ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra speciální zootechniky

ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra speciální zootechniky Zvýšení obsahu zdraví prospěšných polynenasycených mastných kyselin v mléce koz zkrmováním mikrořas UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA Autoři: doc. Ing. Milena Fantová CSc. Ing. Klára Michnová-Novotná Ing. Lenka Nohejlová Dedikace: Uplatněná certifikovaná metodika byla zpracována v rámci řešení grantového úkolu MZe NAZV č. QJ1310107 - Vliv genetického polymorfizmu lipogenických enzymů na složení mléčného tuku a obsah mastných kyselin v mléce malých přežvýkavců (kozy a ovce). (Borková Markéta, Ing. Ph.D. Elich Ondřej, Ing., Kyselová Jitka, Ing. Ph.D., Lisová Ivana, Ing., Malá Gabriela, Ing. Ph.D., Milerski Michal, Ing. Ph.D., Rychtářová Jana, Ing. Ph.D., Sztankóová Zuzana, Ing. Ph.D.) 2017 1

Autorský kolektiv: doc. Ing. Milena Fantová CSc. Ing. Klára Michnová-Novotná Ing. Lenka Nohejlová ČZU v Praze, FAPPZ, Katedra speciální zootechniky, Kamýcká 129, 165 00 Praha 6 Suchdol Dedikace výsledků typu N Uplatněná certifikovaná metodika byla zpracována v rámci řešení grantového úkolu MZe NAZV č. QJ1310107. Určení publikace: Publikace je určena pracovníkům v oblasti chovu malých přežvýkavců. Mezi cílové skupiny lze zařadit chovatele, pracovníky výživářských firem, Svaz chovatelů ovcí a koz, podnikatele na úseku chovu malých přežvýkavců, kteří se zaměřují na produkci mléka a mléčných výrobků. Uplatněná certifikovaná metodika byla Ministerstvem zemědělství schválena dne 25. 4. 2017 pod č. 17210/2017-1. Oponenti: Ing. Alena Ježková, CSc. Profi press s.r.o., Jana Masaryka 2559, 120 00 Praha 2 Ing. Pavel Hakl MZe, odbor živočišných komodit 17210, Těšnov 17, 117 05 Praha 1 2

Obsah I. CÍL METODIKY... 1 II. VLASTNÍ POPIS METODIKY... 1 1. Úvod... 1 1.1. Mléčný tuk... 2 1.2. Mastné kyseliny... 4 1.3. Trávicí systém přežvýkavců... 8 1.4. Vliv aditiv na složení mléčného tuku... 9 1.5. Řasy... 9 2. Metodika... 21 3. Výsledky... 22 4. Závěr... 28 III. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPU... 29 IV. POPIS UPLATNĚNÍ METODIKY... 29 V. EKONOMICKÉ ASPEKTY... 29 VI. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 30 VII. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE... 35 VIII. DEDIKACE... 36 3

I. CÍL METODIKY Cílem této práce je doporučit zásady výživy a krmení dojných koz, které ovlivňují množství a kvalitu mléčného tuku. Tato práce je zaměřena v první řadě na výběr vhodných aditiv, zejména řas, které by přidáním do krmné dávky dojným kozám ovlivnily profil mastných kyselin v mléce. Navýšením prospěšných mastných kyselin, zejména omega-3, v kozím mléce by byla vytvořena tzv. funkční potravina. Takto obohacené kozí mléko by v plné míře nahradilo konzumaci různých syntetických doplňků stravy. II. VLASTNÍ POPIS METODIKY 1. Úvod V dnešní době vzrůstá obliba ekologického zemědělství, produkce ekologických výrobků a biopotravin. Tento zájem konzumentů ovlivnil i chov koz, který v posledních letech celosvětově nabývá na významu. V roce 2016 se v České republice počet koz zvýšil na 26 548 koz oproti 21 709 ks v roce 2010. Na většině farem se kozy chovají v menších stádech, jejich chov je zaměřen na výrobu mléčných výrobků a to především sýrů. Mléko je ve výživě lidí zdrojem nepostradatelných nutričních látek. Produkce kozího mléka je dynamické a rostoucí odvětví, které má zásadní význam pro stovky milionů lidí po celém světě, je důležitou součástí ekonomiky v mnoha zemích (Silianikove et al., 2010). Významnou předností kozího mléka je mléčný tuk, který se vyznačuje lepší stravitelností, také je bohatý na obsah nižších nasycených mastných kyselin (MK) kyselina kapronová, kaprylová a kaprinová, které ovlivňují výrobu i zpracování mléka a zároveň způsobují specifické aroma kozího mléka a mléčných výrobků. Z nutričního hlediska jsou považovány za velmi prospěšné. Zdraví prospěšné polynenasycené MK jsou v mléce obsažené v poměrně nízkém množství, avšak omega-3 polynenasycené MK, jako jsou kyselina eikosapentaenová a docosahexaenová, jsou nepostradatelné zejména pro vývoj mozku a očí dětí a pro kardiovaskulární systém u dospělých. Výživa zvířat je jedním z nejvýznamnějších faktorů, jak lze docílit změn v profilu mastných kyselin v mléce pro jejich navýšení. Schopnost měnit složení mléčného tuku 1

představuje možnost rozvoje a produkce nových mléčných produktů. Pokud jsou tyto omega- 3 MK inkorporovány do potravního řetězce, je možné produkovat potraviny obohacené o tyto zdraví prospěšné látky. Mnoho prací se zabývalo navýšením obsahu těchto zdraví prospěšných MK v mléce, avšak většina z nich je zaměřená na mléko kravské. Pro tuto práci byly vybrány dva druhy řas jako zdroj nutričně cenných lipidů s vysokým obsahem polyenových MK, a to zejména omega-3 a omega-6 MK. První vybranou řasou je zelená sladkovodní řasa Chlorella vulgaris. Tato řasa byla vybrána z důvodu snadné dostupnosti a byla již ověřována ve výživě monogastrů. Jako druhá byla do pokusu vybrána mikrořasa Japonochytrium sp., jedná se o nový produkční kmen mikrořasy, obsahující ve své biomase vysoké množství nutričně a farmaceuticky cenných omega-3 MK. 1.1. Mléčný tuk Mléčný tuk je obsažen v mléce všech savců, patří mezi nejdůležitější složky mléka a to ze tří hledisek: z výživového, ekonomického a především z hlediska fyzikálních a senzorických vlastností mléka. Je to jedna z nejvýznamnějších živin, kterou lidský organismus potřebuje pro zdravý vývoj. Tuky patří mezi energetické živiny, jsou energeticky nejbohatší složkou mléka. Z 1g tuku se uvolní metabolickou přeměnou 38,94 kj energie. Mléčný tuk se syntetizuje zejména z kyseliny octové a kyseliny máselné, tyto kyseliny mají rozhodující vliv, v rámci látkové přeměny, na množství vytvořeného mléčného tuku, a tím na celkovou tučnost mléka. Na tučnosti mléka se podílí i některé hormony. Vyšší aktivita štítné žlázy ovlivňuje tvorbu a využití kyseliny octové a máselné. Při nedostatku hormonů štítné žlázy (tyroxin, tyrokalcitonin) dochází k poklesu dojivosti a především tučnosti mléka (Collier et al., 2012). 1.1.1. Složení mléčného tuku Tuky se dělí podle chemického složení na homolipidy a heterolipidy. Homolipidy jsou jednoduché lipidy, jsou to estery MK a alkoholů (oleje, tuky, ceridy, steridy). Heterolipidy jsou složené lipidy, obsahující MK, alkoholy a další sloučeniny obsahující N, P, S a sacharidy (fosfolipidy, cerebrosidy, sulfamidy). Mléčný tuk je složený především z homolipidů. z 98 % z triacylglycerolu (TAG). Dále je mléčný tuk tvořen z diacylglycerolu, glycerolu, fosfolipidů, cholesterolu a volných mastných 2

