2 Podmínky ovlivňující období sklizně... 21 1.5.3 Podmínky ovlivňující posklizňové období... 21 6. Vliv sekundárního zpracování plodin na obsah fusariových mykotoxinů... 22 1.6 Čištění a třídění zrn... 23 1.6.1 Mletí... 23 1.6.2 Pekárenství... 25 1.6.3 Extrudované výrobky... 27 1.6.4 Sladařství a pivovarnictví... 28 1.6.5 Vliv sladařství a pivovarnictví na obsah fusariových mykotoxinů... 30 7. Analytické metody stanovení... 31 8. Legislativa... 35 9. Přílohy... 37 10. Závěr... 63 11. Literatura... 64 VŠCT PRAA 4

1. Úvod S rostoucí osvětou populace v oblasti výživy a jejího vlivu na lidské zdraví roste zájem o kvalitní potraviny, a to jak z nutričního hlediska, tak z hlediska jejich zdravotní nezávadnosti. V popředí zájmu o ochranu zdraví populace figuruje především snaha o prevenci před civilizačními chorobami, proto je kladen značný důraz na hygienicko-toxikologickou nezávadnost potravin a minimalizaci kontaminace potravního řetězce průmyslovými kontaminanty, těžkými kovy, pesticidy a v neposlední řadě také přírodními toxiny. Přírodní toxiny jsou látky rostlinného i živočišného původu, nacházejí se v zemědělských surovinách, v mořských plodech a rybách. Jednou z nejobávanějších skupin zmíněných toxinů jsou celosvětově rozšířené mykotoxiny, které mohou představovat vysoké zdravotní riziko pro populaci, ekonomické ztráty v zemědělství a také problémy při technologickém zpracování potravinářských surovin. Mykotoxiny jsou sekundární metabolity mikroskopických vláknitých hub a mohou být obsaženy především v obilovinách (pšenice, ječmen, žito, oves), rýži, kukuřici, olejnatých semenech a potravinách obsahujících tyto potravinářské suroviny. V klimatických podmínkách mírného pásu jsou nejrozšířenější mykotoxiny produkované vláknitými houbami rodu Fusarium fusariové mykotoxiny. VŠCT PRAA 5

2. Producenti fusariových mykotoxinů Mikroskopické vláknité houby rodu Fusarium jsou významnými patogeny mnoha zemědělských plodin. Tyto mikromycety patří mezi půdní mikroorganismy vyskytující se v oblastech Evropy, Ameriky, Asie a Austrálie s mírnými klimatickými podmínkami 1,2. ptimální podmínky pro růst těchto vláknitých hub jsou teplota 11-23ºC a vlhkost 95-100 %. Zrno obilovin může být těmito mikroskopickými vláknitými houbami napadeno během růstu rostlin či v průběhu skladování zrna v silech. K přenosu infekce na rostlinu dochází především ze zbytků rostlin, které zůstávají na poli z předcházející slizně, či z infikované setby. K šíření infekce může docházet také pomocí větru či deště 3. Mezi nejčastěji se vyskytující druhy patří F. graminearum a F. culmorum, jež jsou nejvýznamnějšími původci onemocnění obilovin zvaného Fusarium head blight (FB), jehož následkem je znehodnocení obilného zrna a možná tvorba fusariových mykotoxinů. Infikovaná zrna jsou malá, svraštělá, typicky bíle až růžově zbarvená, (br. 1, br. 2) 4. Infekce zrn fusarii mohou představovat pro člověka a hospodářská zvířata značná zdravotní rizika a má za následek i výrazné ekonomické ztráty. Tyto ztráty vznikají v důsledku znehodnocení zemědělské produkce, snížené nutriční a technologické kvality zrn 4,5. br. 1: Fusarium head blight (FB) br. 2: bilky napadené FB Mikromycety rodu Fusarium bývají označovány jako polní plísně, které poškozují zrna i jiné rostlinné tkáně v předsklizňovém období. Za příznivých podmínek však mohou růst také v průběhu skladování. K příznakům napadení fusarii souhrnně označovaných Fusarium head blight patří: Listové nekrózy na listech se objevují hnědo-šedé vodnaté skvrny. VŠCT PRAA 6

Vadnutí klasů dochází k prorůstání mycelia mikromycet z místa primární infekce do celého klasu, klasy napadené v době kvetení jsou ve zralosti sterilní bez vyvinutých obilek. Zrna jsou svraštělá bílé až narůžovělé barvy. niloby kořenů k napadení fusarii dochází hlavně v období zimy, kdy postihují nesklizené rostliny, které později přenáší infekci na zdravé rostliny. Plesnivění semenáčků vzniká při nesprávném namoření osiva 4. 3. Fusariové mykotoxiny Tvorba fusariových mykotoxinů je podmíněna řadou faktorů. Mezi nejdůležitější patří klimatické podmínky, množství srážek volba předplodiny vhodné pěstební plodiny. Fusariové mykotoxiny jsou tedy nežádoucí sekundární metabolity produkované mikroskopickými vláknitými houbami rodu Fusarium. Z důvodu značných zdravotních a ekonomických rizik jsou z této pestré skupiny mykotoxinů sledovány především trichotheceny, fumonisiny a zearalenon 6. 1.1 Trichotheceny V současné době je známo více než 150 trichothecenů. Z hlediska chemické struktury se jedná o tricyklické seskviterpeny s šestičlenným cyklem, obsahujícím dvojnou vazbu mezi uhlíky C-9 a C-10 a epoxyskupinu v poloze C-12 a C-13 (br. 3) 6. Podle typu a počtu funkčních a substitučních skupin se dělí trichotheceny do čtyř následujících skupin: typ A - nemá na C-8 oxoskupinu typ B - na C-8 je oxoskupina typ C - další epoxyskupina v poloze C-7 a C-8 nebo C-8 a C-9 typ D - makrocyklický kruh mezi C-4 a C-5 3C R2 C C 2 3 R1 CC 3 3C C 2 R3 C 3 R2 R1 Typ A Typ B br. 3: Ukázka strukturních vzorců trichothecenů typu A a B Vláknité houby rodu Fusarium produkují nejčastěji trichotheceny typu A a B, přičemž k nejvýznamnějším z nich patří deoxynivalenol, nivalenol, 15-acetyldeoxynivalenol, 3- VŠCT PRAA 7

