Lékařská mykologie (Bi3390)

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Laichmanová Monika Lékařská mykologie (Bi3390) Mykologická diagnostika Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy

2 Klinicky významné mikroskopické huby v poslední době stoupá počet případů mykóz u člověka - možnými důvody jsou slabší imunita lidí - příliš častá léčba antibiotiky (potlačuje veškerou bakteriální flóru => snazší invaze houbového patogena) - případně rozmach cestování (přenos hub z jiných oblastí) - zvýšený záchyt (diagnostika) známo druhů hub dle Dictionary of Fungi 2008 z toho cca 560 druhů je patogenních pro člověka dle Atlas of Clinical Fungi (2013)

3 Klinicky významné mikroskopické huby původci onemocnění jsou vláknité houby a kvasinky většinou běžně se vyskytující ve vnějším prostředí a přirozeně kolonizující vnitřní a vnější prostředí organizmu většina hub patří mezi oportunní patogeny, kteří vyvolávají infekci u jedinců s oslabeným imunitním systémem výjimku představují dermatofyty specializovaní patogeni - anamorfy hub z řádu Onygenales, oddělení Ascomycota způsobující kožní a plicní onemocnění Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides a Paracoccidioides

4 Patogenita hub Mikroskopické houby působí: Mykózy onemocnění způsobená houbami Mykotoxikózy onemocnění způsobené toxiny hub Mykoalergózy onemocnění alergického charakteru vyvolané antigeny mykotického původu Mycetismy houba přítomna v těle, působí jen útlakem okolních tkání Klasifikace mykóz z hlediska klinického: povrchové - kožní a slizniční systémové - zasahující více vnitřních orgánů (hluboké nebo orgánové)

5 Klasifikace mykóz dle lokalizace Kožní mykózy povrchové mykotické infekce kůže a vlasů nebo nehtů dochází k patologickým změnám v hostiteli v důsledku přítomnosti infekčního agens a jeho metabolitů Dermatofytózy Kandidózy Dermatomykózy Dermatofyté (Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton) Candida albicans a non-albicans druhy non-dermatofyté

6 Klasifikace mykóz dle lokalizace Jiné povrchové mykózy povrchové mykotické infekce kůže a vlasu (kosmetické) nevznikají patologické změny a není buněčná odpověď od hostitele Pityriasis (tinea) versicolor, Seboroická dermatitida Tinea nigra Bílá piedra Černá piedra Malassezia furfur Hortaea werneckii (Exophiala werneckii) Trichosporon asahii Piedraia hortae

7 Klasifikace mykóz dle lokalizace Podkožní mykózy chronické, lokalizované infekce kůže a podkožního vaziva původci půdní saprofyté Sporotrichóza Chromomykózy Feohyfomykózy Eumykotický mycetom Entomoftoromykóza Entomoftoromykóza (subkutánní) Mukormykózy (subkutánní) Sporothrix schenckii Fonsecaea, Phialophora, Exophiala, Cladophialophora atd. Exophiala, Bipolaris, Curvularia, Cladophialophora Pseudallescheria, Madurella, Cladophialophora, Exophiala, Curvularia atd. Basidiobolus ranarum Conidiobolus coronatus Rhizopus, Mucor, Rhizomucor, Absidia, Lichtheimia, Saksenaea atd.

8 Klasifikace mykóz dle lokalizace Systémové a subkutánní mykózy způsobené dimorfními houbami původci mykotického onemocnění jsou dimorfní houbové organizmy, které mohou překonat fyziologické a buněčné obranné mechanizmy lidského hostitele tím, že mění jejich morfologické formy jejich výskyt je geograficky omezen primárním místem infekce jsou obvykle plíce po inhalaci konidií Histoplazmóza Histoplasma capsulatum Kokcidiomykóza Coccidioides immitis Blastomykóza Blastomyces dermatitidis Parakokcidiomykóza Paracoccidioides brasiliensis