kyselin (VMK). Nejvýznamnějšími lipidy v mléce jsou fosfolipidy (0,8 %). Hlavními zástupci fosfolipidů jsou fosfatidylcholin (20-38 %), fosfatidylethanolamin (35-40 %), sfingomyelin (19-24 %). Množství fosfolipidů v mléce a mléčných výrobcích se mění v závislosti na množství mléčného tuku. Další mléčné tuky jsou steroly, jako je cholesterol, ergosterol, tokoferol (Smolenski et al., 2007). Složení mléčného tuku a především zastoupení jednotlivých MK v mléce přežvýkavců je velmi variabilní, může se měnit v závislosti na krmném režimu, zkrmování krmných aditiv, zdravotním stavu, podmínkách ustájení apod. (Swasigood, 1995; Park et al., 2007b). Z nutričního hlediska je významný obsah a transport doprovodných biologicky významných látek v mléčném tuku např. vitamínů rozpustných v tucích (A, D, E, K), fosfolipidů, sterolů, antioxidantů a karotenoidů. Mléčný tuk kozího mléka má na rozdíl od kravského bílou barvu, která je způsobena prakticky nulovým obsahem karotenoidů, které plní v organismu funkci provitamínů A (Collier et al., 2012). 1.1.2. Tukové kuličky Většina mléčného tuku je uspořádána do tukových kuliček, menší část je vázána na kaseinových micelách. V 1 ml mléka se vyskytuje 2-6 miliard tukových kuliček. Jejich velikost se pohybuje v rozmezí 0,1-15 μm, skládají se z povrchové vrstvy a jádra. Povrchová vrstva neboli membrána (MFGM) představuje jedinečný biofyzikální systém. MGMF má složitou strukturu, je tvořená proteiny, glykoproteiny, fosfolipidy, triglyceridy, cholesteroly, enzymy a dalšími minoritními látkami. Až 58 % fosfolipidů z jejich celkového množství je přítomno v membráně tukových kuliček, tím stabilizují tukovou emulzi. Uvnitř tukové kuličky je tekuté jádro tvořené z 98 % nepolárními triacylglyceroly. Jádro je tvořeno z TAG různých mastných kyselin, kterých bylo identifikováno několik set. Avšak pouze 15 se jich vyskytuje v TAG ve větším množství (Kindsedt, 2005; Gallier et al., 2012). Velikost tukových kuliček se druhově liší, nejmenší se vyskytují u ovčího mléka, poté u kozího s přibližnou velikostí 2,76 µm (od 0,73 do 8,58 µm), největší se nachází u kravského mléka, kde se jejich velikost pohybuje v rozmezí 0,92 až 15,75 µm. Menší velikost tukových kuliček způsobuje lepší stravitelnost kozího mléka a jemnější texturu mléčných výrobků (Silianikove et al., 2010; Szmatola et al., 2013). 3

1.1.3. Množství mléčného tuku Množství mléčného tuku kolísá v závislosti na druhu zvířat v poměrně širokém rozmezí (tabulka č. 1). Podle množství tuku v mléce lze určit kvalitu výživy, zdraví, hygienu a správnost dojení a uchovávání mléka (Smolenski et al., 2007; Gallier et al, 2012). V kozím mléce se množství tuku pohybuje v průměru okolo 3,8 % (Chilliard et al., 2003; Park et al., 2007b). Podle Szmatola et al. (2013) se kozí mléko vyznačuje celkově nižší hladinou cholesterolu (16,90 18,09 mg/100 g), než mléko kravské (25,60 31,40 mg/100 g). Cholesterol se v mléce vyskytuje především v membráně tukových kapének. Tab. č.1: Složení mléka (%) kozí mléko kravské mléko ovčí mléko mateřské mléko sušina 13,2 12,3 18,2 12,4 tuk 4,5 3,4 7,1 3,8 celkové bílkoviny 3,6 3,2 5,7 1,2 - kasein 2,9 2,5 4,6 0,4 - syrovátkové bílkoviny 0,61 0,65 1,08 0,7 laktóza 4,6 4,6 4,6 7 minerální látky 0,8 0,7 0,9 0,2 Zdroj: Bernacka, 2011 1.2. Mastné kyseliny MK jsou základní stavební složkou lipidů a z hlediska výživy jsou jejich nejvýznamnější složkou. Profil a zastoupení mastných kyselin ovlivňuje technologické, nutriční ale i senzorické vlastnosti mléka. Dále ovlivňují oxidační stabilitu mléka, teplotu tání a krystalizaci (Samková et al., 2008; Gallier et al, 2012). MK jsou součástí každé rostlinné i živočišné 4

buňky, v přírodě se přirozeně vyskytují převážně MK se sudým počtem atomů uhlíku, jež jsou doprovázeny MK s lichým počtem atomů uhlíku. Ty se vyskytují ve stopovém množství, jako např. kyselina pentadekanová, margarová, valerová a další (Velíšek a Hajšlová, 2009). Mléko obsahuje velké množství MK, avšak většina z nich se vyskytuje v malém množství. Pouze 16 MK je obsažených v mléce ve vyšší koncentraci než 1 %. Pouhých pět MK zaujímá více než 75 % z celkových MK v mléce, a to kyselina kaprinová (C10:0), myristová (C14:0), palmitová (C16:0), stearová (C18:0) a olejová (C18:1) (Alonso et al., 1999; Goudjil et al., 2004). 1.2.1. Dělení mastných kyselin MK dělíme podle počtu atomů uhlíku na kyseliny s krátkým až ultra dlouhým řetězcem, kde se počet uhlíků pohybuje od 4 do 38 uhlíků v jedné molekule: 1) MK s krátkým uhlíkatým řetězcem (C 4 -C 6 ), 2) MK se středně dlouhým uhlíkatým řetězcem (C 8 -C 14 ), 3) MK s dlouhým uhlíkatým řetězcem (C 16 -C 18 ). Dále se mohou MK dělit podle nasycenosti vazby H 2. 1) nasycené MK (saturated fatty acid SFA), 2) nenasycené MK s jednou dvojnou vazbou (monounsaturated fatty acid MUFA), 3) nenasycené MK se dvěma až šesti dvojnými vazbami (polyunsaturated fatty acid PUFA) omega-3 omega-6 4) nenasycené MK s trojnými vazbami (ty se nevyskytují v mléce). Délka řetězce a nasycenost MK významně ovlivňuje jejich využitelnost organismem člověka či zvířete. MK s krátkým uhlíkatým řetězcem přecházejí do portální krve a slouží jako rychlý zdroj energie. Nenasycené MK se navzájem liší počtem atomů uhlíku, polohou dvojné vazby a její prostorovou konfigurací (Komprda, 2003). Také se v mléce vyskytují volné mastné kyseliny, které mohou v menší koncentraci působit příznivě, ovšem ve větší koncentraci mohou negativně ovlivňovat chuť mléka a mléčných produktů (Velíšek a Hajšlová, 2009). V mléčném tuku se vyskytuje zhruba 70 % SFA, 25 % MUFA a pouze 5 % 5