acetyldeoxynivalenol, fusarenon-x, T-2 toxin a T-2 toxin. Funkční skupiny jednotlivých trichothecenů jsou uvedeny v Tab. 1. Jednotlivé trichotheceny produkuje celá řada mikromycet (Tab. 2). Tab. 1: Funkční skupiny nejvýznamnějších trichothecenů A a B 6 typ název mykotoxinu zkratka R1 R2 R3 A T-2 toxin T-2 CC 2 C(C 3 ) 2 - T-2 toxin T-2 CC 3 CC 2 C(C 3 ) 2 - nivalenol NIV deoxynivalenol DN CC 3 B 15-acetyldeoxynivalenol 15-ADN CC 3 3-acetydeoxynivalenol 3-ADN fusarenon-x FUS-X CC 3 Tab. 2: Mikromycety rodu Fusarium produkující jednotlivé trichotheceny 7 trichothecen druh vláknité houby NIV F.graminearum, F. equiseti, F. sambucinum, F. semitectum, F. crookwellence DN F. culmorum, F. graminearum, F. roseum, F. nivale, F. sporotrichioides 15-ADN F. graminearum 3-ADN F. graminearum, F. culmorum, F. roseum F. equiseti, F. graminearum, F. oxysporum, F. semitectum. F.sporotrichioides, F. FUS-X culmorum, F. crookwellence, F. poae,f. solani, F. nivale F. acuminatum, F. graminearum, F. poae, F.sporotrichioides, F. solani, F. T-2 sporotrichiella, F. trinictum, F. culmorum. F. sporotrichioides, F. poae, F. acuminatum, F.culmorum, F. equiseti, F. graminearum, T-2 F. oxysporum, F.semitectum, F. solani, F. tricinctum, F. nivale Mykotoxiny způsobují onemocnění souhrnně nazývána mykotoxikózy. Při expozici člověka trichotheceny dochází k napadení jater, ledvin, nervového, oběhového a endokrinního systému. Trichothecenům přítomným v zemědělských produktech je přičítána řada technologických problémů vyskytujících se v průběhu zpracování surovin na finální produkty. Při výrobě piva mohou inhibovat syntézu enzymů ve sladu a také zpomalovat růst kvasinek při kynutí těsta v průběhu výroby pečiva 4 Nejčastěji vyskytujícím se trichothecenovým mykotoxinem je deoxynivalenol (DN) neboli vomitoxin, proto bývá považován za indikátor mykotoxinové kontaminace. Chemicky je to 3α,7α,15 trihydroxy 12,13 epoxytrichothec 9 en 8 on (br. 4) 8. Běžně bývá detekován v pšenici, ječmeni a kukuřici. Nálezy však byly také prokázány v rýži, čiroku, hořčičném semenu, sojových bobech, podzemnici olejné, bramborách a slunečnici 7. DN je relativně termostabilní, degradace byla pozorována až při teplotách vyšších než 210 o C. Je stabilní v slabě kyselém prostředí, kdežto v zásaditém prostředí se rozkládá 8. VŠCT PRAA 8

3C C C 2 3 br. 4: Strukturní vzorec deoxynivalenolu V posledních dvou letech se začaly rozšiřovat i chemotypy mikromycet produkující ve velké míře další mykotoxin typu B nivalenol (NIV). Chemicky se jedná o 3α, 4β, 7α, 15- tetrahydroxy-12,13-epoxytrichothec-9-en-8-one. Poprvé byla tato látky izolována z F. nivale, což je atypický druh F. sporotrichioides. Nejčastějšími producenty NIV jsou F. cerealis, F. poae a v malém množství také F. culmorum a F. graminearum. NIV byl detekován v cereáliích, jako je ječmen, pšenice a kukuřice a také ve sladu, pivu a chlebě. Z důvodu značné polarity NIV je velice obtížné jeho stanovení multidetekčními chromatografickými metodami. Vzhledem k tomu, že pro NIV zatím neexistuje platná legislativa definující jeho nejvyšší povolená množství v potravinách, řada analytických laboratoří se jeho analýzou nezabývá. Postupně se ale NIV, vzhledem ke stoupající frekvenci svého výskytu v posledních letech, dostává do popředí zájmu odborníků. Probíhá množství toxikologických studií, na jejichž základě budou postavena legislativní opatření upravující nejvyšší povolená množství NIV v daných komoditách. 3C C 2 C 3 br. 5: Strukturní vzorec nivalenolu V současné době je v rámci EU věnována velká pozornost mykotoxinům reprezentujících skupinu trichothecenů typu A, tedy T-2 toxinu (T-2) a T-2 toxinu (T-2). T-2 je triviální název sloučeniny 4β,15-diacetoxy-3α,dihydroxy-8α-[3-methylbutyryl-oxy]-12,13- epoxytrichothec-9-en (br. 6), systematický název T-2 je 15-acetoxy-3α,4β-dihydroxy-8α-[3- methylbutyryloxy]-12,13-epoxytrichothec-9-en (br. 6). Jelikož se in vivo T-2 snadno VŠCT PRAA 9

metabolizuje na T-2 jsou tyto látky většinou stanovovány společně a jejich koncentrace je uváděna v sumě. 3C C 2 C 3 3C C 2 C 3 C 3 3 C C 3 C 3 3 C C 3 C 3 br. 6: Strukturní vzorec T-2 toxinu br. 7: Strukturní vzorec T-2 toxinu Z hlediska toxicity je T-2 nejúčinnější z trichothecenových mykotoxinů. Je významný svojí akutní toxicitou. Způsobuje onemocnění známé jako alimentární toxická aleukie, dále kožní problémy doprovázené krvácivými ložisky v oblasti hlavy a pohlavních orgánů pokusných zvířat. ba toxiny patří mezi významné kontaminanty cereálií, především ovsa, žita, pšenice a ječmene. K hlavním producentům T-2 a T-2 patří druhy plísní jako F. poae, F. sporotrichoides, F. equiseti a F. acuminatum. Jejich výskyt je v poslední době velmi často a v relativně vysokých koncentracích zaznamenáván v ovsu. Nedávné vědecké výzkumy poukázaly na důležitý jev, tzv. asymptotický výskyt těchto mykotoxinů, který se projevil v testovaných vzorcích ovsa. Jedná se o to, že u obiloviny nemusí být napadení Fusarii v průběhu vegetace vůbec pozorovatelné (na rozdíl od pšenice a ječmene), plísně se rozvíjí latentně a kontaminují jej svými sekundárními toxickými produkty. Aktuálnost popsaného problému dokumentuje celá řada studií, které jsou zaměřené na kontaminaci ovsa trichotheceny typu A indikující reálné zdravotní riziko pro časté konzumenty potravinářských komodit na jeho bázi, a to přesto, že z dietetického hlediska je oves považován za nutričně nejvyváženější ze všech druhů obilovin a jeho produkce dosahuje v Evropské unii několika milionů tun ročně. Většina laboratoří zaměřených na analýzy fusariových mykotoxinů se specializuje na DN a zearalenon (ZN), pro jejichž stanovení již byla v praxi zavedena celá řada analytických metod. Toto bohužel neplatí pro T-2 a T-2. Z důvodu zvyšujícího se výskytu těchto kontaminantů je třeba zavést metody, které by sloužily jak pro rychlý monitoring přítomnosti toxinů v zemědělských nebo potravinových komoditách, tak pro přesné a citlivé stanovení výskytu těchto dvou analytů, kterých lze dosáhnout například pomocí vysokoúčinné kapalinové VŠCT PRAA 10