9 Klasifikace mykóz dle lokalizace Oportunní systémové mykózy mykotické infekce, které se vyskytují téměř výhradně u oslabených pacientů, jejichž normální obranné mechanismy jsou narušeny původci infekce jsou kosmopolitní, saprofytické houby pokud dochází k invazi do tkání, hovoříme o invazivních mykotických onemocněních (IFD) Kandidóza (91%) Aspergilóza (7%) Kryptokokóza (1%) Mukormykóza (1%) Pseudallescheriáza Hyalohyfomykóza Feohyfomykóza Pneumocystóza Candida albicans a další druhy Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans Cryptococcus neoformans Rhizopus, Mucor, Rhizomucor, Absidia, Lichtheimia atd. Pseudallescheria boydii Penicillium, Paecilomyces, Beauveria, Fusarium, Scopulariopsis atd. Exophiala, Wangiella, Bipolaris, Exserohilum, Curvularia Pneumocystis jirovecii

10 Fyziologie klinicky významných mikroskopických hub Kultivace Sabouraudův agar s 2 4% glukózy s přídavkem antibakteriálních látek (chlormfenikol nebo gentamicin) obohacení Sabouraudova agaru thiaminem podporuje růst a pigmentaci řady vláknitých hub cykloheximid potlačuje růst rychle rostoucích nepatogenních saprofytických hub optimální kultivační teplota C teplota inkubace 36 ± 1 C většina původců oportunních mykóz (kandidy, aspergily, zygomycety) jiná, podle potřeby, např. 30 C u identifikačních souprav u dimorfních druhů souběžná kultivace ve 25 C a 37 C

11 Fyziologie klinicky významných mikroskopických hub Kultivace doba kultivace se pro jednotlivé skupiny, rody i druhy liší

12 Fyziologie klinicky významných mikroskopických hub Biochemická aktivita využití při identifikaci u kvasinek a kvasinkovitých organizmů se využívá schopnost asimilovat a štěpit cukry a dusíkaté látky produkce řady enzymů a jiných exolátek (elastáza, proteázy, lipázy, ureáza apod.) např. ureázový test pro rozlišení Trichophyton rubrum a Trichophyton interdigitale

13 Fyziologie klinicky významných mikroskopických hub Antigenní struktury pro vláknité houby platí čím je kultura starší tím více antigenů lze při rozpadu hyf rozpoznat (např. průkaz aspergilózy dvojitou imunodifuzí v gelu, u ranných stádií aspergilóz jedna precipitační linie, s prodlužující se délkou onemocnění přibývá počet precipitačních čar) detekce kapsulárního glukuronoxylomananu (latexová aglutinace) diagnostika kryptokokové meningitidy detekce a stanovení aspergilového galaktomananu (metoda ELISA) - diagnostika invazívní aspergilózy stěna mikroskopických hub je pro makrooraganizmus vysoce antigenní a pro nedostatek enzymů je jím velice špatně odstraňována

14 Fyziologie klinicky významných mikroskopických hub Patogenita většina klinicky významných druhů nenapadá zdravý makrooraganizmus důležité posouzení nálezu mikromycet v klinickém materiálu v souvislosti se zdravotním stavem pacienta a s přihlédnutím k predisponujícím faktorům (tumory, diabetes mellitus, autoimunitní choroby, stavy po transplantacích, dlouhodobé užívání kortikoidů a širokospektrých antibiotik atd.) mykózy mívají často chronický průběh ke kterému přispívá obtížná destrukce buněčné stěny hlavní úloha v obraně proti mikromycetám připadá na buněčnou imunitu (leukocyty fagocytóza)

15 Fyziologie klinicky významných mikroskopických hub Epidemiologie epidemiologický výskyt není pro mykózy typický pouze hromadný výskyt např. dermatofytóz Terapie antimykotika lokální a systémová