PUFA, jejich doporučený poměr je < 1 : 1,4 : > 0,6, přičemž příjem energie z tuků by měl být maximálně 35 % z celkového množství přijatých živin (Samková et al., 2008; Szmatola et al., 2013). Nasycené mastné kyseliny Nasycené MK jsou běžnou složkou přírodních lipidů. V mléčném tuku obecně tvoří 53 72 % z celkových MK (Velíšek a Hajšlová, 2009). Kozí mléčný tuk je bohatý na obsah nižších nasycených MK, kterými jsou kyseliny kapronová (C6:0), kaprylová (C8:0) a kaprinová (C10:0). Obsah těchto metabolicky cenných MK se v kozím mléce pohybuje v rozmezí 15 až 18 %, zatímco v mléce kravském pouze mezi 5 až 9 % (Alonso et al., 1999; Goudjil et al., 2004). Tyto MK způsobují typický kozí pach mléka a pozitivně ovlivňují chuť u zrajících sýrů. Z nutričního hlediska jsou tyto kyseliny velmi prospěšné, na rozdíl od negativních účinků vyšších nasycených MK působí pozitivně, využívají se při léčbě chorob srdečních, střevního systému, malabsorpčních syndromů, cystické fibrózy a také při problémech se žlučníkem (Jandal, 1996; Sanz Sampelayo et al., 2007). Z nasycených MK je v kozím mléce nejvíce zastoupená kyselina palmitová a stearová. Kyselina stearová snižuje poměr celkového cholesterolu k HDL frakci cholesterolu v krvi, čímž působí jako prevence proti vzniku kardiovaskulárních chorob (Park et al., 2007; Samková et al., 2008). Nenasycené mastné kyseliny Nenasycené MK se rozlišují na mononenasycené (MUFA) a polynenasycené (PUFA). V živočišných tucích i rostlinných olejích se nejčastěji nacházejí nenasycené MK s přímým řetězcem, které mají 10 36 atomů uhlíku (Velíšek a Hajšlová, 2009). Mononenasycené MK jsou kyseliny s jednou dvojnou vazbou, která může mít různou polohu a prostorovou konfiguraci. Obsah mononenasycených MK se v mléce pohybuje v rozmezí 2,5 % - 5 % z celkového množství MK v závislosti na druhu zvířete a ročním období. Největší množství MUFA je obsaženo v ovčím, poté kravském a nejméně v kozím mléce. Kyselina olejová, je nejvíce zastoupená MUFA v mléce, její množství se v kozím mléce pohybuje okolo 19 % (Park et al., 2007). Nezbytnou součástí stravy jsou polynenasycené MK se dvěma či více dvojnými vazbami. Pro zdraví člověka jsou důležité dvě skupiny PUFA, a to omega 6 a omega-3, které na sebe vzájemně působí. Příjem tuků by měl být 25 35 % denního množství kalorií a měl by pocházet ze zdrojů obsahující převážně MUFA a PUFA (Russo 2009). Pro dobré zdraví má zásadní význam jejich rovnováha (Connor et al., 1992; Komprda, 2003). V literatuře se uvádí 6

různé hodnoty pro optimální poměr těchto skupin MK, avšak doporučený poměr PUFA omega-6 : omega-3 by měl být maximálně 5 : 1 (Samková et al., 2008; Szmatola et al., 2013). V západním světě se však pohybuje tento poměr v rozsahu 20 30:1 (Simopoulos, 1999). Poměr omega-6/omega-3 může hrát roli při kardiovaskulárních chorobách, rakovině nebo autoimunitních onemocněních. Vysoká hodnota poměru omega-6/omega-3 může mít negativní účinky na zdraví člověka, zatímco hodnota blízká 1 pozitivní (Russo, 2009). Polynenasycené MK nejsou u přežvýkavců syntetizovány v tkáních, proto je jejich koncentrace v mléce závislá na množství absorbovaném ve střevě (Chilliard et al., 2003). Do skupiny omega 6 MK patří např. kyselina linolová (C18:2), která je prekurzorem kyseliny arachidonové (C20:4). Pro zdraví konzumenta je tato kyselina velice důležitá, avšak v přírodních lipidech se vyskytuje v nízké koncentraci. Existuje řada jejích polohových a geometrických izomerů s konjugovanými dvojnými vazbami, všechny tyto kyseliny se souhrnně označují jako konjugovaná kyselina linolová (CLA). Udává se, že CLA působí pozitivně na zdraví člověka díky jejím antidiabetickým, antikarcinogením, antiaterogenním či imunomodulačním účinkům. Bohatým zdrojem CLA je pro konzumenty mléčný tuk přežvýkavců, jelikož z celkového obsahu CLA obsahuje až z 90 % kyselinu rumenovou, což je převládající izomer (cis-9 trans-11) CLA s biologickou aktivitou (Connor et al., 1992; Savoini et al., 2010). Další významná PUFA je kyselina linolenová, která se vyskytuje ve dvou formách, jako isomer α a isomer γ (Velíšek a Hajšlová, 2009). Gama linolenová kyselina (GLA) patří mezi omega-6 MK, má protizánětlivé vlastnosti, ovlivňuje zdraví kůže, vlasů, nehtů a všeobecně pomáhá navození hormonální a emocionální rovnováhy. Průměrná každodenní strava obsahuje dostatečné množství omega-6 MK, takže jejich doplňky nejsou obvykle nutné. Kyselina alfa linolenová (ALA, C18:3) patří mezi esenciální omega-3 MK. Je velice důležitá pro syntézu kyseliny eikosapentaenové (EPA, C20:5) a dokosahexaenové (DHA, C22:6), které jsou nedílnou součástí lidských buněk, kde se podílí na stavbě buněčné membrány (Riediger et al. 2009; Park et al., 2007b). Omega 3 MK jsou součástí široké škály potravin, vyskytují se především v mase ryb (Cant et al., 1997; Donovan et al., 2000; Shingfield et al., 2006), pšeničných klíčcích, čerstvém ovoci a zelenině, česneku, olivovém oleji, lněném semínku, lněném oleji, vlašských ořeších, sójových bobech, sójovém oleji a řepkovém oleji (Chichlowski et al., 2005; Jones et al., 2005, Nudda et al., 2005) a mořských řasách (Rasoul - Amini et al., 2009). Jsou součástí fosfolipidové membrány buněk ve tkáních těla, dále jsou významně zastoupené v sítnici, mozku a spermiích (Connor, 2000). DHA je hojně zastoupená v tkáni nervové soustavy a v sítnici. Omezené ukládání omega 3 MK 7

v tukové tkáni je příčinou potřeby jejich plynulého dodávání spolu se stravou. Velká část α-linolenové kyseliny je oxidovaná, a protože má člověk omezenou schopnost konverze omega 3 MK, tak se její doplnění neprojeví citelným nárůstem hladiny omega-3 MK s dlouhým řetězcem v krevní plazmě, její zbytek se v játrech přeměňuje na kyselinu eikosapentaenovou a dokosahexaenovou. Potřebné je tedy EPA a DHA doplňovat stravou (Arterburn et al., 2006). Bylo zjištěno, že omega-3 MK snižují krevní tlak a výskyt srdečního onemocnění, působí proti ateroskleróze, kardiovaskulárním onemocněním, regulují hladinu cholesterolu v krvi, ovlivňují metabolismus vápníku a tím omezují srážlivost krevních destiček (Heanlein, 2004; Park et al., 2007b). Tab. č. 2: Průměrné zastoupení mastných kyselin (% z celkového množství tuku) v mléčném tuku u koz Název mastné kyseliny označení % máselná C4:0 2,18 kapronová C6:0 2,39 kaprylová C8:0 2,73 kaprinová C10:0 9,97 laurová C12:0 4,99 myristová C14:0 9,81 palmitová C16:0 28,2 stearová C18:0 8,88 olejová C18:1n9c 19,3 linolová C18:2n6c 3,19 arachová C20:0 0,15 µ-linolenová C18:3n6 0,42 α-linolenová C18:3n3 + C21:0 2,18 Převzato z Goudjil et al., 2004 1.3. Trávicí systém přežvýkavců Nejdůležitější částí trávicí soustavy přežvýkavců je bachor, který obsahuje biliony mikroorganismů. Druhové složení mikroorganismů je relativně stálé. Mikrobiální populace zahrnuje bakterie, nálevníky a bachorové anaerobní houby (McAllister et al., 1994). Mikroorganismy štěpí rostlinná krmiva, přetváří je na vysoce kvalitní bílkoviny a energii. Při bachorové fermentaci vzniká kyselina octová, která je zdrojem pro syntézu MK. Kyselina octová a máselná patří mezi lipogenní těkavé mastné kyseliny, zatímco kyselina propionová je 8