chromatografie v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (PLC-MS/MS). Tato technika umožňuje stanovení širokého spektra látek v rámci jedné analýzy během relativně krátkého času, což bude využito pro multidetekční stanovení trichothecenových mykotoxinů (pro orientační stanovení řady mykotoxinů lze samozřejmě využít i imunochemické postupy jako je technika ELISA). 1.2 Fumonisiny Doposud bylo identifikováno nejméně patnáct sloučenin, které byly zařazeny do této skupiny mykotoxinů 9. Nejvýznamnější z hlediska kontaminace obilovin jsou fumonisiny B1 a B2. Jde o vysoce polární, ve vodě rozpustné diestery propan 1,2,3-trikarboxylové kyseliny s pentahydroxydimethyleikosanem, který obsahuje vázanou aminoskupinu. Jednotlivé typy fumonisinů se liší typem navázaných funkčních skupin (br. 5) 6,10. Za hlavní producenty této skupiny mykotoxinů jsou považovány Fusarium proliferatum a F. verticillioides 2,6,9,10. C 3 N C 2 3 3 C C 3 br. 8: Strukturní vzorec fumonisinu B 1 Nejvýznamnější nálezy fumonisnů byly zjištěny v kukuřici a kukuřičných produktech 11. V pšenici a ječmenu nejsou fumonisiny běžnými kontaminanty. Tyto obiloviny pravděpodobně obsahují látky, které inhibují jejich tvorbu 11. Nálezy fumonisinů byly také hlášeny v rýži a v prosu 6. Fumonisiny vyvolávají u hospodářských zvířat řadu závažných onemocnění, která mohou při vyšší intoxikaci vést ke smrti (např. mykotoxikósa koní leukoencephalomalasia) 7. U hlodavců byla prokázána hepatotoxicita a nefrotoxicita 2,9. Dle International Agency for Research on Cancer (IARC) jsou fumonisiny řazeny do skupiny pravděpodobných lidských karcinogenů 12. 1.3 Zearalenon Povahou je zearalenon (ZN) nesteroidní estrogenní mykotoxin, který je biosyntetizován různými druhy mikroskopických vláknitých hub rodu Fusarium. Mezi nejvýznamnější VŠCT PRAA 11

producenty patří F. graminearum (Gibberella zeae), F. culmorum, F. cerealis, F. equiseti, F. crookwellense a F. semitectum 13. Zearalenon (ZN) vykazuje u některých organismů silné estrogenní účinky a výsledkem je nepříznivý vliv na reprodukční systém. Chemicky se jedná o μ-lakton 6-(10-hydroxy-6-oxotrans-1-undecenyl)-β-resorcyklové kyseliny (br. 9). Triviální název zearalenon je odvozen z názvu hlavního producenta ZN Gibberella zeae, z laktonu kyseliny resorcyklové a z koncovky en, udávající dvojnou vazbu mezi C-1 a C-2 uhlíkem 13. C 3 br. 9: Strukturní vzorec zearalenonu ZN je bílá, opticky aktivní, krystalická pevná látka. Je termostabilní, k rozkladu dochází při teplotách nad 180 o C působících po dobu 30 minut. ZN je odolný také vůči hydrolýze. ZN fluoreskuje v ultrafialové oblasti a působením UV záření přechází přírodní trans-isomer na cisisomer (br. 10) 24. C 3 UV záření 3 C br. 10: Isomerace ZN 1.4 Maskované mykotoxiny První zmínky o maskovaných mykotoxinech se objevily již v polovině 80. let 20. století, kdy byly pozorovány mykotoxikosy zvířat, při kterých výsledky klinických studií zvířat neodpovídaly množství mykotoxinů stanovenému ve zkrmovaném krmivu. Neočekávaně vysoká toxicita použitého krmiva byla pravděpodobně způsobena konjugovanými formami mykotoxinů, které v tehdejší době unikaly analytickým stanovením. Konjugované formy mykotoxinů pravděpodobně vznikají při detoxikačních procesech obilovin 63, což prokázaly i následně VŠCT PRAA 12

uskutečněné studie zabývající se transformacemi mykotoxinů v rostlinách. Do dnešní doby byly identifikovány rostlinné metabolity DN, ZN a ochratoxinu A 64. Detoxikační reakce pravděpodobně chrání rostliny před toxickými látkami z okolního prostředí, ale také před sloučeninami, které rostliny tvoří samy, a zahrnují především tzv. transformace (deepoxidace, deacetylace a isomerace) a konjugace. Během těchto reakcí jsou reaktivní funkční skupiny redukovány či maskovány tak, aby se toxicita nově vzniklého produktu snížila či úplně eliminovala 64. Při konjugacích jsou volné mykotoxiny vázány na více polární látky, např. na glukosu, sulfát či glutathion a vzniklé konjugáty jsou následně ukládány do buněčných vakuol 63,66.Celý proces, který pravděpodobně probíhá v rostlinné buňce znázorňuje br. 11. První prokázané metabolické transformace mykotoxinů byly pozorovány u kukuřice infikované F. graminearum, u které bylo během růstu nejprve sledováno navýšení hladiny DN a následně její snížení, způsobené pravděpodobně aktivitou rostlinných enzymů. Následné zkoušky prokázaly nestabilitu DN během skladování, a to i při teplotách -18 C 64. Studie zabývající se metabolismem ZN v suspenzi kukuřičných buněk prokázala tvorbu zearalenonu- 4-β-D-glukopyranosidu a α a β-zearalenolu (viz br. 12, 13) 64,67. vakuola buněčná stěna polárnější látka - rozpustná ve vodě cytosol VŠCT PRAA 13

vakuola buněčná stěna cytosol FÁZE II glukosylace 3 C C 3 C 3 vakuola buněčná stěna cytosol FÁZE III produkty glykosylace VŠCT PRAA 14

buněčná stěna 3 C C 3 ABC transport? cytosol C 3 3 C C 3 C 3 vakuola FÁZE IV převedení do vakuol 3 C C 3 C 3 cytosol buněčná stěna FÁZE V zabudování do buněčné stěny br. 11: Znázornění tvorby maskovaných mykotoxinů 62 3 C C 3 C 3 vakuola VŠCT PRAA 15

