Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Candida species

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Candida species (bakalářská práce) Hradec Králové, 2011 Anna Drbohlavová

2 Prohlašuji, že tato bakalářská práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne Anna Drbohlavová 2

3 Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat Ing. Lucii Křivčíkové za odborné vedení, věcné připomínky k obsahové i formální stránce bakalářské práce a za strávený čas a trpělivost, které mi věnovala po dobu zpracování této práce. Dále bych jí touto cestou chtěla poděkovat za poskytnuté materiály a instrumentaci, bez nichž by nemohla být zpracována a vytvořena obrazová příloha. V neposlední řadě patří poděkování i mé rodině a přátelům za jejich podporu a rovněž trpělivost, kterou mi po celou dobu poskytovali. 3

4 ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Kandidát: Anna Drbohlavová Školitel: Ing. Lucie Křivčíková Název bakalářské práce: Candida species Tato bakalářská práce se zabývá laboratorní diagnostikou Candida spp. Hlavním cílem je utvořit ucelený přehled laboratorních metod využívaných k laboratorní diagnostice jednotlivých druhů Candida spp. především v mikrobiologické laboratoři. Práce je rozdělena do čtyř částí. V první části se zabývá obecnou charakteristikou říše Fungi a kvasinek. Druhá část tvoří přehled základních laboratorních diagnostických metod Candida spp. Ve třetí části je zpracováno členění mykotických onemocnění s jejich všeobecnou charakteristikou doplněnou o nejčastější původce těchto onemocnění z rodu Candida a způsoby odběru klinického materiálu. Na tuto část navazuje čtvrtá, která je věnována charakteristice nejčastějších původců kvasinkových infekcí vyvolaných Candida spp. Celá práce je doplněna fotografickou přílohou vybraných druhů Candida spp. Klíčová slova: Candida spp., laboratorní diagnostika, kvasinkové infekce 4

5 ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Candidate: Anna Drbohlavová Supervisor: Ing. Lucie Křivčíková Title of the thesis: Candida species This bachelor thesis deals with laboratory diagnosis of Candida spp. The main goal is to create the compact survey of laboratory methods, which are used for laboratory diagnosis of Candida species especially in the microbiological laboratory. The thesis is divided into four parts. The first part deals with the common characteristic of the kingdom Fungi and the yeasts. The second part composes of the basic laboratory methods survey for laboratory diagnosis of Candida spp. The primary classification of mycotic diseases with their basic characterisation is processed in the third part. This part includes the most frequent agents of these diseases from the genus Candida as well and the ways of clinical material taking. The fourth part is devoted to the characterisation of the most frequent Candida spp. agents of the yeast infections. The whole thesis is completed with the photographical appendix of selected Candida species. Key words: Candida spp., laboratory diagnosis, yeast infections 5

6 OBSAH OBSAH... 6 SEZNAM TABULEK... 7 SEZNAM OBRÁZKŮ... 7 ÚVOD A ZADÁNÍ PRÁCE ŘÍŠE FUNGI OBECNÁ CHARAKTERISTIKA MIKROMYCET ROZMNOŽOVÁNÍ KVASINEK KVASINKY OBECNÁ CHARAKTERISTIKA SYSTÉM HUB CANDIDA SPECIES TAXONOMICKÉ ZAČLENĚNÍ LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA PŘÍMÉ METODY Mikroskopie Barvící techniky Kultivace Biochemické testy Sérologická diagnostika MYKÓZY LOKÁLNÍ MYKÓZY Dermatomykózy Vaginální mykózy SYSTÉMOVÉ MYKÓZY PATOGENNÍ KVASINKY RODU CANDIDA CANDIDA ALBICANS CANDIDA TROPICALIS CANDIDA DUBLINIENSIS CANDIDA GLABRATA CANDIDA PARAPSILOSIS CANDIDA KRUSEI CANDIDA RUGOSA CANDIDA LAMBICA CANDIDA LUSITANIAE CANDIDA INCONSPICUA CANDIDA SAKE CANDIDA ZEYLANOIDES ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK SEZNAM PŘÍLOH

7 Seznam tabulek Tab. 1: Složení kukuřičného agaru Tab. 2: Složení rýžového agaru Tab. 3: Charakteristika kolonií Candida spp. narostlých na CHROMagaru Tab. 4: Složení CHROMagaru Tab. 5: Charakteristika kolonií Candida spp. narostlých na agaru podle Nickersona Tab. 6: Složení agaru dle Nickersona Tab. 7: Složení BCG agaru Tab. 8: Asimilace cukrů vybraných druhů Candida spp Tab. 9: Fermentace cukrů vybraných druhů Candida spp Seznam obrázků Obr. 1: Kvasinkové kolonie narostlé na CHROMagaru Obr. 2: Kolonie Candida spp. narostlé na agaru podle Nickersona

8 Úvod a zadání práce Candida spp. patří mezi celosvětově nejčastější původce oportunních mykóz. Je běžnou součástí lidské mikroflóry kůže, ústní dutiny, pochvy a střev. Často je proto izolována z klinických materiálů odebraných z těchto míst jako kontaminanta. Pokud však dojde k narušení rovnováhy mezi běžně přítomnými mikroorganismy a prostředím, může dojít k pomnožení těchto kvasinek a invazi do jiných na jejich přítomnost netypických tkání. Důsledkem této skutečnosti je vyvolání často život ohrožujících infekcí. Příčinou vzniku této nerovnováhy bývá často imunodeficitní stav pacienta v důsledku přítomnosti jiného onemocnění, případně dlouhodobého užívání širokospektrých antibiotik. [11, 12, 17, 38] Stejně jako je Candida spp. součástí lidské mikroflóry je také běžnou obyvatelkou životního prostředí. Především ji můžeme nalézt na listech, květech, ve vodě a půdě. [38] Rod Candida zahrnuje přibližně 200 známých druhů, které byly doposud popsány, avšak pouze jen několik z nich je považováno za skutečné patogeny pro lidský organismus způsobující kvasinkové infekce. Mezi tyto patogenní kvasinky rodu Candida patří zejména C. albicans, která se řadí mezi nejčastější původce kandidóz. Dalšími častými původci kandidových infekcí jsou zejména C. krusei, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis a C. lusitaniae. [4, 10, 17, 39] Cílem této práce je vytvořit ucelený přehled diagnostických metod využívaných pro identifikaci Candida spp. především v mikrobiologické laboratoři a zároveň vytvořit přehled nejznámějších a klinicky nejvýznamnějších druhů tohoto rodu. V této práci se zaměřuji zejména na přímé diagnostické metody, které zahrnují především mikroskopii, kultivaci a biochemické testy. Zároveň tato práce obsahuje fotografický přehled mikroskopických preparátů klinicky významných druhů Candida spp. barvených metodou dle Grama, nativních preparátů a narostlých kolonií na Sabouraudově agaru. 8

9 1 Říše Fungi Tato říše zahrnuje eukaryotní organismy, které dříve spadaly do říše rostlin. Jelikož se houby určitými vlastnostmi od rostlin liší, byly z této říše později vyčleněny a nyní tvoří samostatný celek. [21] Základní rozdíl mezi vlastnostmi hub a rostlin je nepřítomnost chlorofylu v případě hub a tím i jejich neschopnost fotosyntézy. Mezi další rozdílné vlastnosti patří přítomnost složitých cukrů v buněčné stěně hub a ve většině případů i přítomnost chitinu. Některé houby dále pak obsahují chitosan, mannany a glukany. Přítomnost těchto látek má zejména význam pro laboratorní diagnostiku, jelikož některé druhy barviv se na tyto látky specificky vážou. Třetí důležitou vlastností hub je přítomnost steroidních látek v jejich cytoplazmatické membráně. Tyto látky jsou pro život hub nezbytné. Na rozdíl od člověka je výchozí látkou pro syntézu steroidních látek ergosterol. Poslední zvláštností je jejich schopnost střídat pohlavní a nepohlavní způsob rozmnožování a zároveň tedy vytváření sexuálních a asexuálních stádií. Sexuální stádia se nazývají teleomorfy, asexuální pak anamorfy. Ne u všech rodů mikromycet byla pohlavní stádia dosud objevena. Takové houby se pak řadí do zvláštní skupiny tzv. Fungi imperfecti nebo-li Deuteromycetes. [21] 1.1 Obecná charakteristika mikromycet Houby jsou v běžné denní terminologii rozlišovány podle jejich velikosti na makromycety a mikromycety. [1] Mikromycety, nebo-li houby mikroskopických rozměrů, se vyskytují ve dvou formách kvasinkové a vláknité. [8] Forma vláknitá je tvořena souborem vláken, která jsou označovaná jako hyfy. Tato vlákna se při růstu navzájem splétají a vytvářejí útvary nazývané mycélium. Část mycélia, která vrůstá do kultivační půdy, se nazývá bazální nebo vegetativní mycélium. Druhá část, která zůstává nad povrchem půdy, je označována jako vzdušné nebo reprodukční mycélium. Vlákna mycélia mohou být rozdělena příčnými přehrádkami nebo-li septy nebo mohou představovat jedinou mnohojadernou buňku, která tato septa neobsahuje. Houby, jejichž 9

10 mycélium je septované, se řadí do tříd Ascomycetes a Basidiomycetes, houby s mycéliem bez zmiňovaných sept pak do třídy Zygomycetes. [8] Forma kvasinková může nabývat různých tvarů. Nejtypičtějšími tvary buněk jsou oválné (Candida) nebo kulovité (Cryptococcus), které se nazývají blastospory. Další tvary, které mohou kvasinky zaujímat, jsou obdélníkový (Trichosporon), trojúhelníkový (Trigonopsis) nebo citrónovitý (Nadsonia). Kromě těchto blastospor mohou kvasinkové formy vytvářet také nepravá vlákna zvaná pseudomycélia a některé i mycélia pravá. [2, 8] Tvorba pseudomycélií souvisí se způsobem rozmnožování kvasinek. [10] 1.2 Rozmnožování kvasinek U kvasinek může být pozorován jak vegetativní tak i pohlavní způsob rozmnožování. [2] Pro většinu kvasinek je charakteristické rozmnožování pučením. Při tomto způsobu rozmnožování se na mateřské buňce vytváří pupen, který se postupně zvětšuje. Zároveň dochází k fragmentaci všech buněčných organel, z nichž se část včetně jádra po jeho rozdělení stěhuje do pupenu. Zúženina mezi mateřskou buňkou a pupenem se postupně uzavírá plazmatickou membránou a buněčnou stěnou. Následně dochází k oddělení nově vzniklé dceřiné buňky od její mateřské. Podle místa, kde pupen na povrchu kvasinky vzniká, se rozlišuje pučení monopolární, bipolární a multipolární. [10, 40] Pokud nedojde při pučení po vytvoření přehrádky k úplnému oddělení dceřiné buňky, zůstávají spolu spojeny a postupně se tak vytváří tzv. pseudomycélium. Na rozdíl od pravého mycélia jsou vlákna pseudomycélia v daných místech zaškrcena a průřez je v těchto místech menší. U pravého mycélia je průřez po celé délce konstantní. [10] Tvorba pseudomycélií je charakteristická pro kvasinky rodu Candida. [10] Další způsob vegetativního rozmnožování je přehrádečné dělení, při kterém vznikají pravá mycélia. Při tomto způsobu dělení se z cytoplazmatické membrány tvoří prstencovitá vychlípenina, která prorůstá směrem do středu buňky, až dojde k rozdělení cytoplazmy a oddělení dvou jader. [41] 10

11 Přehrádečné dělení jednotlivých buněk se u kvasinek vyskytuje pouze u jediného rodu Schizosaccharomyces. [10] U většiny kvasinek lze vedle vegetativního způsobu rozmnožování pozorovat i rozmnožování pohlavní, při kterém vznikají spory. Při tomto způsobu rozmnožování dochází ke splynutí dvou haploidních buněk za vzniku diploidní zygoty. Zygota se pak může dále vegetativně rozmnožovat nebo může docházet k meiotickému dělení jádra doprovázeného vznikem spor. [2, 10] 1.3 Kvasinky obecná charakteristika Kvasinky jsou eukaryotní organismy. Patří mezi tzv. mikromycety nebo-li houby mikroskopických rozměrů. Jejich velikost obvykle dosahuje 3-15 µm. Jsou tedy větší než bakteriální buňky. [10] Kvasinky se taxonomicky řadí do říše Fungi. Avšak netvoří jednotnou taxonomickou skupinu z důvodu rozdílného způsobu rozmnožování jednotlivých rodů. [21] Dříve se kvasinky rozdělovaly do dvou skupin na kvasinky pravé a nepravé. Mezi pravé kvasinky se zařazovaly ty, které se rozmnožovaly pohlavně a mezi nepravé kvasinky pak ty, které se rozmnožovaly výhradně asexuální cestou. Postupem času však došlo u určitých rodů kvasinek patřících do skupiny kvasinek nepravých k objevování pohlavních stádií (tzv. teleomorf). Z tohoto důvodu se od zmíněného typu rozdělení kvasinek postupně upouští. [21] Dnes se kvasinky taxonomicky člení nejen na základě způsobu rozmnožování, ale na základě mnoha dalších kritérií. Jako příklad mohou být uvedeny morfologické charakteristiky vegetativních forem kvasinek, růstové charakteristiky v tekutém a pevném médiu, anebo charakteristiky fyziologické, především utilizace uhlíkatých a dusíkatých sloučenin, dále pak růst v různě obohacených či ochuzených médiích o živiny, produkce různých látek apod. [18] Na taxonomickém začlenění kvasinek se velkou měrou podílela světoznámá odbornice v oblasti mykologie RNDr. Anna Kocková-Kratochvílová, DrSc., která vychází ze základního členění kvasinek do tří tříd podle způsobu 11

12 rozmnožování na Ascomycetes (Endomycetes), Basidiomycetes a Deuteromycetes. [15] 1.4 Systém hub Říše: Fungi (Houby) Oddělení: - Myxomycota (Hlenky) - Chytridiomycota (Chytridiomycety) - Oomycota (Oomycety) - Eumycota (pravé houby) Třída: - Zygomycetes (houby spájivé) - Ascomycetes (Endomycetes) (houby vřeckovýtrusné) - Basidiomycetes (houby stopkovýtrusné) - Deuteromycetes = Fungi imperfecti (houby nepravé) - Blastomycetes (kvasinkové houby) Rody Candida a Cryptococcus - Hyphomycetes (vláknité houby) Rody Histoplasma a Blastomyces - Dermatophyta Rody Microsporum, Trichophyton a Epidermophyton Zdroj: [3, 42] 1.5 Candida species taxonomické začlenění Říše: Kmen: Podkmen: Třída: Řád: Čeleď: Rod: Fungi Ascomycota Ascomycotina Ascomycetes Saccharomycetales Saccharomycetaceae Candida Zdroj: [38] 12

13 2 Laboratorní diagnostika Metody užívané pro průkaz infekčního agens v infikovaném organismu můžeme rozdělit do dvou hlavních skupin na metody přímé a nepřímé. Přímý průkaz infekčního agens spočívá v nálezu daného mikroba ve vyšetřovaném vzorku. Mezi základní přímé diagnostické metody patří mikroskopický průkaz a kultivace patogenního mikroorganismu, respektive jeho izolace. Nedílnou součástí kultivace je identifikace izolovaného neznámého mikroorganismu, k čemuž slouží např. biochemické testy, a stanovení jeho citlivosti na antibiotika, resp. antimykotika. Dále se uplatňují novější tzv. nekultivační metody, jako jsou průkaz mikrobiálních antigenů, nukleových kyselin, příp. průkaz jiných typických chemických složek nebo metabolitů mikroba přímo ve vyšetřovaném biologickém materiálu. Nepřímý průkaz je pak založen na průkazu specifických stop, které daný mikrob v organismu zanechal, konkrétně na průkazu protilátek vytvořených organismem proti danému mikrobu. [20] Mezi základní mykologická vyšetření patří především mikroskopie a kultivace. Pro přesné rodové a druhové určení kvasinek se využívají jejich růstové vlastnosti a metabolická aktivita. V metabolické aktivitě se projevují vlastnosti biochemické, fermentační a asimilační. Dále se pozoruje produkce ureázy, příp. produkce extracelulárního škrobu, jehož pozitivní výsledek je charakteristickým znakem Cryptococcus spp. [11, 19] 2.1 Přímé metody Mikroskopie Mikroskopie zobrazuje velikost a tvar buněk, způsob větvení mycélia, tvar vláken, přítomnost sept apod. Nález charakteristických morfologických útvarů může vést k jednoznačné diagnóze. Příkladem může být nález blastospor a fragmentů pseudomycélia, což svědčí pro přítomnost kandidové infekce. [11] 13

14 Louhový preparát Louhový preparát je základní mikroskopická metoda využívaná pro mykologická vyšetření. Jeho příprava spočívá v maceraci odebraného klinického materiálu kožních šupin, částeček nehtů apod. v 20% roztoku KOH. Pro choulostivější materiál, jako jsou vlasy, je možno použít slabší, 10% roztok. Roztok KOH slouží k projasnění klinického materiálu a k zlepšení rozlišitelnosti elementů hub, které jsou většinou světlolomné. Klinický materiál se nechá na podložním sklíčku macerovat v roztoku minut při pokojové teplotě nebo minut při teplotě 37 C. Preparát se přikryje krycím sklíčkem a prohlíží se v orientačním zvětšení x. Pro pozorování detailů se používá zvětšení x. Louhový preparát není trvalý. V případě potřeby uchovat preparát po dobu několika dnů je třeba k roztoku KOH přidat glycerol. Pro lepší rozlišení je možné louhový preparát přibarvit inkoustem Parker, případně může být louhový preparát připraven v kombinaci s fluorescenčním barvivem a pozorován ve fluorescenčním mikroskopu. [11, 19] Nativní preparát V nativním preparátu se obvykle pozorují živé mikroorganismy. V mykologii se používá především pro pozorování pohybu, buněčného dělení, zjišťování tvaru a struktury buněk kvasinek a při určování morfologických znaků plísní. [20, 43] Principem této mikroskopické techniky je odlišná světlolomnost částic v pozorovaném objektu. [43] Při zhotovení nativního preparátu se ke kapce vhodného tekutého media např. fyziologického roztoku na podložním skle nanese sterilní bakteriologickou kličkou inokulum daného mikroba. Suspenze se překryje krycím sklíčkem a pozoruje se světelným mikroskopem při zvětšení 400x. V případě vyšetření klinického materiálu na podezření mykotické vaginální infekce je přidání 10% roztoku KOH užitečná modifikace metody pro diagnostiku vulvovaginální kandidózy. Hydroxid draselný totiž rozpustí prakticky všechny buněčné formy. Kvasinky však zůstanou neporušené. Přesto se však minimálně u třetiny pacientek neprokáže přítomnost kvasinek 14

15 při mikroskopickém vyšetření. Důležité je využití kombinace mikroskopického vyšetření nativního preparátu a stanovení ph poševního sekretu. [11] Detekce chlamydospor v mikroskopickém preparátu Chlamydospory představují klidové stádium kvasinek, které má zvýšenou odolnost vůči nepříznivým podmínkám okolí. [10] Právě detekce chlamydospor je jedna z nejdůležitějších charakteristik C. albicans, díky které se odlišuje od ostatních druhů rodu Candida. [44] Pro detekci chlamydospor se využívají dva typy agarů, které navozují speciální kultivační podmínky pro tvorbu chlamydospor. Jedná se o agar rýžový a kukuřičný. Kukuřičný agar byl řadu let běžně využíván pro kultivaci hub. V roce 1960 pánové Walker a Huppert pozměnili základní složení agaru přidáním polysorbátu 80, čímž zajistili podmínky pro tvorbu chlamydospor. Přídavek dextrózy podporuje růst kvasinek a pigmentaci kolonií. [22] Tab. 1: Složení kukuřičného agaru Kukuřičný extrakt 2,0 g/l Agar Polysorbát 80 15,0 g/l 7,0 ml Zdroj: Hardy Diagnostics. Corn Meal Agar with Tween 80 for enhancement of chlamydospore formation in Candida albicans [online]. c , [citováno ]. Dostupné z: ph této půdy při 25 C odpovídá hodnotě 6,0 ± 0,2. [22, 45] Naočkované půdy se kultivují při 25 ± 2 C po dobu hodin. [22, 45] Rýžový agar stejně jako kukuřičný agar poskytuje vhodné podmínky pro růst Candida spp. Tvorba chlamydospor je zajištěna přídavkem polysorbátu 80, jehož součástí je kyselina olejová. [22] 15

16 Tab. 2: Složení rýžového agaru Rýžový extrakt 5,0 g/l Agar 20,0 g/l Polysorbát 80 10,0 ml Zdroj: ZIMBRO, Mary Jo; POWER, David A.; MILLER, Sharon M.; WILSON, George E.; JOHNSON, Julie A., Difco TM & BBL TM Manual: Manual of Microbiological Culture Media, 2. vydání, Maryland, USA: Becton, Dickinson and Company, 2009., 686 stran., ISBN Dané množství se rozpustí v 1l destilované vody. Naočkované půdy se kultivují při pokojové teplotě po dobu hodin. ph této půdy při 25 C odpovídá hodnotě 6,6 ± 0,2. [22] Kromě C. albicans tvoří za daných podmínek chlamydospory i C. stellatoidea. C. stellatoidea se následně od C. albicans odliší na základě rozdílné asimilace sacharózy a citlivosti k cykloheximidinu. C. albicans na rozdíl od C. stellatoidea asimiluje sacharózu a je méně citlivá k cykloheximidinu. [17] Germ tube test Germ tube test, nebo-li test na přítomnost klíčních hyf, je jedním ze základních identifikačních testů pro identifikaci C. albicans. C. albicans společně s C. dubliensis jsou jediné kvasinky z rodu Candida, které tvoří tyto klíční hyfy. [46] Hodnocení tohoto testu však vyžaduje jistou zkušenost, jelikož podobné útvary jako jsou klíční hyfy mohou vytvářet i jiné druhy kandid, např. C. tropicalis. Pravé klíční hyfy mají v místě odstupu od buňky stejnou šířku jako po celé svojí délce, zatímco nepravé klíčky se vyznačují zaškrcením, resp. zúžením v místě jejich odstupu z kvasinkové buňky. [20] Germ tube test může být proveden dvěma způsoby. Velmi často používanou modifikací tohoto testu je jeho provedení na agarové půdě obsahující Tween 80 tence nalité na podložním skle nebo v malé Petriho misce. Zkoumaný kmen se na agar očkuje čarou a následně se přikryje krycím sklíčkem. Po 3-4 hodinové inkubaci při teplotě 37ºC se naočkované čáry 16

17 prohlížejí objektivem bez imerze. Jako o něco výhodnější se jeví modifikace testu prováděná v jakémkoli čerstvém séru. Může být použito sérum lidské i zvířecí, např. koňské. Klíční hyfy se pozorují mikroskopicky po inkubaci kultury kvasinek v séru při teplotě 37 C po dobu 2 hod. V tomto případě bývají klíční hyfy výraznější než v případě testování na pevném médiu. [20, 46] Barvící techniky Barvící techniky se používají pro zjištění tvaru a uspořádání buněk, přítomnosti spor a pouzder a sledování buněčných kultur. [47] Preparát je potřeba před barvením řádně zafixovat. Účelem fixace je usmrcení přítomných buněk v preparátu, neboť mrtvé buňky snadněji přijímají barvivo a zároveň lépe přilnou k podložnímu sklíčku, což zabrání jejich případnému odplavení během barvení. Podstatou fixace je vysrážení buněčných koloidů, zejména bílkovin. Bakterie se fixují nejčastěji plamenem, kvasinky a plísně chemikáliemi, jelikož působení plamene mění značně jejich tvar. Z chemických fixačních prostředků se používá především roztok ethanolu, methanolu, acetonu, formaldehydu apod. Pro barvení buněk nebo jader eukaryotních organismů se používají většinou bazická barviva, jako je např. krystalová violeť, methylenová modř, zásaditý fuchsin, safranin, malachitová zeleň apod. Pro vybarvení cytoplasmy, a tím pro lepší diferenciaci vnitřních struktur buněk, se využívají barviva kyselá, jako je např. kyselina pikrová nebo eosin. [47] Podle účelu barvení se rozlišují 3 typy barvení jednoduché, diferenciální a diagnostické. Jednoduché barvení slouží k rozlišení tvaru buněk. Diferenciální barvení slouží k rozlišení jednotlivých morfologických útvarů, jako jsou např. jádra, spory apod., nebo chemických složek buněk (škrob, tuk, ). Diagnostické barvení slouží jako pomůcka k identifikaci mikroorganismů. [47] Barvení dle Grama Tato metoda byla poprvé popsána dánským bakteriologem Hansem Christianem Gramem roku 1844, po kterém byla metoda i pojmenována. [48] 17

18 Tento typ barvení je dnes jednou z nejdůležitějších diagnostických metod při identifikaci bakterií, je však také dobrou pomůckou pro zjištění přítomnosti kvasinek ve vzorku. Pomocí této metody barvení jsou bakterie rozlišovány na skupinu grampozitivních (G+), které se barví modře až fialově, a gramnegativních (G-), které se barví červeně. Podstata tohoto rozdílného chování při Gramově barvení vychází z odlišného složení buněčné stěny. [47] Základní složku buněčné stěny obou skupin bakterií tvoří peptidoglykan. Je to lineární polymer dvou střídajících se aminocukrů: N-acetylglukosaminu a N-acetylmurámové kyseliny. Tyto lineární polymery jsou mezi sebou propojeny a vytváří tak síť. Tato síť je u grampozitivních bakterií pevnější než u gramnegativních, kde jsou tato propojení méně častá. Buněčná stěna grampozitivních bakterií navíc obsahuje těchto síťovaných vrstev velké množství a vytváří tak mohutnou vrstvu na povrchu buňky na rozdíl od gramnegativních, kde se těchto vrstev nachází mnohem méně. Součástí stěny grampozitivních bakterií jsou lineární řetězce teichoových kyselin. Tyto kyseliny tvoří negativně nabité polymery a jejich hlavní úlohou je vazba kationtů. Buněčná stěna grampozitivních bakterií neobsahuje lipidy. [1] Složení buněčné stěny gramnegativních bakterií je odlišné. Je tvořena pouze tenkou vrstvou peptidoglykanu obklopenou z obou stran fosfolipidovými dvojvrstvami. Tzv. vnější membrána je k vrstvě peptidoglykanu připojena molekulami lipoproteinů. Na zevní straně vnější membrány se navíc nalézá vrstva lipopolysacharidů, které jsou k vnější membráně ukotveny pomocí tzv. lipidu A. [1] Principem barvení dle Grama je tvorba komplexu krystalová violeť- Lugolův roztok, který se váže do buněčné stěny bakterií a tím dochází k jejich modrému až fialovému zabarvení. Tento komplex však slabou vrstvou peptidoglykanu gramnegativních bakterií není tak pevně vázán a proto následným působením alkoholu dochází k jeho vymytí společně s vrstvou lipopolysacharidů. Grampozitivní bakterie komplex váží pevně a proto si obarvení ponechávají. Gramnegativní bakterie jsou pak obarveny kontrastní barvou červeně. [49] 18

19 Pracovní postup: Na odmaštěné podložní sklíčko se nanese kapka bakteriální suspenze nebo očkovací kličkou kultura bakterií z pevné půdy, která se rozetře v kapce fyziologického roztoku za vytvoření homogenní směsi. Nátěr se nechá na vzduchu zaschnout a následně je fixován nad plamenem vždy nátěrem směřujícím nahoru. Po vychladnutí se na sklíčko nanese roztok krystalové violeti, který se nechá působit přibližně 30 sekund. Následně se nátěr s krystalovou violetí převrství Lugolovým roztokem, který se nechá opět působit přibližně 30 sekund. Poté se preparát opláchne roztokem acetonu a následně vodou. Jako kontrastní barva se použije roztok safraninu nebo karbolfuchsinu, který se nanese na opláchnutý preparát a nechá se působit přibližně 60 sekund. Poté se barva opět opláchne vodou a preparát se nechá zaschnout. Na obarvený preparát se nanese kapka imerzního oleje a mikroskopuje se imerzním objektivem bez krycího sklíčka. [50] I přes odlišné složení buněčné stěny se kvasinky využitím této barvící techniky barví modře stejně jako grampozitivní bakterie. Dochází k obarvení všech forem, ve kterých se kvasinka může nacházet, včetně hyf. V mikroskopickém preparátu se od ostatních bakterií odliší na základě rozdílné velikosti buňky. Kvasinka je až 4x větší než bakterie. [51] Kultivace Většina kvasinek roste dobře na běžných mykologických a bakteriologických půdách, kde tvoří viditelné kolonie během kultivace po dobu hod. Většina patogenních kvasinek ochotně roste při teplotě 25 C i 37 C, avšak většina saprofytických kvasinek nacházející se běžně v klinických materiálech při 37 C neroste. Schopnost kvasinek růst na kultivačních půdách při 37 C je jednou z charakteristik pro rozlišení jednotlivých druhů. [17] Při podezření na přítomnost dimorfní houby je nutná kultivace při teplotě 25ºC i 37ºC. [23] 19

20 Sabouraudův agar Sabouraudův agar s 2% glukózy příp. dextrózy je univerzální kultivační půdou pro záchyt patogenních i nepatogenních mikromycet, zejména dermatofytů a kvasinek. Původní recept obsahoval 4% glukózy. Použití pouze 2% glukózy omezuje rychlost přechodu kultury do pleomorfního stavu, kdy obsahuje pouze vlákna bez diagnosticky cenných reprodukčních struktur. Kyselé ph této půdy, které se pohybuje v rozmezí hodnot 5,6 ± 0,2 při 25 C, inhibuje růst mnoha druhů bakterií. Pro potlačení růstu nežádoucí bakteriální flóry se do půdy rovněž přidávají antibiotika, nejčastěji gentamicin, který potlačuje růst především gramnegativních bakterií, nebo chloramfenikol jako inhibitor růstu široké škály gramnegativních a grampozitivních bakterií. Pepton, jako jedna ze základní složek Sabouraudova agaru, slouží jako dusíkatý zdroj pro růst mikromycet, glukóza, příp. dextróza pak jako zdroj energetický pro růst mikroorganismů. [8, 9, 22, 52, 53] Na narostlých koloniích je pozorován vzhled, velikost a struktury kolonie, dále pak vztah k pevné půdě vrůstání kolonií či difundování pigmentu do půdy a další znaky. [12] CHROMagar TM Candida Tento typ agaru slouží nejen k růstu a detekci kvasinek, ale zároveň i k druhové diferenciaci různých druhů rodu Candida na základě rozdílného zbarvení kolonií jednotlivých druhů. [54] Principem této diagnostické metody je přítomnost specifických enzymů v těle dané kvasinky, díky kterým je schopna štěpit určitý druh chromogenu doprovázené uvolněním různě zabarvené sloučeniny. [55] 20

21 Obr. 1: Kvasinkové kolonie narostlé na CHROMagaru Zdroj: CHROMagar Microbiology. CHROMagar Candida [online]. c2009, [citováno ]. Dostupné z: About_us.html?PHPSESSID=441354f6c5764ff65ee04b da Tab. 3: Charakteristika kolonií Candida spp. narostlých na CHROMagaru Candida spp. Barva kolonií Candida albicans zelená Candida tropicalis modrozelená až kovově modrá Candida krusei sametově růžová (chmýřovitá) s bělavým okrajem Candida glabrata růžová, nachová Ostatní druhy bílá až světle fialová Zdroj: ZIMBRO, Mary Jo; POWER, David A.; MILLER, Sharon M.; WILSON, George E.; JOHNSON, Julie A., Difco TM & BBL TM Manual: Manual of Microbiological Culture Media, 2. vydání, Maryland, USA: Becton, Dickinson and Company, 2009., 686 stran., ISBN ; CHROMagar Microbiology. CHROMagar Candida [online]. c2009, [citováno ]. Dostupné z: BD. BD - Diagnostic Systems: BBL CHROMagar Candida [online]. c2011, [citováno ]. Dostupné z: 21

22 Příprava agaru Agar je dodáván ve formě prášku, který se podle návodu smísí s daným množstvím destilované vody. Následně se směs za stálého míchání přivede k varu. Teplota však bod varu nesmí přesáhnout. Pokud je ke sterilizaci využíván autokláv, provádí se sterilizace za stejné teploty bez použití zvýšeného tlaku. Následně se připravený roztok rozlévá do Petriho misek, kde se nechává ztuhnout. Skladuje se v temné místnosti. [56] Tab. 4: Složení CHROMagaru Agar 15,0 g/l Pepton 10,0 10,2 g/l Glukóza 20,0 g/l Směs chromogenů 2,0 g/l Chloramfenikol 0,5 g/l Zdroj: CHROMagar Microbiology. CHROMagar Candida [online]. c2009, [citováno ]. Dostupné z: BD. BD - Diagnostic Systems: BBL CHROMagar Candida [online]. c2011, [citováno dne ]. Dostupné z: Chloramfenikol se do půdy přidává za účelem potlačit růst nežádoucích bakterií. ph této půdy odpovídá hodnotě 6,1 ± 0,2. [22, 56] Provedení testu Vzorek určený k detekci a diferenciaci Candida spp. se pomocí bakteriální kličky rozočkuje na médium. Je-li vzorek kultivován přímo z výtěru, je nutné výtěr nejprve jemně otřít o malou plochu povrchu na okraji média a následně rozočkovat pomocí bakteriální kličky. Misky inkubujeme aerobně v obrácené poloze při teplotě 35 ± 2 C po dobu hod. Pro plný rozvoj 22

23 barvy kolonií Candida spp. je nutná inkubace po dobu 42 hod. Během inkubace je nutné minimalizovat přísun světla. [55] Agar podle Nickersona Další selektivní půdou určenou pro záchyt a izolaci kvasinek rodu Candida z klinického materiálu je agar podle Nickersona. Tato půda byla vyvinuta roku 1953 Nickersonem na základě jeho studia schopnosti kvasinek rodu Candida redukovat siřičitan. Kvasinky schopné redukovat siřičitan bismutitý obsažený v kyselém nebo neutrálním médiu na sulfid se projeví tvorbou různě zbarvených kolonií. Siřičitan bismutitý zároveň inhibuje případný růst bakterií. [8, 57] Tab. 5: Charakteristika kolonií Candida spp. narostlých na agaru podle Nickersona Candida spp. C. albicans C. tropicalis C. krusei C. parakrusei C. pseudotropicalis Kolonie hnědočerné, kulaté, hladké, bez šíření pigmentace do okolí, bez lesku hnědočerné s černým vyvýšeným středem, kovově lesklé, okolí kolonie hnědočerně zabarvené v důsledku šíření redukujících enzymů do okolí velké, ploché, vrásčité s černým středem, hnědým okrajem a žlutým haló efektem červenohnědé, středně velké, ploché, lesklé, vrásčité, s širokým žlutým myceliárním okrajem červenohnědé, středně velké, lesklé, ploché s drsným povrchem, bez šíření pigmentace do okolí C. stellatoidea hnědé, středně velké, ploché C. parapsilosis hnědé s hladkým povrchem Zdroj: FRANC Břetislav, HEJZLAR Miroslav, Základy lékařské mikrobiologie: Základy lékařské mykologie a laboratorní diagnostika původců mykotických onemocnění, 1. vydání, Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1984., 62 stran., cnb Hardy Diagnostics. BiGGY Agar - for identification of Candida species - Yeast isolation [online]. c , [citováno ]. Dostupné z: 23

24 Obr. 2: Kolonie Candida spp. narostlé na agaru podle Nickersona C. albicans C. tropicalis C. krusei Zdroj: Hardy Diagnostics. BiGGY Agar - for identification of Candida species - Yeast isolation [online]. c , [citováno ]. Dostupné z: Tab. 6: Složení agaru dle Nickersona Bismut-amónium citrát 5,0 g/l Siřičitan sodný 3,0 g/l Dextróza 10,0 g/l Glycin 10,0 g/l Kvasničný extrakt 1,0 g/l Agar 16,0 g/l Zdroj: ZIMBRO, Mary Jo; POWER, David A.; MILLER, Sharon M.; WILSON, George E.; JOHNSON, Julie A., Difco TM & BBL TM Manual: Manual of Microbiological Culture Media, 2. vydání, Maryland, USA: Becton, Dickinson and Company, 2009., 686 stran., ISBN ; ph této půdy odpovídá hodnotě 6,8 ± 0,2. [22] Candida BCG Agar Base BCG (Bromcresole Green) agar patří mezi diferenční a selektivní média využívaná pro primární izolaci a detekci Candida spp. [22] 24

25 Mezi základní složky tohoto agaru patří pepton, kvasničný extrakt a dextróza. Tyto složky slouží jako zdroje živin nezbytné pro růst kvasinek. Další složkou je neomycin, aminoglykosidové antibiotikum přidávané do média za účelem potlačit růst nežádoucích aerobních a fakultativně anaerobních gramnegativních příp. některých grampozitivních bakterií. Principem identifikace Candida spp. pomocí tohoto agaru je žluté zabarvení v okolí narostlých kolonií kvasinek schopných fermentovat dextrózu. Bromkresolová zeleň zde slouží jako indikátor. Kvasinky Candida spp. na tomto agaru rostou v podobě kolonií vypouklého tvaru s hladkým příp. hrubým povrchem. [22] Tab. 7: Složení BCG agaru Pepton 10,0 g/l Kvasničný extrakt 1,0 g/l Dextróza 40,0 g/l Agar 15,0 g/l Bromkresolová zeleň 0,02 g/l Zdroj: ZIMBRO, Mary Jo; POWER, David A.; MILLER, Sharon M.; WILSON, George E.; JOHNSON, Julie A., Difco TM & BBL TM Manual: Manual of Microbiological Culture Media, 2. vydání, Maryland, USA: Becton, Dickinson and Company, 2009., 686 stran., ISBN ; ph této půdy odpovídá hodnotě 6,1 ± 0,1. [22] Biochemické testy Definitivní druhové určení kvasinek se provádí testováním jejich biochemické aktivity pomocí dvou základních metod - auxanogramu a zymogramu. [20] 25

26 Dalším testem, využívající se především pro odlišení rodů Cryptococcus a Candida, je test produkce ureázy nebo-li test schopnosti hydrolyzovat močovinu. [8, 18] Auxanogram Název tohoto laboratorního testu vychází z řeckých slov auxanó = rostou, grafein = psát. Patří mezi tzv. asimilační testy, což znamená schopnost organizmu přijímat živiny z vnějšího prostředí a následně je přeměnit na látky tělu vlastní. V tomto případě proces probíhá za přítomnosti kyslíku, tedy aerobně, na rozdíl od zymogramů, kde základním principem je fermentace substrátu za nepřítomnosti kyslíku, tedy anaerobně. [13, 24, 67] Mezi dva základní typy auxanogramů využívající se pro laboratorní diagnostiku kvasinek patří cukerný auxanogram a auxanogram dusíkatý. Cukerný auxanogram Principem tohoto testu je schopnost kvasinek využít cukr jako zdroj uhlíku. Provedením tohoto testu je možné zjistit, který cukr (příp. jiný zdroj uhlíku) je kultura schopna asimilovat a tedy využít jako zdroj uhlíku. [7] Provedení testu Na spodní stranu Petriho misky, obsahující příslušnou půdu, se dermografem vyznačí výseče pro jednotlivé cukry. Pomocí kličky se zkoušená kultura masivně naočkuje po celém povrchu agaru. Po naočkování se vybrané cukry aplikují na povrch půdy ve formě tablet, napuštěných papírových disků nebo sypaných malých hromádek aplikovaných na půdu pomocí kovových lžiček. Inkubace probíhá při teplotě 24ºC víčkem vzhůru. První odečet se provádí po 24 hodinové inkubaci, druhý po 48 hod. Jestliže je naočkovaná kultura schopna aplikovanou látku asimilovat, objeví se růst v místech nasypání hromádky daného cukru. V jedné Petriho misce o průměru 10 cm lze provést pět zkoušek na asimilaci různých cukrů, případně dalších zdrojů uhlíku, současně. [7, 20] Jistou nevýhodou této metody je její pracnost a ne vždy zřetelný výsledek. Z praktických důvodů je proto dnes tento způsob zpracování asimilačních testů ve většině laboratoří klinické mykologie nahrazen 26

27 praktičtějšími komerčními kity. V současné nabídce jsou k dispozici různé druhy komerčních kitů vyžadující ve většině případů stále ruční provedení, jejichž výsledky se posuzují prostým okem. Na trhu jsou k dispozici ale i poloautomatizované, příp. plně automatizované produkty, u nichž je vyhodnocení jednotlivých reakcí, případně i technická příprava, prováděna pomocí přístrojů. [20, 24] Vybrané druhy patogenních kvasinek Candida spp. a jejich schopnost asimilace určitých cukrů a dalších uhlíkatých látek je pro ukázku zpracována v Tab. 8. Dusíkatý auxanogram Dusíkaté auxanogramy se využívají pro zjištění, jaký zdroj dusíku je daná kultura schopna asimilovat. [7] Mezi nejsnáze využitelné zdroje dusíku pro kvasinky patří amonné ionty a aminokyseliny, zejména kyselina glutámová a glutamin. Některé kvasinky umí využívat také dusičnany a dusitany, vždy ale pouze za nepřítomnosti výhodnějších zdrojů dusíku v prostředí. Jako další zdroje dusíku mohou být využity také močovina, allantoin a inositol. [10] Základním principem této metody je sledování schopnosti kvasinky asimilovat KNO 3. [19] Zymogram Název tohoto typu biochemického testu je odvozen z řeckých slov zymé = kvasnice a gramma = nápis. Jedná se o záznam kvasných vlastností určovaného kmene kvasinek. Cílem této metody je určit, které sacharidy vyšetřovaná kultura kvasinek zkvašuje a které ne. [13] Provedení testu Inokulum vyšetřovaného kmene je pomocí kličky naočkováno do vhodného média s obsahem zkoumaného cukru. Jestliže je naočkovaná kultura schopna přítomný cukr zkvašovat, tekutá půda se po příslušné inkubační době zbarví žlutě. Žluté zbarvení půdy je důsledek tvorby kyselých produktů při kvašení, což má za následek snížení ph a acidobazický indikátor 27

28 se zbarví dožluta i s celou půdou. Kvašení cukru se rovněž projeví produkcí CO 2, což má za následek tvorbu bublin v použitém médiu. [10, 13] Běžně se sleduje schopnost fermentace glukózy, galaktózy, sacharózy, maltózy, laktózy a rafinózy. Jako pozitivní kontrola může být použita kultura C. tropicalis, jako negativní pak Cryptococcus sp. [10, 19] Vybrané druhy patogenních kvasinek Candida spp. a jejich schopnost fermentace určitých cukrů je pro ukázku zpracována v Tab Test produkce ureázy / Test schopnosti hydrolyzovat močovinu Močovina je štěpena mikroorganismy, které produkují enzym ureázu. [17] Prakticky všechny druhy kvasinek jsou schopné do určité míry utilizovat močovinu jako zdroj dusíku. Nicméně schopnost hydrolyzovat vysoké koncentrace močoviny v půdách obsahující pepton jako zdroj dusíku může být využito k odlišení jednotlivých rodů, případně druhů kvasinek. [18] Tento test se provádí na modifikované Christensenově půdě obsahující močovinu. Naočkovaná půda se inkubuje při teplotě C po dobu 4 dnů s pravidelným každodenním odečítáním výsledků. Pozitivní výsledek je charakterizován změnou žlutého zbarvení půdy na růžovou nebo červenou díky alkalizaci média v důsledku tvorby amoniaku jako produktu hydrolýzy močoviny. Základními složkami půdy jsou močovina, glukóza, pepton, NaCl, KH 2 PO 4, agar, destilovaná voda a fenolová červeň jako indikátor. [17, 19] Tento test se využívá především k odlišení rodu Candida a Cryptococcus. Cryptococcus spp. se vyznačuje produkcí ureázy a výsledek testu v jeho případě vychází pozitivně na rozdíl od Candida spp., pro které je test negativní. Výjimku tvoří C. krusei, jejíž některé kmeny mohou vykazovat pozitivní výsledek hydrolýzy močoviny. [17] 28

29 Tab. 8: Asimilace cukrů vybraných druhů Candida spp. Glc Gal Sac Mal Lac Xyl Inl L-Ara Raf Rha Mlz Škrob Tre Erytritol D- Man ribitol Cel C. albicans + +/(-) +/(-) / /+ + +/(-) - + +/- - C. krusei C. parapsilosis / C. glabrata / C. tropicalis + + +/(-) / /(-) /- C. lusitaniae / C. lambica C. inconspicua C. rugosa C. sake / /- C. zeylanoides + +/ /(+) Zdroj: [7, 16, 18]

30 Tab. 9: Fermentace cukrů vybraných druhů Candida spp. Glc Gal Sac Mal Cel Tre Lac Mlb Raf Mlz Inulín C. albicans + +* -** + - +/ C. krusei C. parapsilosis + +/ C. glabrata /(-) C. tropicalis /- - C. lusitaniae + + +/- -** ** - C. lambica C. inconspicua C. rugosa -(+) C. sake + +/- +/- +/- - +/ C. zeylanoides +*** * často slabě pozitivní až skrytá pozitivita ** mohou se tvořit plynové bubliny *** spíše negativní nebo jen slabě pozitivní Zdroj: [16, 17, 18, 26, 64]

31 2.1.5 Sérologická diagnostika Sérologické vyšetřovací metody slouží jak k průkazu protilátek pomocí známého antigenu tak k průkazu mykotického antigenu v tělních tekutinách. Při sérologickém vyšetření se používají prakticky stejné metody jako v bakteriologii, aglutinace, precipitace, komplement - fixační metody apod. Pro průkaz protilátek může být využita metoda ELISA, pomocí níž se určují třídy IgE, IgM, IgA i jejich kvantita. Problém nastává u imunokompromitovaných pacientů, u nichž je protilátková odpověď nedostatečná až minimální. Větší výpovědní hodnotu má průkaz cirkulujících mykotických antigenů. K detekci antigenů se nejčastěji používají latex - aglutinační test a metoda ELISA. Stanovované antigeny jsou druhově specifické polysacharidy. V případě Candida spp. se jedná o mannan. Všeobecně jsou tyto stanovované antigeny umístěny v buněčné membráně plísní. Během infekce se uvolňují do infekčního ložiska a odtud se dostávají do krevního oběhu. [9, 12, 19] Sérologické metody mají velký význam při diagnostice původců invazivních mykotických infekcí, zejména z hlediska urychlení diagnostiky. Umožňují časnou detekci rozvíjející se systémové mykózy a podle vzrůstajícího titru antigenu lze posoudit další vývoj invazivní mykózy. [12] Pro sérologická vyšetření se odebírá srážlivá krev. Transport odebrané krve probíhá při pokojové teplotě C. [12]

32 3 Mykózy Mykózy jsou všeobecně infekční onemocnění způsobené houbami, plísněmi a kvasinkami. Tuto širokou skupinu onemocnění lze rozdělit na mykózy lokální a systémové. 3.1 Lokální mykózy Lokální mykózy mohou být také označeny jako mykózy povrchové nebo místní. Jsou to onemocnění napadající především kůži a sliznice. Na rozdíl od mykóz systémových obvykle neohrožují postiženého bezprostředně na životě. Jedná se však o infekce s vysokou prevalencí a s typickým sklonem k recidivě. Jedním ze základních problémů při léčbě mykotických infekcí je skutečnost, že původci těchto onemocnění jsou eukaryotní organismy stejně jako buňky lidského těla. Principy působení antimykotik jsou proto do značné míry omezeny pouze na rozdíl ve stavbě membrány, která u houbových organismů obsahuje ergosterol na rozdíl od cholesterolu, který je obsažen v eukaryotních buňkách lidského organismu. V poslední době dochází ke zvyšování výskytu lokálních mykóz a to především mykóz kožních nebo-li dermatomykóz a mykóz vaginálních, především vaginálních kandidóz. [11, 58] Dermatomykózy Dermatomykózy jsou mykotická onemocnění kůže a kožních derivátů. Nejčastějšími původci tohoto onemocnění jsou dermatofyta, kvasinky nebo oportunní hyfomycety. Primární onemocnění jsou vyvolána především dermatofyty a kvasinkou Cryptococcus neoformans. Sekundární infekce vyvolávají pak ostatní kvasinky a plísně u pacientů s predispozičními faktory. Základním problémem při posouzení kauzálního vztahu kvasinek k mykotickým onemocněním kůže a sliznic je skutečnost, že na těchto površích se kvasinky běžně vyskytují jako komenzální flóra. Na sliznicích dutiny ústní, genitálu a v obsahu střev se nejčastěji vyskytuje C. albicans, na kožním povrchu je běžným komenzálem C. parapsilosis, vzácněji C. guilliermondii, ústí folikulů pak většinou obývají lipofilní zástupci rodu Malassezia. Z postižených sliznic 32

33 mykotickým onemocněním jsou tak nejčastěji izolovány kvasinky rodu Candida a to zejména C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei a C. kefyr. Na kůži je z postižených míst především intertriginózních 1 oblastí a paronychií 2 nejčastěji izolována C. albicans, v nehtových ploténkách a na volném kožním povrchu je to však častěji C. parapsilosis. Dále se v kožních a nehtových lézích mohou nacházet slabě patogenní kvasinky rodu Trichosporon. Častou kontaminantou jsou kvasinky rodu Rhodotorula. Oportunní hyfomycety vyvolávají infekce u jedinců s oslabenou imunitou. Hlavními zástupci jsou rod Aspergillus, u onychomykóz především Scopulariopsis brevicaulis. [11] Vaginální mykózy Poševní infekce mohou být vyvolány jednak exogenními mikroorganismy, ale také organismy, které jsou součástí endogenní hostitelské flóry. Běžně přítomná mikrobiální flóra je výrazně ovlivňována estrogenní stimulací. V průběhu cyklu se může vaginální flóra pomnožit až krát. Bylo zjištěno, že tato změna může nastat už během 24 hod. Hormonální změny neovlivňují vaginální flóru pouze ve smyslu kvantitativním, ale i kvalitativním. Bylo prokázáno, že pochva je současně osídlena mnoha různými druhy bakterií a dalších mikroorganismů. Mohou zde být nalezeny bakterie grampozitivní i gramnegativní, anaerobní i fakultativně anaerobní. Všechny součásti ekosystému pochvy jsou v dynamické rovnováze. Jestliže dojde ke změně jednoho faktoru, jsou tím ovlivněny i zbývající části tohoto systému. [11] Mezi mikroorganismy, které běžně osidlují pochvu, aniž by vyvolávaly klinické příznaky, patří také kvasinky rodu Candida a to zejména C. albicans. K vyvolání mykotické infekce musí kandidy projít třístupňovým procesem. Prvním krokem je adheze kvasinkové buňky na poševní epitel, což umožní germinaci blastospor a tvorbu hyf a mycélií, které jsou schopné invaze do epitelu. C. albicans má mnohem vyšší afinitu k poševní sliznici než ostatní druhy Candida spp. tzv. non-albicans, jako jsou např. C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei aj. Kromě schopnosti adheze je také důležitá přítomnost receptoru 1 Intertriginózní = týkající se oblastí, v nichž dochází k výraznému tření kůže navzájem v tříslech, podpaží, pod prsy, apod. [67] 2 Paronychie (paronychium) = zánět nehtového lůžka a okolí obvykle bakteriálního nebo plísňového původu [67] 33

34 v poševní sliznici. Bylo prokázáno, že ne všechny ženy mají stejný výskyt těchto receptorů. Proto některé ženy mohou být k mykotickým infekcím vnímavější než jiné. Dalším důležitým faktorem, který ovlivňuje schopnost kandid adherovat k poševní sliznici, je kompetice o přítomné receptory s laktobacily, které jsou rovněž běžnou součástí poševní mikroflóry. Přítomnost laktobacilů a jejich shlukování zabraňuje a blokuje adhezi Candida spp. na receptory. Proto redukce normální poševní flóry může vyvolat nerovnováhu, jejímž důsledkem může být kandidová infekce. Mezi typické predispoziční faktory vulvovaginální kandidózy patří těhotenství, během kterého vyšší hladina pohlavních hormonů způsobuje vyšší hladinu glykogenu v pochvě, což zlepšuje podmínky pro růst a množení Candida spp. Dalšími predispozičními faktory mohou být užívání hormonální antikoncepce s vysokými dávkami estrogenů, onemocnění Diabetes mellitus, terapie některými zejména širokospektrými antibiotiky a další. [11] Candida spp. jsou druhým nejčastějším původcem poševních infekcí. Při kvasinkové infekci je v 85-90% případů zjištěna přítomnost kmenů C. albicans. V ostatních případech je nejčastěji prokázána přítomnost C. glabrata a C. tropicalis. Tzv. non-albicans kmeny většinou vyvolávají infekce rezistentní na běžnou léčbu u pacientů s oslabenou imunitou. [11] Odběr materiálu Odběry materiálu musí být vždy provedeny z validních míst. Je nutné, aby byl odběr proveden podle všech pravidel, jelikož na správně provedeném odběru závisí i výsledek mykologického vyšetření. Základním pravidlem je sterilní odběr pomocí sterilních nástrojů do sterilních nádobek, Petriho misek, příp. do transportní půdy. Z materiálu odebraného do transportních půd již nelze provést mikroskopické vyšetření. Při transportu veškerého klinického materiálu určeného pro mykologické vyšetření je třeba dodržet pokojovou teplotu v rozmezí C. [11] Všechna zmíněná pravidla odběru v této bakalářské práci jsou vypracována na základě všeobecně známých doporučení. Každá laboratoř by měla mít tyto informace týkající se odběru klinického materiálu zpracované v rámci laboratorní příručky na základě konkrétních vyšetření prováděných danou laboratoří. Laboratorní příručka by měla být veřejně dostupným dokumentem. 34

35 Základní postupy při odběru materiálu v dermatologii Ložisko je třeba nejprve očistit 70% alkoholem, aby byly odstraněny povrchové kontaminanty. Při odběru šupin z okraje ložiska je třeba je oškrabat tupým skalpelem. Při odběru klinického materiálu zpod nehtu se využívá lopatkovitá lanceta s otupenou špičkou. Při tomto odběru je třeba pokud možno proniknout až k rozhraní mezi zdravou a klinicky změněnou částí nehtu. U paronychia se odebírá materiál pomocí bakteriologické kličky přímo na kultivační půdu. Při infekci vlasu jsou postižena především místa vlasového folikulu. Pro vyšetření mají proto význam pouze spodní části vlasů do výšky přibližně 1 cm nad povrchem kůže. Ze sliznic a vlhkých míst se vzorky odebírají pomocí sterilních tampónů přímo na kultivaci. [11] Základní postupy při odběru materiálu při vaginálních mykózách V případě vaginální mykózy se pro kultivační vyšetření provádějí stěry z pochvy a děložního hrdla. Do laboratoře se zasílají společně s dvěma nátěry na podložním sklíčku k mikroskopickému vyšetření. Nátěry se nechávají zaschnout. Transport odebraného materiálu nesmí trvat déle než 2 hod. [11] Základní postupy pro odběr materiálu ze sliznic Odběr ze sliznic se provádí stěrem pomocí suchého nebo navlhčeného sterilního tampónu. Takto odebraný materiál by měl být do laboratoře transportován v co nejkratší době. Během transportu je uchováván v lednici při teplotě 4 C. V případě, že není možné zajistit okamžitý transport do laboratoře, je možné klinický materiál odebrat pomocí tamponu v polotekutém médiu. V tomto případě není možné provést mikroskopické vyšetření. Takto odebraný materiál je transportován při pokojové teplotě. Odběr ze sliznice je možné rovněž provést sterilním tampónem přímo na doporučené tuhé živné půdy. Současně je potřeba všechny tři způsoby odběru doplnit o odběr materiálu na 2 podložní sklíčka. Nátěr se nechá zaschnout. Odebraný materiál musí být v laboratoři zpracován nejpozději do 2 hod. [11] 35