16 Mykologická diagnostika Akreditace zdravotnických laboratoří národní certifikační autoritou je Český institut pro akreditaci (ČIA) Akreditace zdravotnických laboratoří je prováděna podle normy ČSN EN ISO 15189:2013 Akreditace zkušebních laboratoří dle normy ČSN EN ISO/IEC 17025:2005 Standardní operační postup (SOP) soupis všeho potřebného k provedení určitého vyšetření Příručka kvality definuje všechny řídící procesy v laboratoři Externí hodnocení kvality Nepodkročitelné minimum diagnostiky mykóz laboratoří lékařské mykologie - požadavky na vybavení a metodologii mykologické laboratoře

17 Odběr a zpracování materiálu na mykologické vyšetření Typ vyšetření Doporučená odběrová Teplota úschovy a maximální doba 1. předběžný výsledek Definitivní souprava transportu do laboratoře výsledek - Výtěr HCD, sterilní vatový tampón dodání v den odběru při 2-8 C 1 den 5-7 dní (krku, nosu, oka, ucha) s transportním médiem - Vyšetření sputa sterilní sputovka dodání v den odběru při 2-8 C mikroskopie do 2 hodin 5 dní kultivace 2 dny - Vyšetření likvoru sterilní zkumavka co nejrychleji, nechladit mikroskopie do 1 hodiny 5 dní kultivace 2 dny - Vyšetření infekce kůže, sterilní vatový tampón dodání v den odběru při 2-8 C 1 den 5-7 dní stěr, hnis s transportním médiem - Vyšetření tkáně sterilní zkumavka s dodání v den odběru, při 2-8 C 1 den 5-7 dní fyziologickým roztokem - Výtěr z pochvy, sterilní vatový tampón dodání v den odběru při 2-8 C 1 den 2 dny uretry, cervixu s transportním médiem - Vyšetření moče sterilní zkumavka dodání v den odběru, při 2-8 C 1 den 2 dny - Vyšetření krve mykologická hemokultura co nejrychleji při 22 C v den pozitivní detekce 14 dnů pro automatický systém - Vyšetření šupin kůže, sterilní zkumavka do 2 dnů při 22 C 1-3 týdny 4 týdny nehty, vlasy, vousy nebo Petriho miska HCD horní cesty dýchací

18 Odběr materiálu na povrchové mykózy Odběry nehtů, kožních šupin a vlasů Kožní šupiny - po předchozím ošetřením 70% alkoholem a oschnutí, odebíráme kožní šupiny seškrábnutím z postiženého místa sterilním skalpelem do sterilní zkumavky nebo přímo do Petriho misky s kultivačním médiem. Materiál odebíráme z okrajů ložiska na rozhraní zdravé a chorobně změněné tkáně, kde je vitalita mykotického agens největší. Vlasy a chlupy - po očištění ložiska odebíráme epilační sterilní pinzetou, odebíráme zejména nějakým způsobem změněné, polámané vlasy a chlupy. Snažíme se především odebrat folikulární část vlasu. Odstřižené vlasy nad úrovní pokožky nejsou vhodný materiál. Odběr z povrchu nehtu - po dekontaminaci 70% alkoholem a oschnutí, odstřihneme okraj nehtu a sterilním skalpelem se seškrabe keratin vnitřní části nehtu a nehtového lůžka do sterilní zkumavky nebo na Petriho misku s médiem.

19 Odběr materiálu na povrchové mykózy Odběry nehtů, kožních šupin a vlasů Nešupící se ložiska zdrsnit sterilním skalpelem, prach setřít na suchý sterilní tampón. Mokvající kožní ložiska stěr tamponem do transportního média. Před odběrem klinického materiálu na mykologické vyšetření nesmí být postižená místa dní ošetřována žádnými lokálními antimykotiky a až 6 týdnů celkovými antimykotiky.