C 3 C 2 br. 12: Strukturní vzorec zearalenonu-4-β-d-glukopyranosidu C 3 C 3 α- zearalenol β- zearalenol br. 13: Strukturní vzorec α a β-zearalenolu Detoxikace probíhající v zemědělských plodinách však nemusí nutně vést ke snížení rizika pro konzumenty. Biologická dostupnost a toxicita těchto látek není doposud známa. Potencionální nebezpečí maskovaných mykotoxinů spočívá v jejich hydrolýze při průchodu trávicím traktem savců, při kterém může dojít k uvolnění původního, více toxického mykotoxinu. Při pokusech na prasatech krmených krmivem kontaminovaným zearalenon-4-β-dglukopyranosidem byly zaznamenány příznaky odpovídající intoxikaci organismu volným ZN 64,67 K rozkladu konjugovaných mykotoxinů dochází pravděpodobně také za vhodných podmínek při technologickém zpracování obilného zrna. Young a kol. (1984) například prokázal téměř 100% nárůst hladiny DN při fermentačním zpracování kontaminované pšeničné mouky. Tuto skutečnost vysvětluje metabolickou přeměnou tohoto toxinu v pšenici na neznámou sloučeninu, která může být následně za vhodných podmínek přeměněna opět na původní DN 64,68. Konjugované formy mykotoxinů nejsou stále rutinně analyzovány a běžným analytickým stanovením unikají hned z několika důvodů. Kvůli své vyšší polaritě jsou při použití běžných extrakčních činidel hůře extrahovatelné, dochází k jejich ztrátám v průběhu přečištění a pro kvantitativní analýzy nebyly donedávna komerčně dostupné jejich standard 63. Jediným komerčně VŠCT PRAA 16

dostupným standardem maskovaného mykotoxinu je v současné době standard deoxynivalenol- 3-β-D-glukopyranosidu (D3G) dodávaný firmou Biopure (USA). Syntéza deseti konjugátů DN byla popsána ve studii Savard (1991). Konjugované sloučeniny zahrnovaly osm esterů mastných kyselin a dva glukosidy 66. Dall Asta a kol. (2005) a Berthiller a kol. (2005) ve svých studiích uvádí přípravu deoxynivalenol-3-β-d-glukopyranosidu a deoxynivalenol-15-glukopyranosidu 63,69. Syntéza deoxynivalenol-3-β-d-glukopyranosidu z 3,15-diacetyl-deoxynivalenolu dle Savarda (1991) je zobrazena na br. 14 66. 3 C 3,15-diacetyl-DN C 3 Ac Ac Cl/Me CdC3 Br 3 C Ac C 3 Ac 15-acetyl-DN Ac Ac Ac Ac Ac 3 C Ac Ac C 3 Ac DN-glukosid-acetát KCN/Me 3 C C 3 Ac DN-3-glukosid br. 14: Syntéza deoxynivalenol-3-β-d-glukopyranosidu První studie zabývající se monitoringem D3G v přirozeně infikované pšenici a kukuřici ukázala, že D3G byl detekován v sedmi vzorcích z osmi v koncentračním rozmezí 50 200 μg/kg. DN byl přítomen na hladinách 90 5 000 μg/kg ve všech vyšetřených vzorcích. Ve VŠCT PRAA 17

vzorcích pšenice bylo obsaženo 7% D3G z celkového množství DN a v kukuřici 10% z celkového množství DN 63. 4. Vliv primárního zpracování plodin na obsah fusariových mykotoxinů bsah mykotoxinů v zemědělských komoditách je možné ovlivnit řadou faktorů. Důležité je předcházet jejich vzniku již v průběhu pěstování obilovin na poli, tzn. zamezit napadení mikromycety. Je třeba dodržovat správné zásady při pěstování, skladování a transportu plodin. lavní faktory ovlivňující napadení fusarii ukazuje br. 15. Lokalita Pořadí plodin v jednotlivýc h letech Klimatické podmínky Fungicidy Ekologie/druh fusaria, ostatní mikroflora Enviromentální podmínky Infekce Produkce mykotoxinů Vlhkost a teplota Fyziologický stav rostliny bsah vlhkosti při žních aktivita vody ve Režim sušení kolní sušení Teplota sušícího vzduchu Typ skladovánímanagement ygiena skladování před sklizní sklizeň po sklizni br. 15: Faktory ovlivňující napadení fusarii Primární podmínky ovlivňující obsah mykotoxinů se dělí na předsklizňové, podmínky v období sklizně a posklizňové podmínky. Dnes je do zemědělské praxe zaváděn systém ACCP (azard Analysis and Critical Control Point). V rámci ACCP se určí podmínky, které je třeba kontrolovat a udržovat v určitém rozmezí po celou dobu pěstování a skladování 53. 1.5 Podmínky ovlivňující předsklizňové období 1.5.1 Přírodní faktory lavním faktorem ovlivňujícím napadení plodin fusarii a rozvoj FB jsou klimatické podmínky, které hrají velkou roli ve všech vývojových stádiích mikromycet. Vlhkost vzduchu VŠCT PRAA 18

určuje kritičnost a intenzitu nemoci. Dešťové srážky a intenzita záření mají vliv na množství inokulů (počet spor na 1 klas). Mírné teploty a vysoká vlhkost v zimním období zajistí přežití velkého množství spor v posklizňových zbytcích plodin fusaria jsou schopny sporulace, díky tomu přežijí i podmínky ne pro ně optimální. Jarní klimatické podmínky určují jaký typ a kvalitu spor budou fusaria produkovat, dobu jejich rozšíření a intenzitu napadení. Počátek kritické fáze infekce rostlin nastává tehdy, pokud se doba kvetení plodin shoduje s dobou rozšiřování spor. U propuknutí FB záleží na virulenci druhu, na rezistenci rostlin, na přítomnosti a konkurenci dalších patogenních druhů aj. V letním období dochází k prorůstání mycelia rostlinou a případné produkci mykotoxinů 4. 1.5.1.1 Polní management techniky pěstování Polní management zahrnuje tzv. správnou zemědělskou praxi (GAP), která zahrnuje střídání plodin na jednom poli, správné ošetření půdy po sklizni a před novou setbou, systém zavlažování, dobu a hustotu setí, aplikaci umělých hnojiv a použití pesticidů 4. Střídání plodin Na napadení úrody má velký vliv předplodina (plodina pěstována v minulém období). Vliv střídání plodin je stále předmětem výzkumu. K dosažení potřebného efektu je důležité časté střídání plodin, dále také znalost odolnosti (rezistence) předplodiny vůči původci mykotoxinové kontaminace, frekvence pěstování dané plodiny a množství zbytků plodin po sklizni na poli. Nejvýhodnější je zavést do cyklu střídání plodin rostliny, které nejsou vhodným substrátem pro mikroskopické vláknité houby. Cukrová řepa snižuje výskyt FB v následujícím roce o 50 %. Po vojtěšce se výskyt nemoci neprokázal. Jako čistící plodina se využívá len. Luštěniny, např. sója, se jeví také jako vhodná předplodina. Po sóji zůstává na poli jen málo odpadu a je vhodným substrátem spíše pro Fusarium sporotrichioides, tento druh obiloviny příliš nenapadá 4. Za velice nevhodnou předplodinu je považována kukuřice. Plodina pěstována v následujícím roce po kukuřici bývá více napadena fusarii a následná produkce mykotoxinů je vyšší, než po jiných předplodinách. rganických zbytků po kukuřici je značné množství a bývá napadena nejčastěji druhem Fusarium graminearum. Použití ječmene jako předplodiny dokonce zdvojnásobí množství inokulů v půdě 4. VŠCT PRAA 19

bsah DN v pšenici pěstované po sóji se sníží o 25 % oproti pšenici pěstované po pšenici a o 49 % oproti pšenici pěstované po kukuřici. Pšenice pěstována po kukuřici má obsah deoxynivalenolu šestkrát větší než stejná pšenice zaseta po jiné předplodině 4. Zpracování půdy Způsob orby má řadu přímých a nepřímých efektů na strukturu a mikroklima půdního ekosystému a tím rovněž na rozvoj mikroskopických vláknitých hub, zejména rodu Fusarium. luboká orba snižuje výskyt inokulů fusarií, zatímco plýtká orba má opačný efekt. Téměř 90 % Fusarium roseum se vyskytuje 10cm pod povrchem půdy. Rozvoj tohoto druhu fusaria závisí na přístupu kyslíku. Ačkoli se tento patogen může nacházet až 25cm pod povrchem půdy, virulentní je pouze v hloubce 5cm. Rozšíření Fusarium roseum závisí také na množství a dostupnosti rostlinného substrátu. Proto snížení množství odumřelých rostlin na povrchu půdy vede k redukci množství inokulů v půdě 4. Systém zavlažování Zavlažování pole ovlivňuje jeho mikroklimatické podmínky a může přispět k rozvoji patogenních organismů. U zavlažovaných polí je frekvence a intenzita FB větší než u nezavlažovaných polí 4. bsah minerálních látek v půdě Podíl minerálních látek na napadení fusarii je stále nejasný. Aplikace dusíkatých hnojiv podporuje růst rostlin, takže se zvětšuje hustota porostu, který udržuje určité mikroklima a tím i rozvoj různých nemocí rostlin včetně FB. Dusíkatá hnojiva významně zvyšují incidenci fusariové infekce na pšenici, ječmeni a triticale 4. Bylo prokázáno, že použití dusíkatých hnojiv snižuje výskyt nemoci v prvním roce, avšak v druhém roce toto snížení již nebylo prokázáno 4. Na druhou stranu bylo zjištěno, že úroveň výskytu FB při přítomnosti i absenci 140 kg/ha dusičnanu amonného je stejná 54. dlišné formy dusíku v umělých hnojivech mají rozdílný efekt. Močovina redukuje výskyt FB více než amoniak. Dosud nebyla vysvětlena příčina tohoto faktu, jde pouze o hypotézy. Aplikace hnojiv obsahujících fosfor má stejné účinky jako ošetření dusíkatými hnojivy 4. Použití draselných hnojiv snižuje transpiraci pomocí průduchů, a tím napomáhá ke snížení vzdušné vlhkosti. nojiva obsahující draslík podstatně snižují klíčení spor. Kromě toho vysoké hladiny draslíku podporují syntézu vysokomolekulárních látek např. celulózy, snižují dostupnost nutricientů patogenům a zvyšují mechanickou rezistenci vůči penetraci parazitů 4. VŠCT PRAA 20

Plán setby Doba setí je také součástí polního managementu, ale na možnou infekci má pouze nepřímý vliv. Setbu je potřeba naplánovat tak, aby se doba kvetení neshodovala s dobou rozšiřování spor. Ranné kultivary jsou více rezistentní vůči FB než kultivary zrající později. Trvání růstové periody u pšenice má významný pozitivní efekt: u delšího cyklu růstu byl zaznamenán nižší stupeň kontaminace. Tento efekt však nebyl pozorován u ječmene a ovsa. Pro určení optimální doby setí je důležitá oblast pěstování, klimatické podmínky a výběr plodiny. Správná kombinace těchto tří faktorů je však neustále předmětem výzkumu 4. ustota porostu Jestliže jsou inokula primárně přenášena deštěm je hustota porostu velice důležitým faktorem, který může tvořit překážku na cestě jejich rozšiřování. Vysokou hustotu porostu zajišťuje aplikace dusíkatých hnojiv, vysoká hustota setí a malé mezery mezi jednotlivými řadami rostlin. V tomto případě byly pozorovány dva protikladné efekty: zvýšení vlhkosti a tím rašení spor vytvoření překážek při vertikálním šíření spor 4 Chemické ošetření plodin Efektivnost fungicidních přípravků je různá a obtížně předpověditelná. Účinnost fungicidu závisí na typu fungicidu, přesné dávce, době aplikace, klimatických podmínkách a fyziologickém stavu rostliny. 1.5.2 Podmínky ovlivňující období sklizně V průběhu sklizně je velmi důležitým faktorem vlhkost. Dostupná voda je limitujícím faktorem pro život fusarií. Aktivita vody vyšší než 0,65 je dostačující k udržení jejich metabolismu. Udává se, že vlhkost zrna okolo 15 % postačuje k přežití. Proto jsou kombajny vybaveny vlhkostním analyzérem, který spouští vzdušnou regulaci, při překročení určité vlhkosti 11. Dále je třeba zamezit kontaktu zdravé obiloviny s půdou, kde se nacházejí spory mikroorganismů, z toho důvodu se u kombajnů nastavuje výška sečení 11. 1.5.3 Podmínky ovlivňující posklizňové období Po sklizni je důležité oddělení scvrklých a jinak narušených zrn od zdravým, aby se eliminovala možnost přenesení mikroskopických vláknitých hub na zdravou úrodu. V některých případech je úroda ponechána po sklizni nějakou dobu na poli ve sběrných nádobách, což VŠCT PRAA 21

zvyšuje pravděpodobnost kontaminace mykotoxiny. Při skladování je důležitý vhodný systém sušení a provzdušňování zrn (br. 16) 11. Mokrá zrna Sušící se zrna Suchá zrna vhánění vzduchu br. 16: Schéma sušení zrn v silech při provzdušňování Kromě vlhkosti je potřeba také při skladování udržovat stejnou teplotu jako během sklizně v centru sila. Samotná zrna jsou dobrým izolátorem. Zrna nacházející se poblíž stěny sila chladnou rychleji než zrna v jeho centru, což způsobuje klesající teplotu uvnitř sila. Mokrá zrna tak mohou být dobrým substrátem pro mikroorganismy. Proto je nezbytné při skladování kombinovat chladící a sušící operace spojené s provzdušňováním. Při skladování hraje hmyz velkou roli, protože narušuje vnější obaly zrn, a tím se stávají náchylnějšími vůči mikroorganismům. V průběhu skladování se aplikují některé ochranné chemické prostředky. Řada studií ukazuje, že použití antioxidantů jako jsou butylhydroxyanisol (BA), parabeny, skořicová silice nebo resveratol snižuje akumulaci DN a NIV až o 90 % 53. 5. Vliv sekundárního zpracování plodin na obsah fusariových mykotoxinů Tvorbě mykotoxinů v zemědělských produktech nelze v průběhu pěstování zcela zabránit, proto je snaha o snižování jejich obsahu v průběhu technologických zpracování, aby výsledná expozice člověka byla minimální 55. VŠCT PRAA 22