prekurzorem především pro glukózu. Množství i podíly finálních produktů bachorové fermentace ovlivňují množství i složení produkovaného mléka (Thomas a Martin, 1988). Krmná dávka bohatá na vlákninu zvyšuje produkci kyseliny octové, tím se zvyšuje i množství tuku v mléce. Kdežto krmná dávka bohatá na koncentrované krmivo jeho obsah snižuje v důsledku zvýšené produkce kyseliny propionové (McAllister et al., 1994). 1.4. Vliv aditiv na složení mléčného tuku Jak již bylo uvedeno, mléko přežvýkavců je jedinečným zdrojem živin a po tisíciletí nedílnou součástí lidské stravy, i přesto může být výhodné složení mléka měnit. Ke změnám určitých složek může docházet například z ekonomických důvodů, producenti se snaží maximalizovat příjem využitím výživových strategií, které mění poměr proteinu a tuku v mléce (Kennelly et al., 2005). Lipidy ovlivňují technologickou a nutriční kvalitu mléka, ovlivňují výtěžnost sýrů, jejich pevnost, barvu i chuť (Delacroix - Buchet et Lamberet, 2000). Dietologové a výživoví poradci se snaží pozměnit složení mléka, aby podporovalo zdraví konzumentů. Prosazují zvýšení složek se speciálními funkčními vlastnostmi, jako jsou omega-3 MK, konjugovaná linolová kyselina (CLA), nebo biologicky aktivní peptidy (Williams, 2000; Kennelly et al., 2005). Pro lidské zdraví konzumentů je vhodné zastoupení MK upravit na 30 % SFA, 60 % MUFA a 10 % PUFA. Dieta je hlavním faktorem ovlivňujícím složení MK, pokud je krmná dávka chudá na tuky, snižuje se i obsah tuku v mléce. Jak již bylo zmíněno, PUFA nejsou u přežvýkavců syntetizovány v tkáních, jejich koncentrace v mléce je přímo závislá na jejich množství absorbovaném ve střevě. Zkrmování aditiv obsahující omega-3 MK, chráněných před biohydrogenací v bachoru, má vliv na zlepšené nutriční vlastnosti syrového mléka i mléčných výrobků (Chilliard et Ferlay, 2004). 1.5. Řasy Řasy (Algae) jsou velmi různorodá skupina organismů (vodní, fotosyntetizující jednobuněčné i mnohobuněčné organismy) obývající širokou škálu ekosystémů od Antarktidy po pouště. Jsou známé po staletí, ale jejich větší komerční produkce začala teprve před několika desetiletími. První známky o využívání řas se datují před 2000 let ve starověké Číně, kde používali řasu Nostoc jako zdroj živin během hladomoru. Nicméně biotechnologie kultivace řas se začala rozvíjet teprve v polovině minulého století (Spolaore et al., 2006). Předpokládá se, že existuje více než 30 tisíc druhů, ale pouze malá část byla prozkoumaná nebo uměle kultivovaná (Christaki et al., 2011). Řasy jsou velmi rozmanité a představují 9

vysoce specializovanou skupinu organismů. Podle současného taxonomického pojetí spadají řasy do několika říší, jedná se o seskupení nepříbuzných skupin organismů, z nichž jsou některé blízké rostlinám (Guschina et Harwood, 2006). Řasy dosahující větších rozměrů jsou nazývány makrořasy. Jde většinou o mořské řasy. Kdežto řasy, které mají průměr menší než 2 milimetry, se označují jako mikrořasy. Je všeobecně známo, že schopnost řas přizpůsobit se podmínkám prostředí se odráží ve variabilitě lipidů, stejně jako jejich schopnost syntetizovat řadu neobvyklých sloučenin (Guschina et Harwood, 2006). Ve výživě lidí se uplatňují převážně druhy Chlorella sp., Spirulina sp., Nostoc sp. a Dunaliella sp. (Pulz et Gross, 2004). Řasy obsahují široké spektrum nutričních složek, jako jsou proteiny, sacharidy, lipidy, volné mastné kyseliny, vitamíny, pigmenty, minerální látky a další bioaktivní složky. Jednobuněčné zelené řasy (Chlorophyta, Chlorophyceae) mají výborné nutriční hodnoty, proto jsou vhodné pro využití jako potravinové doplňky (Pulz et Gross, 2004; Morris et al., 2008), pozitivně ovlivňují zdraví lidí a zvířat (Spolarore et al., 2006). Vysoký obsah bílkovin je jedním z důvodů k používání řas jako jejich netradičního zdroje, obsahují téměř stejné aminokyseliny jako jiné proteinové potraviny (Cornet, 1998). Z esenciálních aminokyselin obsahují například leucin, isoleucin, valin (Becker, 2004). Sacharidy se v řasách vyskytují především ve formě škrobu, glukózy, cukrů a dalších polysacharidů, jejich celková stravitelnost je vysoká, proto se můžou řasy používat bez omezení v potravinách nebo krmivech (Becker, 2004). Řasy představují pro konzumenty výhodný zdroj PUFA. Průměrný obsah tuků v řasách se pohybuje od 1 do 40 %, za určitých podmínek může obsahovat až 85 % sušiny. Mastné kyseliny obsažené v řasách mají většinou délku řetězce C12-C22. Rafinované oleje z řas a ryb jsou bohatým zdrojem DHA a EPA pro jejich konzumenty (Arterburn et al., 2006). Pro zelené řasy je charakteristické, že obsahují více nenasycených MK s dvojnou vazbou na pozici omega-3, kdežto sinice obsahují více nenasycených MK s dvojnou vazbou na pozici omega-6 (Richmond, 2004). V práci byla zvolena jako aditivum řasa Chlorella vulgaris a Japonochytrium sp. 1.5.1. Chlorella vulgaris Sladkovodní zelená řasa Chlorella vulgaris je jednou z nejlépe prozkoumaných mikrořas, je součástí říše Plantae a patří do čeledi Chlorellaceae z třídy Trebouxiophyceae. Představuje výhodný zdroj cenných nutričních látek. Zhruba 60 % tvoří bílkoviny, které se svým složením podobají více bílkovinám živočišným než rostlinným. Obsahují všechny esenciální 10

aminokyseliny ve vyváženém poměru. Nejvíce zastoupený sacharid v Chlorelle je škrob, který tvoří asi 10 % suché hmoty řas. Množství tuků se v řase pohybuje okolo 10-15 %, skládá se převážně z esenciálních nenasycených mastných kyselin, především kyseliny linolové a α-linolenové (Petkov et Garcia, 2007). Také bylo zjištěno, že obsahuje mono a digalactosyl diacylglyceroly, jež mají protinádorové účinky (Pieper et al., 2012). Mimo nutričního využití se některé druhy Chlorelly využívají k čištění odpadních a průmyslových vod, protože buněčná stěna Chlorelly má komplexotvorné vlastnosti, tím ze znečištěných vod odstraňuje těžké kovy (Pieper et al., 2012). Z hlediska rychlosti růstu a biologické hodnoty patří Chlorella k nejzajímavějším sladkovodním řasám, které byly doposud zkoumány. Nespornou výhodou jejího pěstování je až 10 x lepší využití dodávané energie oproti kulturním rostlinám a díky tomu vysoké výnosy. Tvar buněk Chlorelly je nejčastěji kulovitý a ke zdvojnásobení její hmoty může dojít již za 3-6 hodin (Doucha, 1998). 1.5.2. Japonochytrium sp. Japonochytrium sp. je mořská mikrořasa, která neobsahuje zelené barvivo. Nemá jednoznačné taxonomické zařazení. Řadí se mezi tzv. Protista a jsou definována jako jednobuněčné organismy, které nemají diferencované tkáně. Jedná se o seskupení asi 64 000 různých jednobuněčných životních forem, které postrádají společný evoluční původ (Cavalier-Smith, 2003). Jedna z říší patřících mezi Protista je říše Chromista, kam patří oddělení Labyrintuly, známé jako vodní hlenky. Vodní hlenky se vyskytují primárně v mořských biotopech. Zástupci, kteří jsou řazeni do tohoto oddělení, bývali dříve zařazováni mezi houby, prvoky, hlenky, oomycety, rostliny i řasy (Kalina a Váňa, 2010). Do řádu Labyrinthulomycetales patří čeleď Thraustochytriaceae, rod Japonochytrium. Dále se do této čeledi řadí rody Thraustochytrium, Aplanochytrium, Ulkenia, a Schizochytrium. Řád Thraustochytriales, jehož buňky jsou většinou kulovité, jsou skupiny mořských organismů produkujících vysoký podíl lipidů s vysokým obsahem polynenasycených mastných kyselin, zejména omega -3 MK (Kalina a Váňa, 2010). Některé z těchto druhů produkují významné množství dokosahexaenové kyseliny, která je naprosto zásadní MK pro lidský organismus, hraje důležitou roli při vzniku, vývoji a fungování mozku a sítnice (Franklin et al., 1999; Toral et al., 2012). 11

Tab. č.3: Procentické zastoupení vybraných mastných kyselin obsažených v mikrořasách Chlorella vulgaris a Japonochytrium sp. Název mastné kyseliny Označení Chlorella vulgaris (%) Japonochytrium sp. (%) myristová C14:0 0,77 1,89 myristoolejová C14:1 0,00 0,1 pentadekanová C15:0 0,28 1,33 palmitová C16:0 16,17 22,93 palmitolejová C16:1 1,12 0,15 marganová C17:0 0,28 0,44 heptadecenová C17:1 16,68 0 stearová C18:0 0,92 1,47 olejová C18:1 0,49 15,02 linolová C18:2(CIS) 28,34 1,68 gama linolenová C18:3 0,00 0,12 alfa linolenová C18:3(9) 33,66 0,09 arachová C20:0 0,21 0,22 eikosadienová C20:2 0,00 0,01 eikosatrienová C20:3 0,00 0,17 arachidonová C20:4 0,14 0.83 EPA C20:5 0,00 0,57 DHA C22:6 0,00 41,95 V tabulce č. 3 jsou zaznamenány vybrané MK obsažené v mikrořase Chlorella vulgaris a Japonochytrium sp. Na obsah MK v mikrořasách má vliv mnoho faktorů, jako je například její druh, způsob kultivace, sklízení, sušení a zpracování. Podle dostupné literatury obsahuje Chlorella vulgaris okolo 10 % MK, zatímco Japonochytrium sp. obsahuje až 20 % (Hauvermale et al., 2006). V tabulce je uvedeno zastoupení jednotlivých MK, kde je zřejmé, že Japonochytrium sp. obsahuje 22,93 % kyseliny palmitové a 15,02 % kyseliny olejové, zatímco Chlorella vulgaris obsahuje pouze 16,17 % kyseliny palmitové, 0,49 % kyseliny olejové. Z omega-6 MK obsahuje Japonochytrium sp. vyšší množství kyseliny gama linolenové (0,12 %), eikosadienové (0,01 %), eikosatrienové (0,17 %). Chlorella vulgaris tyto kyseliny neobsahuje, avšak obsahuje mnohem vyšší zastoupení kyseliny linolové (28,34 %). Z mastných kyselin řadících se k omega-3 MK obsahuje Chlorella vysoké množství pouze kyseliny alfa linolenové (33,66 %), Japonochytrium sp. obsahuje více kyseliny eikosapentanové (0,57 %) a především dokosahexanové (41,95 %), jež jsou nedílnou součástí lidských buněk, kde se podílí na stavbě buněčné membrány (Park et al., 2007). 12

1.5.3. Kultivace řas Kultivace řas je snadná a finančně nenáročná, řasy se vyznačují vysokým růstovým potenciálem a nízkými požadavky na kultivační prostředí (Petkov et Garcia, 2007; Görs et al., 2010). Každý druh mikrořas vyžaduje specifické podmínky pro svůj růst. Mezi nejdůležitější parametry regulující růst řas jsou kvalita živin a světla, hodnota ph, proudění, obsah solí v kultivačním médiu a teplota kultivace. Teplota pro jejich růst se liší v závislosti na druhu řas a složení média. Optimální teplota se pohybuje v rozmezí 16 27 C, při poklesu teplot pod 16 C dochází k snížení růstu řas, naopak při zvýšení teploty nad 35 C mají letální účinky pro většinu druhů. Dalším z faktorů ovlivňující růst řas je světlo, které je zdrojem energie pro fotosyntetické reakce v mikrořasách. Zdroj světla může být přírodní nebo umělý v podobě zářivek, které emitují modré a červené spektrum světla. Doporučovaná hodnota světelného záření se pohybuje v rozmezí 100 až 200 μe sec -1 m -2. Hodnota ph se v kultivačních médiích pohybuje v rozmezí 7 9, jako optimální se uvádí rozpětí ph 8,2 8,7. Jako vhodné množství solí obsažených v kultivačním médiu se uvádí 20 24 g.l -1. Jako poslední z kritérií pro růst mikrořas je správné promíchávání média. To je nezbytné k zabránění sedimentace řasových buněk na dně kultivační nádoby, zajišťuje rovnoměrný přístup živin a světla. Optimální promíchávání má vliv na zlepšení výměny plynů mezi kulturou a okolním vzduchem a udržuje stejnou teplotu v celém kultivačním médiu (Barsanti et Gualtieri, 2006; Petkov et Garcia, 2007). Kultivační metody mikrořas Pro produkci mikrořas se využívají různé kultivační metody, od kontrolovaných uzavřených laboratorních metod po venkovní otevřené metody (Barsanti et Gualtieri, 2006; Petkov et Garcia, 2007). Pro kultivaci mikrořas se používají nejčastěji umělé otevřené systémy (viz obr. 1), jako jsou kruhové bazény s míchacím ramenem, nebo protáhlé kruhové bazény. V bazénech je 20-30 cm silná vrstva anorganického živného roztoku s řasami, která je vystavená slunečnímu svitu a probublávána CO 2, je v neustálém pohybu pomocí lopatkových míchadel (Lee, 2001). Převládající způsob kultivace v ČR je pomocí fotobioreaktoru sestaveného použitím nakloněných a meandrovitě uspořádaných ploch, po nichž řasová suspenze během dne trvale stéká v tenké vrstvě optimální rychlostí, která je určena sklonem plochy. V noci je suspenze uložena ve sběrných nádržích. Díky několikamilimetrové kultivační vrstvě je objem suspenze na jednotce plochy 50x menší a sklizňová hustota řas 50x vyšší než u bazénů (Masojídek et Prášil, 2010). Venkovní kultivační systémy jsou levnější, ale kultivovaná biomasa mikrořas 13

podléhá rychlejší kontaminaci v porovnání s uzavřeným systémem (Barsanti et Gualtieri, 2006). Obrázek č. 1: Otevřený systém pro kultivaci řas (foto: K. Michnová-Novotná) Pro předpoklad udržení čisté monokultury s vysokou buněčnou koncentrací vedlo k vývoji uzavřených systémů (viz obr. 2, 3). Sem patří různé formy trubkovitých fotobioreaktorů zhotovených ze skla nebo z umělé hmoty. Můžou to být horizontální, vertikální, dvouvrstvé, zavěšené trubice a deskové reaktory. Jako zdroj světla využívají přirozeného zdroje světla, v kombinaci s umístěním fotobioreaktoru ve skleníku, nebo umělého osvětlení (Lee, 2001). 14

Obrázek č. 2: Uzavřený systém pro kultivaci řas (foto: K. Michnová-Novotná) Obrázek č. 3: Uzavřený systém pro kultivaci řas (foto: K. Michnová-Novotná) Další možností je kultivace řas ve fermentorech (viz obr. 4). Tento systém je vhodný pro produkci řas nejvyšší kvality pro farmaceutické využití (Lee, 2001). 15

Obrázek č. 4: Fermentor pro kultivaci řas (foto K. Michnová-Novotná) Podle zdroje uhlíku a přítomnosti světla lze způsoby kultivace dělit na autotrofní, heterotrofní a mixotrofní (Barsanti et Gualtieri, 2006). Jako autotrofní kultivaci označujeme kultivaci mikrořas, při které se kultura pěstuje pod přírodním nebo umělým osvětlením a jako zdroj uhlíku se používá oxid uhličitý. Do této kategorie lze zařadit laboratorní kultivaci pod umělým osvětlením s přiváděným CO 2, dále venkovní otevřené kultivace nebo kultivace ve fotobioreaktorech (Barsanti et Gualtieri, 2006, Masojídek et Prášil, 2010). Heterotrofní kultivace je využívána při kultivaci v tzv. fermentorech bez přítomnosti světla. Jako zdroj uhlíku bývá nejčastěji využívána glukosa nebo kyselina octová. Pro tento způsob kultivace jsou důležité kultivační parametry, jako je kultivační teplota, hodnota ph, koncentrace kyslíku a promíchávání kultury. Heterotrofní způsob kultivace je vhodný pouze pro některé druhy řas (Masojídek et Prášil, 2010). Mixotrofní kultivace řas je kombinací autotrofního a heterotrofního způsobu kultivace. Při tomto způsobu kultivace jsou řasy kultivovány pod umělým či přírodním osvětlením, jako zdroj uhlíku slouží anorganická i organická sloučenina (Barsanti et Gualtieri, 2006; Petkov et Garcia, 2007). 16

1.5.4. Využití řas ve výživě lidí Lidé využívají řasy již po stovky let jako léčiva, kosmetiku, potraviny (Lee, 2001; Pieper, et al., 2012), také jako hnojiva a krmiva pro zvířata (Barsanti et al., 2006; Spolarore et al., 2006; Kiriac, 2008; Rasoul - Amini et al., 2009). Ve výživě člověka se využívají především řasy Chlorella sp., Spirulina sp. Nostoc sp., Dunaliella sp. Veliký vliv na využitelnost zdraví prospěšných látek obsažených v řasách má jejich konečné zpracování, více než 75 % produkce mikrořas je zpracováno ve formě tablet, kapslí a prášků, zbytek se využívá jako masti, krémy apod. (Pulz et Gross, 2004). Jak již bylo zmíněno, řasy obsahují vysoké množství zdraví prospěšných MK patřících do skupiny omega-3, které působí pozitivně v prevenci nebo ve zmírnění projevů některých chorob konzumentů, jako jsou například kardiovaskulární choroby, autoimunitní onemocnění, Crohnova choroba, ulcerózní kolitida, rakovina prsu, tlustého střeva a prostaty, mírná hypertenze, revmatoidní artritida, cukrovka 2. typu, nemoci ledvin, oblast mentálního zdraví (Simopoulos, 1999; Connor, 2000; Riediger et al., 2009). 1.5.5. Využití řas ve výživě zvířat Kvalita výživy zvířat přímo odráží jejich růst, vývoj, zdravotní stav, plodnost i produkci, tím pádem má výživa přímý vliv na ekonomiku celého chovu. Je prokázáno, že i menší množství mikroskopických řas (Chlorella, Spirulina, Schizochytrium) pozitivně působí na fyziologii zvířat a ovlivňuje jejich metabolismus (Pulz et Gross, 2004). Dokonce až 30 % světové produkce řas je využíváno jako krmivo pro zvířata, především v akvakultuře. Právě díky vysoké nutriční hodnotě mohou řasy nahradit doposud používané zdroje bílkovin, jako je sójový olej, rybí moučka atd. (Becker, 2007). V dnešní době se dokonce biomasa řas využívá jako zdroj pro výrobu biopaliva (Olaizola, 2003). 1.5.5.1. Využití řas u monogastrických zvířat Studií na využití přídavku řas do krmné dávky u monogastrických zvířat je poměrně mnoho. Například ve studii Marriott et al. (2002) bylo zjištěno, že přídavek řasy Schizochytrium sp. (0.125 a 0.250 kg/kus/den) bohaté na kyselinu DHA, nemělo žádný vliv na průměrný denní přírůstek prasat, ani na konverzi krmiva. Ovšem ve svalovině pokusných prasat bylo prokázáno vyšší množství kyseliny DHA a jejích esterů. Ve studii Abril et al. (2003) zkoumali toxicitu Schizochytria sp., při podání 5 x vyšším než jsou komerční dávky (598 g/kus/120 dnů). Studie prokázala, že tato řasa nezpůsobila 17

žádné statisticky významné účinky ve vztahu k léčbě klinických pozorování, tělesné hmotnosti, konverze krmiva, úmrtnosti, hematologických hodnot, hmotností orgánů, nebo histopatologii. Změny související s podáváním Schizochytria sp. prokázaly pouze zvýšení hmotnosti u prasat, a to především kvůli zvýšení množství tuku. Ovšem Grinstead et al. (2000), kteří pozorovali vliv přídavku řasy Spiruliny platensis (1, 2, 5 a 20 g/kg ve formě pelet), došli k závěru, že po přidání této řasy ke krmné dávce selat došlo pouze k minimálnímu zlepšení růstových schopností selat, avšak byla zde prokázána lepší konverze krmiva. Přídavek 0,5 g/den mořské řasy Spirulina platensis do krmné dávky králíků snížil koncentraci cholesterolu v krvi a naopak zvýšil hladinu HDL cholesterolu (Colla et al. 2008). Přídavek sladkovodní řasy Chlorelly vulgaris do krmné dávky (2,5 g, 5g, 7,5 g sušené řasy na 1 kg krmné směsi) nosnic měl pozitivní vliv na zvýšení počtu vajec a zlepšení jejich kvality na začátku snáškového období (Halle et al., 2009). Také bylo prokázáno, že přídavek řasy Spirulina platensis (1,5 %, 2 % a 2,5 % z KD) nosnicím ovlivňuje barvu žloutku. Přídavek řas do krmiva je ohledně výsledné barvy žloutků stejně efektivní jako jiná syntetická barviva (Zahroojian et al., 2011). 1.5.5.2.Využití řas u polygastrických zvířat Jak již bylo zmíněno, upravování složení mléčného tuku, aby obsahoval více omega-3 MK a CLA, má velký potenciál ve vztahu ke zdraví konzumenta. Úprava mléka výživou je upřednostňována před úpravami mléka po nadojení (Franklin et al., 1999). Mléčný tuk krav obsahuje více než 400 MK. Zkrmování olejů z mořských řas dojnicím je spojeno s celou řadou změn v profilu MK mléčného tuku, zejména MK s vyšším počtem uhlíků 18 C v řetězci (Jensen, 2002). Dříve se k navýšení omega-3 MK využíval přídavek rybího tuku do krmné dávky. Ryby získávají omega-3 MK pozřením řas nebo ryb živícími se řasami, sami totiž tyto kyseliny nedokážou syntetizovat. Ovšem nové technologie výroby umožňují využívat jako přídavek ke krmné dávce přímo řasy. Přídavek bachorově chráněné biomasy řas ani oleje z řas (v 1 kapsule bylo 29 g kyseliny DHA, skupinám byla podávána 0,5, nebo 1 kapsule/den) nemá vliv na příjem krmiva, navýšení mléčných složek, ani na dojivost. Ovšem v mléce bylo zaznamenáno vyšší množství obsahu kyseliny DHA a trans-18:1 a trans-11 C18:1 mastných kyselin. Vyšší obsah DHA vykazoval přídavek bachorově chráněné biomasy řas než olej z řas (Stamey et al., 2012). Bylo prokázáno, že přidáním mořských řas (Algamac-3050, Aquafauna Bio-Marine, Hawthorne, CA) do krmné dávky přežvýkavců mělo vliv na snížení nasycených mastných kyselin a zvýšení obsahu CLA a dalších polynenasycených mastných kyselin v jejich mléce. 18

Po užívání řas jako krmných aditiv byl zaznamenán vyšší denní nádoj a zároveň vyšší obsah tuku a bílkovin v mléce (Vahmani, 2013). Přídavek řas Spirulina pacifica, Spirulina platensis, Dunaliella salina, Haematoccocus pluvialis do krmné dávky měl pozitivní vliv na buněčnou výživu a na centrální nervový systém, který ovlivňuje veškeré metabolické procesy v těle. Dochází například k zvýšení aktivity štítné žlázy, tím se pozitivně ovlivňuje tvorba a využití kyseliny octové a máselné, které mají rozhodující vliv na množství vytvořeného tuku (Kiriac, 2008). Vliv přidávání řas působí i na mechanické a krystalizační vlastnosti mléčného tuku. Třítýdenní obohacování krmné dávky dojnic mělo za následek zvýšení pevnosti mléčného tuku, pozměněnou krystalizaci a změny v mikrostruktuře (Singh et al., 2004). Změny ve složení mastných kyselin v mléce se pravděpodobně vztahují ke změně zastoupení bakterií v bachoru malých přežvýkavců, a to v důsledku změn spojených se změnou biohydrogenace nenasycených MK přijímaných v dietě obohacené na polynenasycené MK. V této studii byl porovnáván přídavek slunečnicového oleje v množství 25 g a poté v kombinaci s mořskou řasou v množství 8, 16, nebo 24 g/kg sušiny krmné dávky ovcí. Určité skupiny detekovaných bakterií (například kmeny Lachnospiraceae a Quinella) vykazovaly změny v jejich relativní četnosti v souladu s jejich potenciální úlohou při biohydrogenaci v bachoru. (Toral et al., 2012). Or-Rashid et al. (2008) ve své studii pozorovali vliv zkrmování červených řas (Crypthecodinium cohnii) na změny mastných kyselin v bachorové tekutině skotu. Došlo ke snížení nasycených MK (kyselina stearová, C18:0) a naopak ke zvýšení některých nenasycených MK. Mezi kyseliny u kterých došlo k nárůstu, patří kyselina olejová (C18:1) a také C18:1 trans-10, což naznačuje, že došlo ke změně zastoupení mikroorganismů v bachoru. S rostoucím množstvím přídavku řas se zvyšovalo i množství kyseliny vakcenové (C18:1 trans-11), také došlo k navýšení CLA. Lze tedy říci, že doplněk řas může být využit pro zvýšení koncentrace trans C18:1 izomerů MK, které slouží jako prekurzory pro biosyntézu CLA v tkáních přežvýkavců. Franklin et al. (1999) testovali přídavek mořské řasy Schyzochitrium sp. (910 g/den) ke krmné dávce mléčného skotu, kde byla zjištěna vyšší koncentrace omega-3 MK, zejména CLA a DHA. V této studii byl porovnáván vliv přídavku bachorově chráněné řasy (potažená xylózou) a nechráněné řasy. Procentuální množství mléčného tuku bylo u obou pokusných skupin nižší než u kontrolní skupiny bez přídavku řas, přídavek řas snížil příjem krmiva. Koncentrace CLA, DHA a kyseliny vakcenové bylo vyšší u obou pokusných skupin, které 19

byly krmeny řasou, avšak koncentrace DHA byly vyšší u krav, které dostávaly řasu chráněnou před bachorovou biohydrogenací. Pokusy se zkrmováním řasy Schizochytrium sp. (0; 23,5; 47; 94 g/ks/den v průběhu 6 týdnů) ovcím prokázaly výrazné zvýšení omega-3 (C20:5, C22:5, C22:6) i omega-6 polynenasycených MK (C22:5) v mléce, a to v poměru 2,5 : 4,5 (omega-6 : omega-3). Obdobné složení měly i sýr feta a jogurt vyrobené z takto obohaceného mléka (Papadoulos et al., 2002). Mléko a mléčné výrobky obohacené o zdraví prospěšné polynenasycené MK (především omega-3 MK) lze označit za funkční potraviny, které mají kromě výživové hodnoty i příznivý účinek na zdraví konzumenta, jeho duševní a/nebo fyzický stav. Což by mohlo chovatelům poskytnout lepší vyšší výnosy z prodeje mléka a mléčných výrobků obohacených o omega-3 MK. 20

2. Metodika V průběhu tříletého pokusu (2013 2015) byly testovány dva druhy mikrořas, Chlorella vulgaris a Japonochytrium sp. Vybrané dojné kozy byly do pokusu zařazeny na první laktaci, stejná zvířata byla pozorována po dobu celého pokusu, tedy na druhé i třetí laktaci. První rok sledování byla pokusné skupině koz krmná dávka obohacena granulovanou zelenou mikrořasou Chlorella vulgaris v množství 5g/kus/den. V následujícím roce byla zkrmována pokusné skupině Chlorella vulgaris v množství 10g/kus/den. Pokusná skupina byla rozšířena o další podskupinu, které byla zkrmována mořská mikrořasa Japonochytrium sp. v množství 5g/kus/den. Rozdílné množství řas bylo zvoleno s ohledem na jejich složení, Japonochytrium sp. obsahuje podle literatury 20 % MK, zatímco Chlorella vulgaris pouze 10 %. V posledním roce sledování byla pokusné skupině koz přidaná opět mikrořasa Japonochytrium sp. v dávce 10g/kus/den. Sledované řasy byly pro lepší manipulaci a zkrmování v granulované formě a přidávány do krmné dávky společně s jadrnou krmnou směsí při ranním dojení. Standardní krmná dávka byla složena z lučního porostu v množství cca 2 kg/kus/den, sena ad libitum a jadrné krmné směsi, která byla dávkovaná při ranním a večerním dojení v množství 350g/kus, tj. 700g/kus/den. Přístup k vodě a minerálnímu lízu byl neomezený. Kontrolní skupina, byla krmena v průběhu laktace výše uvedenou krmnou dávkou bez přídavku mikrořas. Odběry individuálních vzorků mléka probíhaly v pravidelných intervalech (cca 60., 80., 110., 140. den po porodu) v průběhu krmného pokusu, avšak poslední odběry mléka proběhly tři týdny po dokončení zkrmování řas s tím, že bylo sledováno, zda se vliv podávaných aditiv projeví na skladbě mléčného tuku i po ukončení jejich zkrmování a v jaké míře. Individuální vzorky mléka byly odebrány při ranním dojení v množství 200 ml. Odebrané vzorky byly ihned označeny a vychlazeny na 6 C, bez přidání konzervantů byly převezeny do laboratoře. Z těchto vzorků, z důvodů finančních a časových, byly vytvořeny směsné vzorky, u kterých byla pak provedena analýza základních mléčných složek a spektra mastných kyselin. Pro úplnost dat byly odebrány na počátku a konci sledování vzorky krmiva a řasy, u nichž byl stanoven profil mastných kyselin. 21

3. Výsledky Suma zastoupení nasycených, mononenasycených, polynenasycených, omega 3 a omega 6 MK ze všech 45 stanovovaných MK směsných vzorků kozího mléka pokusné a kontrolní skupiny zvířat v průběhu tříletého sledování je uvedena v tabulkách 4, 5 a 6 a grafech 1-6. Z výsledků zastoupení skupin SFA, MUFA, PUFA, omega 3 a omega 6 z tabulky č. 4 a grafů č.1 a č.2 je patrný vliv stádia laktace na množství obsahu jednotlivých skupin MK. Nejvyšší hodnoty SFA byly zjištěny na vrcholu laktace, kdy naopak došlo k poklesu MUFA a PUFA. K poklesu PUFA skupiny MK a jeho podskupiny omega 3 a omega 6, došlo jak na vrcholu laktace, tak na konci laktace. Nejvíc je to patrné u skupiny omega 3 MK kontrolního směsného vzorku, kdy došlo k poklesu na hodnotu 0,87 % (4.odběr) z původní hodnoty 1,24 % (1.odběr). V případě směsného vzorku pokusné skupiny zvířat, krmené řasou, nebyl pokles tak významný, a to na hodnotu 1,10 % (4.odběr) z 1,21 % (1.odběr). Pro skupinu omega 6 byl také zaznamenán rozdíl v poklesu hodnot mezi pokusnou a kontrolní skupinou, v případě kontrolní skupiny byl zjištěn pokles na hodnotu 2,24 % (4. odběr) z 2,56 % (1.odběr) a pro pokusnou skupinu na hodnotu 2,36 % (4. odběr) z 2,45 % (1.odběr). V druhém roce sledování (tabulka č.5 a grafy č.3 a č.4) došlo k mírnému poklesu PUFA u skupiny, která měla jako doplněk stravy granulovanou mikrořasu Chlorellu vulgaris 10g/kus/den (P1) a kontrolní (K) v období vrcholu laktace, poté se množství PUFA opět zvýšilo. U skupiny P2 (5g/kus/den granulované mikrořasy Japonochytrium sp.) bylo zjištěno vyšší množství PUFA, které se v průběhu laktace příliš neměnilo, množství se pohybovalo od 5,03 5,60. Množství omega 3 a omega 6 PUFA bylo nejvyšší ve skupině P2, poté ve skupině P1 a nejmenší množství v kontrolní skupině. Množství omega 3 se při druhém odběru snížilo u všech třech skupin (P1 z 1,29 na 1,16 %; P2 z 1,32 na 1,18 %; K z 1,26 na 1,16%), s nástupem vrcholu laktace se množství omega 3 postupně zvyšovalo. Množství omega 6 je na začátku a konci laktace vyšší, na jejím vrcholu se snižuje. U skupiny P1 se jejich množství pohybuje v rozmezí 1,96-2,34 %, u skupiny P2 od 2,03 do 2,4 % a u skupiny K od 2,09 do 2,29 %. Při posledním odběru (pokusné skupiny již nebyly přikrmovány řasami) se snížilo množství SFA u všech skupin a naopak se u všech zvýšilo množství MUFA mastných kyselin. Zastoupení polyenových mastných kyselin se při posledním odběru příliš nelišilo. U skupiny P1 se množství PUFA zvýšilo o 0,35 %, u skupiny P2 se snížilo o 0,15 % 22

a K se naopak o 0,42 % zvýšilo. Předpokládáme, že vyšší množství polyenových MK včetně jejich podskupin omega 3 a omega 6 je způsobený příkrmem řas. Již podle analýz řas jsme předpokládali vyšší množství PUFA ve skupině koz P2, které byla přidávána řasa Japonochytrium sp. s vyšším obsahem PUFA MK. Ve třetím roce sledování (tabulka č.6, grafy č.5 a č.6) je patrný vliv stádia laktace na zastoupení obsahu jednotlivých skupin MK. Nejvyšší hodnoty SFA byly zjištěny na vrcholu laktace, kdy naopak došlo k poklesu MUFA, množství PUFA se v průběhu laktace příliš nelišilo. Množství SFA se u pokusné skupiny pohybovalo v množství 71,22 75,77 %, u kontrolní se hodnoty SFA pohybovaly v množství 72,5 74,04 %. Množství mononenasycených MK bylo na začátku pokusu vyšší u pokusné skupiny (23,08 %), po začátku zkrmování řas jejich množství kleslo o 4,45 %, poté opět mírně vzrostlo (o 1,65 %). Zde je pozorovatelný i vliv laktace na množství MUFA. I u kontrolní skupiny jejich množství kleslo při druhém odběru a při třetím opět mírně vzrostlo. Množství polynenasycených MK (PUFA) bylo u skupiny P vyšší než u skupiny K, v prvním odběru o 0,64 %, v druhém odběru o 0,35 % a ve třetím o 0,32 %. Množství omega 3 a omega 6 MK se vlivem přídavku řas snížilo. U množství omega 6 MK lze vypozorovat vliv laktace, jejich množství kleslo při druhém odběru i u kontrolní skupiny koz. 23

Tab. č. 4: Zastoupení SFA, MUFA, PUFA, omega 3 a omega 6 mastných kyselin v směsných vzorcích kozího mléka pokusné a kontrolní skupiny zvířat v 1.roce sledování (2014) P - Chlorella vulgaris K - kontrolní skupina (10g/kus a den) odběr 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. jednotky % % % % % % % % SFA 69,3 71,3 71,2 66,3 66,8 67,2 69,7 66,3 MUFA 26,3 24,2 24,3 29,3 28,7 28,3 25,9 29,8 PUFA 4,41 4,57 4,51 4,35 4,58 4,49 4,41 3,89 omega - 6 2,45 2,59 2,51 2,36 2,56 2,57 2,51 2,24 omega - 3 1,21 1,31 1,29 1,10 1,24 1,26 1,17 0,87 80 70 60 50 40 30 20 P - SFA K - SFA P - MUFA K - MUFA P - PUFA K - PUFA 10 0 1. odběr 2. odběr 3. odběr 4. odběr Graf č. 1: Grafické znázornění zastoupení SFA, MUFA, PUFA ve směsných vzorcích kozího mléka pokusné (P) a kontrolní (K) skupiny v prvním roce pokusu (2014) 24

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 P - PUFA K - PUFA P - omega-3 K - omega-3 P - omega-6 K - omega-6 0,5 0 1. odběr 2. odběr 3. odběr 4. odběr Graf č. 2: Grafické znázornění zastoupení PUFA, omega 3 a omega 6 MK ve směsných vzorcích kozího mléka pokusné (P) a kontrolní skupiny (K) v prvním roce pokusu (2014) Tab. č.5: Zastoupení SFA, MUFA, PUFA, omega 3 a omega 6 mastných kyselin v bazénových vzorcích kozího mléka pokusných skupin (P 1, P 2 ) a kontrolní skupiny (K) zvířat ve 2.roce sledování (2015) P1 - Chlorella vulgaris (10 g/kus a den) P2 - Japonochytrium sp. (5g/kus a den) K - Kontrolní skupina odběr 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. jednotky % % % % % % % % % % % % SFA 66,59 67,66 73,37 72,4 70,47 68,97 73,04 72,22 69,27 67,49 73,82 72,88 MUFA 28,45 27,34 21,86 22,47 24,51 25,63 21,36 22,33 25,91 27,54 21,61 22,13 PUFA 4,95 5,00 4,77 5,12 5,03 5,40 5,60 5,45 4,82 4,97 4,57 4,99 omega 6 2,17 2,34 1,96 2,21 2,21 2,4 2,03 2,25 2,09 2,29 1,82 2,09 omega 3 1,29 1,16 1,34 1,45 1,32 1,18 1,46 1,48 1,26 1,16 1,27 1,41 Poznámky: P1 pokusná skupina Chlorella vulgaris 10g/kus a den; P2 pokusná skupina Japonochytrium sp. 5g/kus a den; K kontrolní skupina 25