20 Odběr materiálu na mykologické vyšetření Odběrové sady (AMIES - univerzální, FUNGI-QUICK, CAT) Hemokultivační lahvičky

21 Mykologická diagnostika průkaz etiologického agens vyšetřované infekce průkaz přímý nález houby nebo jejich složek ve vyšetřovaném vzorku průkaz nepřímý průkaz specifických stop, které houba v organizmu zanechala (průkaz protilátek)

22 Mykologická diagnostika Průkaz přímý Mikroskopické vyšetření klinického materiálu Kultivace etiologického agens Identifikace etiologického agens Stanovení citlivosti k antimykotikům Průkaz antigenů ve vyšetřovaném vzorku Nepřímý průkaz omezené použití negativa: častý výskyt protilátek i u relativně zdravých jedinců imunosuprimovaní jedinci mohou mít nedostatečnou protilátkovou odpověď falešná negativita

23 Mykologická diagnostika Mikroskopické metody přehled Nativní preparát - vyšetření vaginálního sekretu - modifikace v diferenciální diagnostice kvasinek a vláknitých hub Louhový preparát (včetně modifikace obarvením např. pomocí Myco-Ink) - vyšetření dermatologických a gynekologických vzorků - vyšetření bioptických a nekroptických vzorků Barvení podle Grama - vyšetření vzorků ze sliznic - vzorků z primárně sterilních materiálů Barvení podle Giemsy - vyšetření vaginálního sekretu - diagnostika Pneumocystis jiroveci (trofozoity)

24 Mykologická diagnostika Mikroskopické metody - přehled Barvení pouzder - diagnostika Cryptococcus neoformans Barvení podle Grocota nebo Gram-Weigertovo barvení - diagnostika Pneumocystis jiroveci (cysty) Fluorescence (včetně imunofluorescence) - vyšetření dermatologických, bioptických a nekroptických vzorků - diagnostika Pneumocystis jiroveci (trofozoity i cysty)

25 Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy součást saprofytické mikroflóry člověka v dutině ústní, ve střevě a na poševní sliznici oportunní patogeni nejčastější původci: Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Sacharomyces, Torulopsis, Trichosporon aj.

26 Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy 1. kvasinky náležející do třídy Saccharomycetes oddělení Ascomycota - askosporogenní - asporogenní - pouze nepohlavně se rozmnožující kvasinky 2. bazidiomycetní kvasinkovitá stádia oddělení Basidiomycota (dimorfizmus) Pozn.: dříve dělení na pravé kvasinky a nepravé Hibbett & al. (2007)

27 Ascomycota vřeckovýtrusé houby nejpočetnější skupina, cca 60% známých taxonů, cca druhů do tohoto oddělení patří většina známých mitosporních (imperfektních) hub (žijících pouze jako anamorfy), dříve Deuteromycota vegetativní stélka - haploidní přehrádkované mycelium, přehrádky (septa) mají centrální jednoduchý pór - kvasinkovité pučící buňky, psudomycelium životní cyklus haplo-dikaryotický (haplo-diploidní a diploidní) při pohlavním procesu dochází ke vzniku dikaryotických hyf, kde v koncových buňkách tzv. askogenních hyfách z nich vznikají vřecka (asci, askus) zralé vřecko je diploidní buňka, ve které probíhá meioza za vzniku askospor, obvykle v počtu 8 spor v jednom vřecku plodnice (askomata)

28 Ascomycota buněčná stěna dvouvrstevná, základní složkou chitin a -1,3-polyglukan nepohlavní rozmnožování dělením (vzácné), fragmentace stélky, tvorba konidií základní typem pohlavního rozmnožování je gametangiogamie splynutí morfologicky diferencovaných gametangií : samčí větev mycelia nese anteridium, samičí větev nese několik kulovitých askogonů s jedním nebo několika vláknitými výrůstky trichogyny askogon trichogyn anteridium

29 Ascomycota Pezizomycotina Životní cyklus haplo-dikaryotický haploidní je vegetativní mycelium a plodnice, dikaryotické jsou pouze askogenní hyfy do životního cyklu je vložena dikaryotická fáze charakteristická tzv. konjugovanými mitózami (současné mitózy obou jader) anamorfa

30 Basidiomycota stopkovýtrusé houby společným znakem je tvorba bazidie (meiosporangium), bazidiospor (meiospor) tvořících se exogenně na sterigmatech (stopečkách) bazidiospory bazidie sterigmata