1.6 Čištění a třídění zrn biloviny určené k lidské výživě je třeba před dalším zpracováním očistit. Čištěním se odstraní sláma, prach a také poškozená zrna. Jednotlivé operace třídícího procesu jsou založeny na několika fyzikálních principech rozměrové třídění na sítech a triérech, aerodynamické třídění, třídění na základě rozdílné hustoty zrna a nečistot. K třídění se používá např. odkaménkovač. Tento stroj odděluje od sebe částice přibližně stejné velikosti jako obilné zrno, ale rozdílnou hustotou. K odstranění zrn stejné hmotnosti a hustoty jako obilné zrno, ale odlišného tvaru slouží soustava strojů nazývaných triéry. Dalším krokem je kartáčování a loupání 56. Po vytřídění hrubě kontaminovaných zrn se snížil obsah DN o 74 %. Mnohá kontaminovaná zrna jsou téměř k nerozeznání od zdravých zrn, takže rutinními třídícími operacemi dochází pouze k 20 % snížení obsahu trichothecenů 57. Čištění nemá téměř žádný vliv na snížení hladiny DN v cereáliích. U ZN byl pozorován úbytek přibližně o 30 % 55. 1.6.1 Mletí Mletí je složitým procesem řady základních technologických uzlů označovaných jako mlecí chody neboli pasáže, které sestávají z drcení a následného třídění rozemletého produktu. Technologie mletí se podle provedení dělí do dvou kategorií suché mletí a mokré mletí 56. 1.6.1.1 Složení obilného zrna bilné zrno se skládá ze tří základních částí: obalových vrstev klíčku endospermu balové vrstvy chrání obilku před vnějšími vlivy, v mlýnské technologii se nazývají otruby. Jsou složeny z nerozpustných sacharidů typu celulosy s velkou mechanickou pevností. Z hlediska pekárenské technologie mají tyto složky negativní účinek na kvalitu a zpracovatelnost těsta. Klíček je vlastním zárodkem nové rostliny a nositelem genetických informací. Při mlýnském zpracování je oddělován. Endosperm (vnitřní obsah zrna) představuje největší podíl zrna a je technologicky nejvýznamnější částí. Pšeničná mouka je čistý rozdrcený endosperm, kdežto do žitné mouky se VŠCT PRAA 23

dostává více obalových vrstev. Až tři čtvrtiny endospermu tvoří škrob. Na kvalitu pekařského těsta mají vliv také bílkoviny, které tvoří přibližně 10 % endospermu 56. 1.6.1.2 Suché mletí Při mletí dochází k dezintegraci materiálu a následným roztříděním rozemletého produktu. Proces mletí pšenice dělíme do tří základních etap: šrotování luštění krupic vymílání Při šrotování dochází k šetrnému otevření zrna, k oddělení endospermu od obalových vrstev v hrubších částicích (krupice). Luštění krupic zahrnuje drcení vytříděných a vyčištěných krupic. Vymílací částí procesu se drtí částice čistého endospermu na požadovanou granulaci. Mletím se získají čtyři druhy produktů: mouka, klíčky, otruby a krmný šrot. Mnoho studií ukázalo, že největší koncentrace trichothecenů byly nalezeny v otrubách a krmném šrotu, nižší koncentrace byly ve vymleté mouce. Distribuce DN v jednotlivých frakcích získaných mletím závisí na stupni penetrace fusarií do endospermu. Jestliže je penetrace nízká, můžeme nalézt vysoké koncentrace DN na povrchu zrna v otrubách a snížený obsah ve finální pšeničné mouce. Pšeničná mouka obsahuje poloviční množství, zatímco otruby dvakrát větší množství DN než původní zrno. Distribuci DN v jednotlivých frakcích získaných při mletí ukazuje Tab. 3 57. Tab. 3: Distribuce DN v jednotlivých produktech získaných mletím produkt obsah µg/kg pšenice 1928 mouka 994 otruby 4680 lepek 293 1.6.1.3 Mokré mletí Technologie mokrého mletí se využívá při zpracování kukuřice, kde hlavními produkty jsou kukuřičná krupice a glukosový sirup. Trichotheceny jsou rozpustné ve vodě a proto přecházejí do vodné frakce a částečně do škrobové frakce. Např. T-2 přechází do vody ze 66 %. Do frakce obsahující škrob přechází mykotoxiny vzájemnou kontaminaci s vodní frakcí. DN přechází do škrobové frakce ze 30 %. Distribuce DN v jednotlivých frakcích získaných při mletí kukuřice je znázorněna na br. 17 57. pačná situace je u relativně nepolárního ZN, kdy nejnižší koncentrace se nacházejí ve vodné části a nejvyšší v pevné frakci. VŠCT PRAA 24

60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% škrob máčená kukuřice lepek klíčky br. 17: Distribuce DN v jednotlivých frakcích získaných při mletí kukuřice 1.6.2 Pekárenství Jednou z charakteristik výroby pečiva je postup nakypření těsta za účelem vytvoření struktury charakteru tuhé pěny, která umožňuje poživatelnost výrobků. K nakypření se používá tří způsobů: biologického fermentace vyvolaná kvasinkami Saccharomyces cerevisiae chemického použití kypřících prášků mechanického nebo termického šlehání, expandování za vysokého přetlaku atd. 56 Celkové technologické postupy mají velmi podobné schéma, ale detailní podmínky postupu se v jednotlivých zemích zásadně liší (např. intenzita hnětení, podmínky fermentace, použití aditivních látek), což se samozřejmě projevuje v tom, že řada studií sledujících vliv těchto technologií na obsah mykotoxinů uvádí značně rozdílné výsledky 57. V této oblasti byla provedena řada studií, které měly velice rozdílné výsledky (Tab. 4). VŠCT PRAA 25

Tab. 4: Shrnutí studií zabývajících se vlivem pečení na obsah DN ve finálních produktech studie Egyptský chléb (El-Banna, 1983) Kanada: pečení chleba (Scott, 1983, 1984) Kanada: pečení bez použití kvasinek (Young, 1984) počáteční koncentrace DN a zdroje 2000 μg/kg (spike) 3300 μg/kg (přírodní) přírodně kontaminované 4100 μg/kg 1000 6800 μg/kg mouka na sušenky 330 μg/kg mouka na koláče 290 μg/kg podmínky zpracování - fermentace 75 min - pečení 350 C, 2 min - fermentace 80 min - pečení 205 C, 30 min koblihy koláč sušenky US (Seitz, 1986) 220 3200 μg/kg - fermentace 30 C, 1,5 2h % zbylého DN, mouka=100% 115 102 107 42 61 66 53-64 (220 μg/kg) US (Boyaciouglu, 1993) 2900 μg/kg - fermentace 30 C, 3h - pečení 220 C, 20 min 93 (bez aditiv) Argentina: (Neira,1997;Samar,2001) 1370 μg/kg 15000 μg/kg - fermentace 25 C, 5-11h - fermentace 30 50 C, 1,5 2h 78,4 44 (Vídeňský chléb) 59 (Francouzský chléb) Ve studii J. C. Younga byl pozorován vliv kvasinek na obsah DN. Prokázalo se, že u finálních produktů vyráběných z těst obsahujících kvasinky se zvýšila hladina DN 57. Tento jev je přičítán enzymatické konverzi jeho prekurzorů. Řada jiných vědeckých prací naopak tvrdí, že při fermentaci dochází až k 40 % snížení hladiny DN 57. Pozorováním účinků aditivních látek na obsah DN, bylo zjištěno, že kyselina askorbová a bromid draselný nemá na obsah DN žádný vliv, kdežto přídavek cysteinu nebo fosforečnanu amonného snižuje jeho obsah až o 40 % 55. Výskyt mykotoxinů v pečivu závisí na kvalitě surovin a použité technologii. V Argentině byl sledován výskyt DN v pšeničném chlebě a sladkém pečivu, Kanadě v pšeničných výrobcích, v USA byly kontrolovány hladiny DN v pšeničných a ovesných VŠCT PRAA 26

výrobcích. V Německu byla studie zaměřena na pečivo vyrobené v pekárnách supermarketů. Výsledky výzkumu shrnuje Tab. 5 58. Tab. 5: ladiny DN nalezeny v pekařských výrobcích stát % kontaminovaných vzorků hladina DN μg/kg Argentina 92,8 200-2800 Kanada 43 9-4060 USA 1600-5400 Německo 92 neuvedeno Jiná studie výskytu trichothecenů v pečivu byla provedena v Německu v okolí Stutgartu. Vzorky byly odebrány z pečiva (různých druhů chlebů) lokálních pekařských podniků. Cílem výzkumu bylo rovněž porovnání výskytu trichotecenů v jednotlivých typech chlebů vyrobených ze surovin produkovaných konvenčním zemědělstvím a z biosurovin (Tab. 6) 58. bsah DN v základních surovinách produkovaných konvenčním a bio-zemědělstvím se téměř neliší, tudíž rozdíly hladin DN v konvenčním chlebě a biochlebě jsou dány odlišnou technologií výroby. Při výrobě bio-chleba se nepoužívají aditivní látky 13. Tab. 6:Porovnání hladin DN konvenčního a bio-chlebu typ chleba % pozitivních hladina DN μg/kg nálezů rýžový chléb 1 konvenční chléb 80 59 bio-chléb 75 18 míchaný rýžový 2 konvenční chléb 100 155 bio-chléb 86 71 míchaný pšeničný 3 konvenční chléb 96 280 bio-chléb 75 47 pšeničný chléb 4 konvenční chléb 100 167 bio-chléb 100 116 1 obsahuje > 90% rýže 2 obsahuje 51-89% rýže 3 obsahuje 50-89% pšenice 4 obsahuje > 90% pšenice 1.6.3 Extrudované výrobky Extruzí se získávají různé polotovary na obilném základě, které se dále upravují smažením nebo jiným způsobem na finální produkty. Je to složitý proces, při kterém se syrový materiál za vysokých tlaků a teplot stlačuje a jinak upravuje. Touto technologií se vyrábí cereální snídaně, lahůdky, snacky a krmivo pro psy a kočky 56. VŠCT PRAA 27

Ačkoliv vysoká teplota a tlak může značně degradovat mykotoxiny, jejich efekt na snížení kontaminace je minimální, doba extruze je příliš krátká 55. Práce C. E. Wolf-alla demonstrovala na vzorcích extrudovaných výrobků s přídavkem DN jeho inertnost vůči působení vyšších teplot a tlaku. V páře autoklávu došlo k redukci DN o 12 % 57. U ZN došlo k redukci o 65-85 %, ztráty byly vyšší při teplotě 120 o C než při 180 o C 55. 1.6.4 Sladařství a pivovarnictví 1.6.4.1 Výroba sladu Pro výrobu sladu jsou základními surovinami ječmen a voda. Na základě technologických zkoušek a hospodářských výsledků jsou u nás pěstovány především odrůdy jarních sladovnických ječmenů Akcent, Amulet, Kompakt, Krona a lbram. Cílem sladování je vyrobit řízeným procesem klíčení a hvozdění z ječmene slad, obsahující potřebné enzymy, barviva a aromatické látky nezbytné pro výrobu určeného druhu piva. Schéma výroby sladu znázorňuje br. 18 59. Příjem, čištění a skladování ječmene Máčení ječmene Klíčení ječmene vozdění zeleného sladu dklíčení, leštění, balení, expedice sladu br. 18: Schéma výroby sladu VŠCT PRAA 28

Při příjmu se ječmen třídí podle odrůdy a jakosti. dstraňují se také mechanické nečistoty. Vyčištěný a vytříděný ječmen se skladuje v silech. Sila jsou vybavena pneumatickou dopravou, provzdušňovacím zařízením, popř. zařízením na ničení škůdců 59. Cílem máčení je zvýšení obsahu vody v ječném zrnu z 12-15 % na 42-48 %. Dosažení obsahu vegetační vody je nezbytné pro enzymové pochody zajišťující optimální průběh sladařského klíčení. Dosažený obsah vody v namočeném ječmeni se nazývá stupeň domočení a liší se podle typu vyráběného sladu 59. Klíčením se aktivují enzymy a dosáhne se požadovaného stupně rozluštění modelováním podmínek přirozeného klíčení vhodnou teplotou, vláhou a přístupem kyslíku. Řízení klíčení ječmene ve sladovně se nazývá vedení hromad, liší se podle druhu vyráběného sladu a kvality zpracovávaného ječmene. Konečným produktem klíčení je zelený slad, který se dále zpracovává hvozděním 59. vozděním se snižuje obsah vody pod 4 %, čímž se zastaví vegetační pochody při zachování požadované enzymové aktivity a vytvoření chuťových, barevných a oxidoredukčních látek tvořících charakter sladu 59. 1.6.4.2 Výroba piva Pivovarnictví je potravinářské průmyslové odvětví zabývající se výrobou piva, která se dělí do tří výrobních úseků (br. 19), zahrnujících řadu složitých mechanických, fyzikálně-chemických a biochemických procesů. Výroba mladiny Kvašení mladiny a dokvašování mladého piva Závěrečné úpravy a stáčení zralého piva br. 19: Schéma výroby piva Výroba mladiny sestává z následujících technologických operací: šrotování sladu vystírání sladového šrotu do vody rmutování VŠCT PRAA 29

scezování sladiny a vyslazování sladového mláta chmelovaru a závěrečných úprav mladiny Tyto operace probíhají při různých teplotách v rozmezí 35-78 o C, při nichž dochází mnoha enzymovým reakcím včetně rozkladu škrobu na monosacharidy. Pro kvašení mladiny se používají svrchní pivovarské kvasinky (Saccharomyces cerevisie) kvasící při teplotách 24 o C nebo spodní pivovarské kvasinky (Saccharomyces cerevisie var. uvarum) při teplotách kvašení 6-12 o C. Kvašení trvá většinou 6-10 dní, přičemž závisí na druhu piva. Dokvašování a zrání mladého piva probíhá v ležáckém sklepě, kdy pivo při teplotách 1-3 o C pozvolna dokvašuje, čiří se, zraje a sytí pod tlakem oxidu uhličitého v uzavřených ležáckých tancích. Doba ležení je závislá na typu piva. U běžných piv, u kterých nepřesahuje koncentrace ethanolu 10% bývá 3 týdny, pro speciální exportní piva se zvyšuje až na několik měsíců 59. Po dokvašení se pivo zbavuje zbytků mikroorganismů filtrací, pasteruje se při 62 o C a stáčí do cisteren, sudů, lahví nebo plechovek 59. 1.6.5 Vliv sladařství a pivovarnictví na obsah fusariových mykotoxinů Změny obsahu mykotoxinů v jednotlivých krocích sladování a kvašení piva jsou shrnuty v Tab. 7 a Tab. 8 57. U ZN došlo v průběhu kvašení k metabolické přeměně na α-zea a β-zea 55. Vliv sladařství a pivovarnictví na obsah mykotoxinů je předmětem výzkumu a v této oblasti se dosahuje stále nových poznatků. Tab. 7: Změny obsahu trichothecenů při sladování tech. operace změna obsahu trichthecenů příčina máčení snížení obsahu DN vyluhování ve vodě klíčení zvýšení obsahu DN podmínky klíčení mohou podnítit růst fusarií a produkci toxinů VŠCT PRAA 30

Tab. 8: Změny obsahu trichothecenů při vaření piva tech. operace změna obsahu trichthecenů příčina enzymatické uvolnění vázaného DN z rmutování 4 x zvýšení hladiny DN proteinů na přítomnost TT má vliv varianta použitých kvasinek. V prvních 20 hod. se hladina DN zvýšení způsobil vznik DN z metabolických zvýšila, potom následovalo fermentace snížení prekursorů,snížení je přičítáno degradací DN kvasinkami nebo jeho navázání na kvasinky TT - trichotheceny ladiny DN v pivu se v jednotlivých zemích pohybují v různém rozmezí (Tab. 9). Největší nálezy DN byly objeveny v německém pivu 60. Tab. 9:ladiny DN v pivu ve vybraných státech stát celkový počet analyzovaných vzorků kontaminované vzorky hladina DN μg/kg Nizozemí 51 3 26-41 Kanada 50 29 0,3-50,3 Německo 569 Korea 54 14 neuvedeno 6. Analytické metody stanovení Maskované formy mykotoxinů jsou polárnější než jejich volné prekurzory a nejsou pro ně komerčně dostupné analytické standardy. Z těchto důvodů unikají rutinní analytické kontrole. Výjimkou je D3G, jehož standard je v současné době již běžně komerčně dostupný s a proto je jediným maskovaným mykotoxinem, který lze rutinně analyzovat spolu s volnými mykotoxiny multidetekčními analytickými metodami. Na Ústavu chemie a analýzy potravin Vysoké školy chemicko-technologické v Praze byla vyvinuta a validována analytická metoda pro stanovení mykotoxinů v cereáliích, která byla akreditována Českým institutem pro akreditaci (ČIA) dle IS 17025. Používaná analytická metoda spočívá v extrakci homogenizovaného vzorku směsí acetonitril:voda (84:16,v/v) po dobu 1 hodiny na třepačce, následuje fitrace, přečištění vzorku přes SPE kolonku MycoSep 226. SPE je hojně používaná čistící technika využívající obchodně dostupné kolonky či náplně na jedno použití. Je to rychlá metoda, která nahrazuje kolonovou chromatografii a extrakci kapaliny kapalinou (LLE). dstranění VŠCT PRAA 31

filtry. 61 Po přečištění jsou 4ml alikvotu odpařeny na rotační vakuové odparce. dparek je nečistot ze vzorku trvá přibližně 10 sekund. Multifunkční filtr tvoří náplň kolonky obsahující ve vrstvách aktivní uhlí, iontoměniče, křemelinu a oxid hlinitý mezi dvěma rozpuštěn v 2krát 500μl směsi methanol:voda (50:50,v/v). Identifikace a kvantifikace je prováděna pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií typu iontová past. Schéma analytické metody shrnuje br. 20. Pro účely analýzy maskovaného mykotoxinu D3G je však v krok přečištění přes SPE kolonku MycoSep 226 vynechán z důvodu jeho nízké výtěžnosti způsobené jeho afinitou k sorbetu kolonky. EXTRAKCE acetonitril:voda (84:16,v/v) PŘEČIŠTĚNÍ EXTRAKTU SPE kolonky MycoSep 226 PŘEVEDENÍ D MBILNÍ FÁZE methanol:voda (50:50,v/v) IDENTIFIKACE A KVANTIFIKACE LC-MS/MS br. 20: Schéma akreditované analytické metody pro stanovení mykotoxinů v cereáliích Při stanovení mykotoxinů v pivu bylo využito přečištění pomocí celitu, který D3G nesorbuje (viz br. 21). VŠCT PRAA 32

EXTRAKCE acetonitril+celit PŘEVEDENÍ D MBILNÍ FÁZE methanol:voda (50:50,v/v) IDENTIFIKACE A KVANTIFIKACE LC-MS/MS br. 21: Schéma analytické metody pro stanovení mykotoxinů v pivu Velmi užitečnou technikou pro přečištění vzorků při stanovení mykotoxinu je imunoafinitní chromatografie, která zaručuje rychlé přečištění vzorku založené na specifické interakci mykotoxinu s protilátkou navázanou na organickém nosiči, následném promytí nečistot a eluci mykotoxinu. Mykotoxiny jsou obvykle eluovány methanolem nebo acetonitrilem. V současné době jsou komerčně dostupné kolonky pouze pro některé fusariotoxiny (DN, T-2, ZN) a každá kolonky je určena k separaci jediného mykotoxinu. Imunoafinitní kolonky Donprep však umožňují vedle DN (pro který jsou určeny) také stanovení D3G. bsažené protilátky totiž s maskovaným mykotoxinem D3G křížově reagují. Použití těchto kolonek umožňuje tedy dokonalé odstranění matrice a zároveň zakoncentrování DN a D3G ve vzorku. Na br. 22 a 23 jsou uvedeny ukázky chromatogramu směsného standardu mykotoxinů LC-MS/MS metody. VŠCT PRAA 33