31 Basidiomycota vegetativní stélku tvoří přehrádkované mycelium, ve stěně přehrádek jsou vytvořeny dolipóry (podoba pláště soudku) s parentozómem primární mycelium vzniká klíčením bazidiospory, jednojaderné, u některých zástupců může chybět sekundární mycelium dikaryotické, jeho vznik souvisí se somatogamickou kopulací dvou buněk primárního mycelia konjugované mitózy jsou spojeny s tvorbou přezek (Pucciniales a někteří zástupci dalších skupin přezky netvoří)

32 Basidiomycota Pohlavní rozmnožování somatogamie (kopulace dvou mycelií nebo bazidiospor) plazmogamie sekundární dikaryotické mycelium Nepohlavní rozmnožování arthrokonidie, blastokonidie, chlamydospory a sklerocia anamorfa se obvykle tvoří na dikaryotickém myceliu primární haploidní mycelium kopulace bazidiospor

33 Basidiomycota životní cyklus dikaryotický

34 Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy Morfologie vegetativní stélka je nejčastěji ve formě jednotlivých kulovitých či oválných pučivých buněk blastokonidií (3-15 µm), některé druhy vytvářejí tzv. pučivé pseudomycelium a chlamydospory, vzácně se vyskytuje i hyfální přehrádkované mycelium

35 Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy Nepohlavní rozmnožování - pučení za vzniku blastokonidií (holoblastická konidiogeneze), po odpadnutí dceřinných blastokonidií zůstávají na povrchu mateřské buňky zřetelné jizvy - prosté dělení buněk - u vláknitých typů tvorba arthrokonidií (holoarthrická konidiogeneze) schizotomie blastogeneze

36 Konidiogeneze BLASTICKÁ - konidie se formuje dříve než je oddělena přepážkou od konidiogenní buňky THALICKÁ - hyfa se rozdělí přepážkami a pak rozpadne na jednotlivé buňky a poté se formuje jejich tvar či obsah hyfa BLASTICKÁ THALICKÁ

37 Konidiogeneze BLASTICKÁ podle tvorby stěny se rozlišují dva způsoby vzniku nové konidie HOLOBLASTICKÁ na tvorbě se podílí všechny stěny hyfy ENTEROBLASTICKÁ na tvorbě se podílí vnitřní stěna

38 Konidiogeneze THALICKO-ARTHRICKÁ KONIDOGENEZE HOLOARTHRICKÁ - oddělují se části fertilní hyfy přebírají funkci konidií (arthrokonidií)

39 Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy Nepohlavní rozmnožování základní typy pučení multilaterální bipolární unipolární holoblastická enteroblastická perkurentní

40 Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy Pohlavní rozmnožování - somatogamie (kopulace dvou vegetativních buněk) vzniká diploidní zygota vřecko se tvoří většinou přímo ze zygoty (holozygotní druhy) nebo jako výrůstek zygoty (exozygotní druhy) pučení somatické buňky (2n) pučení askospory Saccharomyces cerevisiae (haplo-diplobiotický životní cyklus)

41 Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy Pohlavní rozmnožování - u vláknitých typů kopulují nepříliš diferencovaná gametangia - gametangiogamie polysporické vřecko Dipodascus uninucleatus (haplobiotický životní cyklus) somatické hyfy

42 Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy Kvasinková stádia oddělení Basidiomycota Pucciniomycotina, Microbotryomycetes, Sporidiobolales anamorfa Sporobolomyces anamorfa Rhodotorula Agaricomycotina, Tremellomycetes, Tremellomycetidae, Tremellales,Tremellaceae anamorfa Cryptococcus teleomorfa Filobasidiella anamorfa Trichosporon Ustilaginomycotina, Exobasidiomycetes, Malasseziales anamorfa Malassezia Hibbett & al. (2007)

43 Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy Kvasinky oddělení Ascomycota Saccharomycotina, Saccharomycetes, Saccharomycetidae, Saccharomycetales Candida Geotrichum Saccharomyces Hibbett & al. (2007)

44 Příště: