Havarijní plán Ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT Praha pro práci s GMO

Transkript

1 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 1/20 Havarijní plán Ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT Praha pro práci s GMO a) Název organizace: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Jméno, příjmení rektora: prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., Telefon: , karel.melzoch@vscht.cz Jméno a příjmení děkana fakulty: prof. Ing. Tomáš Ruml,CSc. Telefon: , tomas.ruml@vscht.cz b) Právní forma: Veřejná vysoká škola Sídlo a identifikační číslo uživatele: Praha 6, Technická 5, , IČO , DIČ , Jméno, příjmení a trvalý pobyt vedoucího ústavu: prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc., Nušlova 2277/19, Praha 5 c) Odborný poradce: prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc., Vysoká škola chemicko - technologická, Technická 5, Praha 6, telefon: , fax: , demnerok@vscht.cz (katerina.demnerova@vscht.cz ) d) Osoby odpovědné za likvidaci havárie: Ing. Jitka Viktorová, Ph.D., tel , prokesoj@vscht.cz (lab. V04, V03, 232c) Ing. Petra Lovecká, Ph.D., tel , loveckap@vscht.cz (lab. V05) Ing. Petra Prouzová, Ph.D., tel , petra.prouzova@vscht.cz (lab. 251) Ing. Ondřej Uhlík, Ph.D, tel , ondrej.uhlik@gmail.com (lab 209) Jana Pazderová, tel , pazderoj@vscht.cz (250, 250A) Ing. Petra Lipovová, PhD., tel.: , petra.lipovova@vscht.cz (lab č. 234) Doc. Dr. Ing. Zuzana Novotná, , zuzana.novotna@vscht.cz (lab. č. 207) prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc., VŠCHT Praha, tel.: , tomas.ruml@vscht.cz (lab. č., V06, 237, 239, BY04, BY05a) Doc. Ing. Pavel Kotrba, PhD., VŠCHT Praha, tel.: , pavel.kotrba@vscht.cz, (lab. č.129b) RNDr. Jarmila Zídková, CSc., VŠCHT Praha, tel.: , jarmila.zidkova@vscht.cz (lab. č. 211, 233a) Ing. Kamila Zdeňková, Ph.D., tel.: , kamila.zdenkovk@vscht.cz (BY05b, BY06, BY07, BY09 a BY12) e) Přesný popis prostor, kde probíhá nakládání s GMO. Prostory ÚBM, VŠCHT Praha, 2. poschodí budovy B (Technická 3, Praha 6), místnosti č.: V04, V05, V06, 233a, 234, 237, 239, 207, 209, 211 a chodba BY- místnosti BY04, BY05, BY06, BY07, BY09 a BY12 (viz přiložený plánek). Sterilovna a kultivační místnosti V03, 232c a místnosti 250, 250A, 251 chladová místnost (viz přiložený plánek). GMO budou uchovávány v uzavřených lednicích a mrazících boxech v jednotlivých laboratořích. Termostaty, horkovzdušné sterilátory, kultivační boxy jsou umístěny ve sterilovně a kultivační místnosti. Dalším prostorem ÚMB VŠCHT je místnost č. 129b (v prvním patře budovy B; viz přiložený plánek) a je z ní jediný vstup do místnost 129c (bez oken), která laboratoři slouží jako kultivační místnost (laboratoř 129b je tak na kultivačních zařízeních ve 2. patře nezávislá a disponuje i vlastní možností dlouhodobé úchovy biologického materiálu při -80 C). Všechny prostory, ve kterých probíhá nakládání s GMO vyhovují kategorii rizika I a II.

2 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 2/20 f) Plán pracoviště Plán s označením hlavních ovladačů přívodu energií a bezpečnostními prvky je nedílnou součástí tohoto havarijního plánu a je zahrnut jako Příloha 5, 5a a 5b. g) Popis havárie, která může vzniknout v prostorách nebo místě, kde probíhá nakládání. Havárie, které se mohou vyskytnout v uzavřených prostorách, kde probíhá nakládání s GMO mohou mít charakter obecný (např. požár, poškození vodovodního řádu) nebo související přímo s nakládáním s GMO (neplánovaný únik GMO v uzavřeném prostoru a mimo uzavřený prostor k práci s GMO vymezený). Dle závažnosti havárie budou okamžitě učiněna adekvátní opatření k její likvidaci. V případě požáru bude vypnut hlavní přívod elektřiny a plynu (vyznačeno na plánku rozmístění laboratoří) a dle rozsahu požáru bude zvolen způsob hašení (pěnové hasicí přístroje, voda). Pracovníci jsou povinni řídit se interním požárním řádem VŠCHT. Při likvidaci požáru bude zohledněna práce s GMO a dle potřeby a situace bude pracoviště následně ošetřeno desinfekčním prostředkem (chlornan sodný 0,5-1%, Ajatin 0,5-2%). V případě poškození vodovodního řádu a vytopení laboratoře bude nejdříve uzavřen hlavní přívod vody (viz plánek Příloha 5, 5a a 5b), kultury GMO budou přeneseny do jiného uzavřeného prostoru a prostor bude přiměřeně asanován a vysušen. Při současném úniku GMO do prostředí budou použity desinfekční chemické prostředky a po ukončení asanace bude sledována přítomnost transgenů nebo jejich produktů metodami uvedenými v bodě j) havarijního plánu. Při neplánovaném úniku GMO na ÚBM je nutné brát do úvahy kategorii rizika. Pro celé pracoviště je navržena kategorie rizika I a II. Při úniku GMO, zařazených do těchto kategorií, v uzavřeném prostoru i mimo něj nehrozí bezprostřední ohrožení zdraví lidí ani ohrožení životního prostředí a GMO je možno likvidovat postupem v laboratoři běžným (autoklávování 121 o C, 0,15 MPa, 50 min, použití desinfekčních prostředků). Za havárie ve vlastním slova smyslu se nepovažují malé úniky GMO (několik mililitrů), při nichž uniklé GMO mohou být rychle a spolehlivě zlikvidovány použitím desinfekčních prostředků. Za havárii je nutno považovat rozšíření GMO mimo laboratoře (chodby), určené k uzavřenému nakládání s GMO. Mohou nastat havárie následujících typů: Při přenosu nádob s transgenním materiálem např. z kultivační místnosti do laboratoře může dojít k rozlití většího objemu této kultury (např. 1 litr). Zasažená místa je nutné s použitím ochranných rukavic vysušit, odpad zlikvidovat autoklávováním a místo ošetřit v dostatečném rozsahu dvěma typy desinfekčních roztoků: např. Ajatinem (0,5-2%) a následně chlornanem sodným (0,5-1%). Při rozbití skleněné či jiné kultivační nádoby s kulturami in vitro, obsahující transgenní rostliny postup je stejný, jako v předchozím případě. Riziko zde představují pouze bakterie, protože agarové aseptické kultury rostlin nejsou schopny okamžitého přechodu do nesterilních podmínek a hynou. Výjimku mohou tvořit např. rostliny nasazující semena. V těch případech je nutná dekontaminace rostlinného materiálu podle návodu v dalším odstavci. Potřeby pro kultivaci rostlin je třeba mýt v roztoku chlornanu v plastové vaně. Po 24 hod. stání je možno roztok zlikvidovat vylitím do komunálního odpadu. Při rozšíření semen (desítky kusů) nebo vegetativních částí, schopných samostatného rozmnožování, je třeba především zabránit možnosti odnesení částí rostlin na obuvi apod. Dále je nutné asepticky odklidit pevné části do plastového pytle a sterilovat autoklávováním. Zasažené místo pak ošetřit desinfekčním prostředkem tak, jak je uvedeno výše. V případech havárie odlišné od zde popsaných je nutno postupovat podle pokynů odborného poradce.

3 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 3/20 V případě havárie bude informován odborný poradce, vedoucí ÚBM a děkan fakulty. h) Přehled možných následků havárie na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí a biologické rozmanitosti, včetně způsobů zjišťování těchto následků a účinné ochrany před nimi. Pedagogická a vědecká práce na ÚBM VŠCHT Praha se provádí s geny, u nichž nejsou známy nepříznivé následky na zdraví lidí či zvířat ani na biologickou diverzitu. K selekci transgenních organismů se používají geny s rezistencí k antibiotikům (ampicilin, kanamycin, tetracyklin), které jsou lokalizovány na extrachromosomálních vektorových plasmidech. Z toho vyplývá, že bez selekčního tlaku nejsou transgenní organismy nesoucí takový plasmid zvýhodněny oproti netransgenním organismům. Naopak lze konstatovat, že přítomnost vektoru znevýhodňuje transgenní organismus v těchto podmínkách. Možnost úniku transgenních organismů (mikroorganismy, rostliny) mimo uzavřený prostor a jejich šíření je zvýšena zejména při přepravě materiálu uvnitř objektu a při jeho převážení autem (jedná se o přenos GMO kultur z kultivační místnosti do jednotlivých laboratoří). Při přenosu kultur GMO z kultivačních místností do laboratoří bude situace řešena v závislosti na objemu kultury. Malé objemy budou přenášeny v plastikových uzavřených obalech, velké objemy v přepravkách překrytých alobalem. Podobně při přenášení kultur a materiálu z laboratoří k likvidacím autoklávováním do k tomu určené místnosti 250 budou malé objemy, kultury na plotnách nebo použité plasty přenášeny v plastikových uzavřených obalech s piktogramem biohazard, větší objemy v uzavřených lahvích a baňkách jištěných v přepravce a překrytých folií. Přenášený a převážený rostlinný materiál bude neprodyšně uzavřen v plastových nebo plechových nádobách (obalech) a označen značkou Biohazard nejméně 5 cm velkou na protilehlých stranách. Pokud bude materiál přepravován vozem, automobil bude označen nápisem Biohazard a v autě bude k disposici popis přepravovaného materiálu a obecné instrukce, jak postupovat s uzavřeným kontejnerem obsahujícím transgenní materiál (neotvírat, dopravit na ÚBM VŠCHT). Vědečtí pracovníci mají k dispozici genové mapy a sekvence insertů, s nimiž pracují a v případě úniku lze těchto znalostí využít pro monitorování případného úniku transgenu a následnou likvidaci a asanaci. i) Validované postupy detekce GMO. Pro detekci transgenní DNA bude použita amplifikace příslušného úseku DNA s eventuální následnou sekvenací a porovnáním výsledné sekvence se známou sekvencí transgenu. K průkazu proteinových produktů transgenních genů bude využito imunochemické stanovení. Další metody, které mohou být součástí detekce, zahrnují: metody kultivace a nakládání s vektorovými bakteriemi metody transformace bakterií, kvasinek, rostlin metody kultivace a nakládání s geneticky modifikovanými bakteriemi, kvasinkami, rostlinami, metody izolace nukleových kyselin a plasmidů z transgenních organismů metody detekce transgenů a stanovení jejich exprese v bakteriích, kvasinkách, rostlinách Výše uvedený základní seznam lze rozšířit o isolace plasmidové nebo chromozomální DNA, štěpení DNA restrikčními endonukleasami, cílenou mutagenezi, o vnášení specifických transgenů do mikrobiální a rostlinné DNA klasickou transformací nebo elektroporací, či vakuovou infiltrací, elektroforetické ověřování přítomnosti DNA, stanovování a detekce exprese transgenů, Exprese insertu v hostitelských buňkách. Analýzy produktu elektroforeticky, imunodetekcí, metabolickým značením, mikroskopicky, měřením enzymové aktivity. Analýza nukleových kyselin hybridizace, PCR, RT-PCR, TGGE, sekvenování, restrikční analýza.

4 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 4/20 j) Validované postupy použitelné k likvidaci přítomnosti geneticky modifikovaných organismů nebo produktů. Ke zneškodnění geneticky modifikovaných organismů (mikroorganismy i rostliny) v uzavřených prostorách a jejich následné dekontaminaci bude užito postupů odpovídajících typu a rozsahu kontaminace podle bodu g. Monitoring asanovaných prostor bude prováděn postupy specifikovanými v bodě i tohoto havarijního plánu. k) Metody pro izolaci prostor a zařízení zasažených havárií, včetně metod kontroly účinnosti izolace. V případě úniku geneticky modifikovaných mikroorganismů a rostlin bude vymezen zasažený prostor, výrazně označen a ohraničen (křídou, fixem, výstražné nápisy) a bude zamezen přístup osob. Prostor bude ošetřen 0,5-1% chlornanem sodným a následně 0,5-2% Ajatinem. Po chemické asanaci se kontaminovaná plocha ozáří germicidní lampou výkon 2x25W. Jednotlivé drobné předměty, které byly únikem zasaženy, budou autoklávovány. Transgenní rostliny, které by unikly mimo vymezené bariery, budou smeteny a autoklávovány v pytlích. Nepřítomnost geneticky modifikovaných mikroorganismů bude dokumentována odebráním vzorků z původně zasaženého místa a průkazem nepřítomnosti GMO nebo jejich produktů. (smotkem gázy navlhčeným sterilní vodou bude setřeno cca 50x50 cm plochy, gáza eluována malým množstvím vody a bude použita buď jako templát pro PCR s použitím primérů odvozených od sekvence insertu nebo k imunochemické detekci produktů transgenů). V případě positivních výsledků bude dekontaminační proces opakován za použití alternativního desinfekčního prostředku. Vzhledem k různorodosti vektorů a insertů používaných v laboratořích na Ústavu biochemie a mikrobiologie budou přesné postupy stanovení příslušných GMO uloženy u vedoucích laboratoří. l) Popis a nákres uložení asanačních prostředků použitelných ke zneškodnění předmětných geneticky modifikovaných organismů nebo produktů a dekontaminaci zasaženého prostoru. Koncentrovaný a naředěný roztok (0,5-1%) chlornanu sodného a koncentrovaný a naředěný roztok (0,5-2%) Ajatinu budou umístěny v označených skříních umístěných ve všech místnostech určených pro uzavřené nakládání s GMO (V03, V04, V05, V06, 129b, 232c, 233a, 234, 237, 239, 207, 209, chladové místnosti, 211, 250, 250A, 251 a chodba BY viz plánek). V kultivační místnosti (V03) a v laboratořích V05, V06, 239 jsou umístěny přenosné germicidní lampy (3 s výkonem 30W, 1 s výkonem 25W), laboratoř V04 a místnosti chodby BY jsou vybaveny pevnými germicidními lampami (s výkonem min. 30W). m) Postupy na ochranu zdraví člověka a zvířat a ochranu životního prostředí v případě nežádoucího ovlivnění vzniklou havárií, případně metod na zneškodnění nebo sanaci rostlin a zvířat, které se nacházely v oblasti v době havárie, v souladu se zvláštními právními předpisy. Při charakteru práce na ÚBM se nepředpokládá, že by používané GMO nežádoucím způsobem ovlivnily živé organismy nebo životní prostředí. K zneškodnění uniklého GMO budou použity metody uvedené v bodě g) tohoto havarijního plánu. Oligonukleotidy užívané pro amplifikaci nejpoužívanějších GMO jsou uvedeny dále:

5 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 5/20 Oligonukleotidy (všechny sekvence oligonukleotidů jsou zapsány v pořadí 5-3 ) Selekční marker nptii primer F nptii-u: GAA CAA GAT GGA TTG CAC GCA GG primer B nptii-l: AAG AAG GCG ATA GAA GGC GAT GC primer F pica3: primer B pica4: Kan-Forward Kan-Reverse Km-forward Km-reverse APH2 short APH2reverse GAGGATGGTTGTGTCTATCGCG CTTCTTGTGCCAATAATTGCCG TCA CCC AGA AAC GCT GGT G GTT CCC AAC GAT CAA GGC GA AGCAAGCGAACCGGAATGAC GCTTGGTCGGTCATTTCGAACC CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG Resistence pro ampicilin primer F: ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCC primer B: TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACC Terminátor NOS primer F: primer B: GAATCCTGTTGCCGGTCTTG TTATCCTAGTTTGCGCGCTA primer HAnosf-118 GCATGACGTTATTTATGAGATGGG primer HAnosr-118 GACACCGCGCGCGATAATTTATCC primer NOS ter 2-5 GTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTG primer NOS ter 2-3 CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGT Promotor 35S CaMV primer F: GCTCCTACAAATGCCATCA primer B: GATAGTGGGATTGTGCGTCA 35S/F 35S/R primer 35S/F primer 35S/R primer 35Scf3 primer 35Scr4 primer 35S-1 primer 35S-2 CCT ACA AAT GCC ATC ATT GCG GGG TCT TGC GAA GGA TAG TG CCT ACA AAT GCC ATC ATT GCG GGG TCT TGC GAA GGA TAG TG CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC GCTCCTACAAATGCCATCA GATAGTGGGATTGTGCGTCA

6 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 6/20 Histochemický marker GUS primer F: CAACGAACTGAACTGGCAGA primer B: TAATCAGGAACTGTTGGCCC gen bphc bphc1/f bphc2/r gen GFP GFP/F GFP/R gen LUC LUC/F LUC/R ATG AGC ATC AAG AGC TTG GGT TAT TCA CGA ATT CCT TCG CAC CGA CTT CAA GAC ACG TGC TGA AGT CA CTC TTT TCG TTG GGA TCT TTC TAA GTA CAA AGG CTA TCA GGT G CTT GGC CTT TAT GAG GAT CTC Gen pro osmotin (resp. pseudoosmotin) primer F CGGAATTCCATATGGCAACTATCGAGGTCCGAAAC primer B CTGCGGGATCCCGGCTAACCATTAGGACAAAAGATAACC Gen HisCUP primer F primer B gen pbrt primer F primer R gen ATF3 H primer ATF3 H/F primer ATF3 H/R Gen sul1: primer F primer B cat-f cat-r gen pbtt (mett) mtr mtf gen pbtd (metd) mdf mdr gen pbty (mety) myf mtr CATCATCATGGTATGGCTAGCATG TCATTTCCCAGAGCAGCATGA TGCTCTAGAGGCCTCCCATGCAAGCCCTGCGT CATGAATTCGGCGTTACACCTGGGTAGATG GTCGGGATCCATGGCAACTCTATTTCTCAC GTACGCGTCGACTTAACCCGACCCGAGTCCATA GTATTGCGCCGCTCTTAGAC GGTTTCCGAGATGGTGATTG CACTGGATATACCACCGTTGATATATC GGCGGGACGGTGAGTAGCGTCATG AAGGAGATCCATATGGGCTCTGCCACCGCGCAG CAGAATTCAGGTCATGCCGGCTGCAAC AAGGAGATCCATATGCCTGAAAACGACAAGAATG ATCGGATCCTCATGCGCTGGCGTTG AAGGAGATCCATATGAGTACGACAAAACG ATCGGATCCCCTACCTCCGCAACGTTG

7 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 7/20 gen pbtr (metr) mrf mrr gen pbta (meta) maf mar gen pbtb (metb) mbf mbr gen pbtc (metc) mcf mcr AAGGAGATCCATATGATGCGGATCGGTGAAC ATCGGATCCTCGAGCTTCAGGCATGCTC AAGGAGATCCATATGAACAAAGAATCCCCCAAC ATCGGATCCTCAGGCCTTCTGGGTCTTGAGTAG AAGGAGATCCATATGTTTTTGAATCAGGCCGTC ATCGGATCCGCGGTCACCGAGTCGCTCTC AAGGAGATCCATATGCACTACACGTATTC ATCGGATCCTCACTGCTGGCCGGCAGGTC gen HHTC (v p1v5-ag) sag-cu1p GATCTCATAACCTGGGTATGAACCACGACCTGCAAG SacR GTGACTCGAGCGTTTTAGAATAGCAGGTACGAC gen HHTC (v plbb9) slb-cu1p GATCCAGCACATAACCTGGGTATGAACCAC dlr CAGCCCTTTACCCTGCGAGGTCATCGAGTCAG gen HHTC (v pmal-c2x) sms2m AGCTTAGCAACCCTCGGTCACGTACGGACGTTC SM3 CATCCGCCAAAACAGCCAAC gen CHSK MS1M SM3 gen HEFGH MH1M SM3 gen MDQTH MH2M SM3 gen Npt KF KR gen merr EmerF EmerR AGCTTACTTATCCTGGCTCACGTGATCTTCGCTCGGACAG CATCCGCCAAAACAGCCAAC AGCTTAGTGGCCAAATTCATGACCG CATCCGCCAAAACAGCCAAC AGCTTAGTGCGTCTGGTCCATACCG CATCCGCCAAAACAGCCAAC ACACGCCATGGGCCATATTCAACGGGAAACGTC AGTCAAGCTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTC GTCAAGCCATATGGAAAATAATTTGGAAAACCTGAC GAATTAATTCTCGAGCTAAGGCATAGCTCAC

8 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 8/20 gen -HMT1A ALPHF ALPHB gen AsMT1a,b,c bamti-f hamti-r gen AsMT2 Q4-F1 GWQ4-R1 gen AsMT3 AsMT3_eF: AsMT3_eR gen HP shp dlr TACAGATCTATGAAGAGCTGCTGCTCC AAGGGATCCGGCACAGCAGCTGCATCC GCGGGATCCAAACATCATGCACTCGAACGT ACCGAAGCTTGGTIATAGCGCAGGCAC CGCTTGTTTCCTTCGCTAACTG ATGAGGATATGGCTGTACAGTAG GCGGGATCCACCTGCGTTTAC ACCGAAGCTTCCGCTCAGCAG GATCCGGTCATCATCCACACGGTCATCATC CAGCCCTTTACCCTGCGAGGTCATCGAGTCAG gen HP3 (v p1v5-ag) shp3p GATCCGGTCATCATCCACACGGTCATCATC SacR GTGACTCGAGCGTTTTAGAATAGCAGGTACGAC gen HP3 (v pezz18) szhp3 CCGGGCATCATCCACACGGTC SZZR GCTGCAAGGCGATTAAGTTG gen HP3 (v pmal-c2x) amhp3m AGCTTAACCATGTGGATGGTGACCATGCGGGTG SM3 CATCCGCCAAAACAGCCAAC gen CP2 scp SacR gen CP (v LBB9) LCPP dlr gen CP (v pbi121) CPP IgusR SP SPP SacR gen PC1 spc1p GATCCGGTTGTGAATGTC CATGCGGATGTG GTGACTCGAGCGTTTTAGAATAGCAGGTACGAC GATCCAGCAGGCTGCGGTTGTCCATGCGGTTGTGGCGCT CAGCCCTTTACCCTGCGAGGTCATCGAGTCAG GATCATGGGCTGCGGTTGTCCATGCGGTTGTGGCG CGTTTTCGTCGGTAATCACCATTC GATCCGGTTACAACCTAACTTCTGTTGCTATCA GTGACTCGAGCGTTTTAGAATAGCAGGTACGAC GATCGGTTACAACCTAACTTCTGTTGCTATCTC

9 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 9/20 SacR gen PC2 spc2p SacR gen MFα sal1p sv5m gen V5 sal1p sv5m gen NP snp SacR gen Sag 1 SacF SacR GTGACTCGAGCGTTTTAGAATAGCAGGTACGAC GATCCGGTTACAACCTAACTTCTGTTGCTATCTTCAAC GTGACTCGAGCGTTTTAGAATAGCAGGTACGAC AGCTTACCATGAGATTTTTTCAATTTTTACTGCAG ACCCAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTAGGC AGCTTACCATGAGATTTTTTCAATTTTTACTGCAG ACCCAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTAGGC GATCCCTAACTATCTCCAACATGGACTGTCCAACTGAAG GTGACTCGAGCGTTTTAGAATAGCAGGTACGAC CATGAATTCGCTAGCGCCAAAAGCTCT GTGACTCGAGCGTTTTAGAATAGCAGGTACGAC Insert plasmidu psilencer 4.1 CMV neo primer F CGGTAGGCGTGTACGGTG primer B AGGCGATTAAGTTGGGTA pgeneclip specifické sekvenační primery (shodné s puc/m13) promega katalogové č: Q5391; Q5401 primer F GTTTTCCCAGTCACGAC primer B CAGGAAACAGCTATGAC Q5391; Q5401 pld : gen pro rostlinnou fosfolipázud (At4g ) pld forward GCA CCA AAG ATA CTG AAA TCG pld reverse GCC TAA ATG CTC TGC CCA TA pld gen pro rostlinnou fosfolipázud (At2g42010) pld forward GCA TTC TCC CCA CAA GAT TA pld reverse CTG CTT TTC CGA CTC AAC G pld gen pro rostlinnou fosfolipázud (At4g00240) pld forward AAC CCA TGA CGA GGA GAC AC pld reverse GAT GGT TCC AAC TTC CCT CT pld gen pro rostlinnou fosfolipázud (At4g11850, At4g11830, At4g11840). pld forward TCT GGG ATT CAA AAC ACA AGG pld reverse TGA TGC GTG TAG ATT GTT CCA pld forward TCG TGG AAT AGG GAA AGG AA pld reverse TCA ATA GAA CGG AAA ACC TGA AC

10 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 10/20 pld forward pld reverse RFP::MBD map4 forward map4 reverse TTG AGG AAC GCT GGA TGA AG GCT TCG GAA AGT CCC ATT AT GAC GAG CTG TAC AAG TCC CGG CAA GAA GAA ATG CGG CCG CAC CTC CTG CAG GAA A tua6: gen pro rostlinný tubulin alfa6 (At4g14960) tua6 forwardbamhi AGG ATC CAA TGA GAG AGT GCA TTT CGA TC tua6 reversesali AGT CGA CTT AGT ATT CCT CTC CTT CAT C tub6: gen pro rostlinný tubulin beta6 (At5g12250) tub6 forwardbamhi AGG ATC CAA TGA GAG AAA TCC TTC ACA TTC tub6 reversesali AGT CGA CTC ACT CAT GAT CCA ATA TCT CT fabd2: aktin vazebná doména rostlinného fimbrinu1 (AtFim1: At4g26700) mcherry fabd2forwspei GCA CTA GTC TCA TGA GTG GGT ACG TGG GTG TTG TCG fabd2revecori CGA CTA GTT CAT GAC TTC GAT GGA TGC TTC CTC TGA G mcherry: červeně fluoreskující protein z Discosoma sp. mcherry STOPforward HindIII TAA GCT TAT GGT GAG CAA GGG CGA GGA mcherry STOPreverseSalI AGT CGA CTT ACT TGT ACA GCT CGT CTA TG mcherry NONSTOPforXbaI TC TAG AAC AAT GGT GAG CAA GGG CGA GGA mcherry NONSTOP reverse BamHI AGG ATC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC gen HmMT1 (genomový klon) ghmmt1f CCAATCCCACCCCAAACCTCTTAC ghmmt1r AGTGAGACCGGGATGAATTGAGAGAGG gen HmMT1 (cdna) HmMT1F GCGGGATCCAAACATGCAATTCACTTCCAC HmMT1R TCGGAATTCGGTACAGCTTCAAGAGCAGTTG gen HmMT2 (genomový klon) ghmmt2f CTCCCAACTACTACAACCACATCACAT ghmmt2r GTCGGCCCTCACGACATTAAGTCCTTC gen HmMT2 (cdna) HmMT2F GCGGGATCCGATTATGCAGATCGTTCAAAACACC HmMT2R TCGGAATTCCTGAGCGCATTTAGCATTTGCA gen RaMT1 RaMT1F RaMT1R gen RaMT2 RaMT2F RaMT2R GCGGGATCCGATATCAAATCAATCACT TCGGAATTCCGCGCTGTTAAGCGAGCTGT GCGGGATCCATCCAACTAACTAACAACA TCGGAATTCCTTCATTCTTTCTCCACACG

11 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 11/20 gen AsMT2 Q4-F1 GWQ4-R1 gen RaZBP1 Cd3-eF Cd3-eR gen RaZBP2 Cd8-eF Cd8-eR gen RaZBP3 RaCd9 Cd9-eF Cd9-eR gen AsCTR1 qf6821 qr6821 gen AsCTR2 qf8189 qr8189 gen AsCTR3 qf8208 qr8208 gen AsCTR4 qf10424 qr10424 gen AsCRD1 qf1244 qr1244 gen AsCRD2 q10936-f q10936-r gen aldc Naldc-F Naldc-R 16S rrna gen 8F 926r CGCTTGTTTCCTTCGCTAACTG ATGAGGATATGGCTGTACAGTAG CATGGATCCATGCCCGCTCAA CTGACTCGAGGGGATTACTAA CATGGATCCATGTCCGCTCAA CTGACTCGAGGGGATTACTTA CTTGGATCCATGCCCGCTCAA CTGACTCGAGGGGATTACTAA TTTCGTTGGTGGCATATCTC GCATGCCATTGTGTGTCAAG CGCTGGAGCAAGAGGTTATC CGTAGGATCTCATGGGTTGG TTCCCAGTCAACAAGCACAG AACGTAAGTGCCGTTTGGAC ATCTCAAGTGGAGCGAGAGC GTACCCCAGCGTTTGAAGAC GCCGCAGATGTTGGTATTGC ACATCAATGCCCAAGCGAAG GTCTGTCGCCATCGAAGCTG CATTATAGACGCATGCCCAGATC GCGTTCACAATGGCAGTCCTGAAC CTTGTCAGTCATGATTTCAGGTATCCTG AGAGTTTGATCMTGGCTCAG CCGTCAATTCCTTTRAGTTT gen bphfg(bc)

12 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 12/20 BPHF-For BPHF-Rev gen bphae BPHD-f3 BPHD-r1 GGGCATATGAAATTTACCAGA CGCCTGCAGATGGTGTCGATCAT AACTGGAARTTYGCIGCVGA ACCCAGTTYTCICCRTCGTC AOX gen Pichia pastoris: 3'AOX1 GCAAATGGCATTCTGACATCC 5'AOX1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC Gen Pldef1 Reverse GGAATTCCATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACAGCA GCGGCCATATCGACGACGACGACAAGAAAACTTGTGAAAAC CTG CTTTTCCCCGCGGGGATTTTCAGCAGTTGCGGGTGCACCAG benzoátdioxygenasa 628f GARAAYGGHGCNGAYGGYTAYCA 1076r AARAARTCYTCRTAYTGRCG Gen cat chloramfenikolová rezistence cat-f129 AAGCATTCTGCCGACATGG cat-r129 GAAAGACGGTGAGCTGGTG gen QPF QPF-P1: SacR gen RaZIP34 RaZIP34-Fxx: RaZIP-H-5-5R-r gen RaZIP1 RaZIP1-F-EcoRI RaZIP1-R-SalI gen RaZIP2 RaZIP-D-HindIII-r RaZIPD-BamHI-f inzert QPF QPF-P1: SacR gen HmMT3 HmMT3F HmMT3R ATTCCCTCAACAGCCATTTCCTCAGCAACCTTTCCCT GTGACTCGAGCGTTTTAGAATAGCAGGTACGAC GTCATCCTCTCCACGGCATTTGTCCACCTC AAATGCCGTGGAGAGGATGACGCCTTTGAG GAACGAATTCCATTCGCTGTTCCCACAC GAACGTCGACCCTGCAATTGTCCTGACAAAC GAGTAAGCTTCTGCACCACGTTGTCACAC GATAGGATCCATGCTTGTCCGCTCACTCT ATTCCCTCAACAGCCATTTCCTCAGCAACCTTTCCCT GTGACTCGAGCGTTTTAGAATAGCAGGTACGAC GCGGGATCCTATGCAGATCGTTCAAAAGTC TCGGAATTCCGCATTTAACATTTGCACTC

13 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 13/20 gen RaCDF1 RaCDF1F RaCDF1R gen RaCDF2 RaCDF2F RaCDF2R gen RaCDF3 RaCDF3F RaCDF3R gen RaCDF4 RaCDF4F RaCDF4R CGCGGATCCATGTCTCCCTCACGTACTGC GGGAAGCTTGCGTGAGCTATGGTTCTGG CCGGAATTCATGCACTTTGGATTAAACGAC GGGAAGCTTTCAAACATGTTTTCGATGTTC CGCGGATCCATGGACCTGACAGATGCAAGAACG GGGAAGCTTGCTGGTTCTATCGTCGAAACGAG TCGGAATTCCAATGAACCTAGGGTATTCTGGAG GCGGGATCCGATAccgCAAGATGGTAGAGACC gen RaCDF1 (inzert s 5 -UTR a částí 3 -sekvence genu) primer AP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT RaCDF1-GW1 GGACAAAGAAGAGTAGGTCCAAGACGAGGAG gen RaCDF2 (inzert s 5 -UTR a částí 3 -sekvence genu) primer AP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT RaCDF2-GW1 GGACACTCTGCGTCTGCATCCG gen RaCDF3 (inzert s 5 -UTR a částí 3 -sekvence genu) primer AP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT RaCDF3-GW1 CACGCGAGGACGCGCATAAGAACC gen RaCDF4 (inzert s 5 -UTR a částí 3 -sekvence genu) primer AP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT RaCDF4-GW1 CATTCGCGCCCAATCCAACAAGCGTGACG gen AsAP-1 AsAP1_eF AsAP1_eR AsAP-1_eR_533 AsAP-1_eR_485 AsAP-1_eR_443 gen AsTLP AsTLP_eF AsTLP_eR gen RaACE1 RaACE1_eF RaACE1_eR gen RaACE2 RaACE2_eF RaACE2_eR CATAAGCTTGTCTCACCCATGGAGGCCTACC CTGAGTCGACATAGGACTCCTACAATGTAAC CTGAGTCGACTAGTCGGTGTCCTTGAACTTGG CTGAGTCGACTACAGCGCAGCTGGtAGGTTG CTGAGTCGACTAGTCGGTCTCGGACATTGG CATGAATTCGCgtGCGACATATGAAAATC CTAGCTCGAGTTACAAACCAGTATTCATGGGC CATGAATTCTCATAGCTTGTCTCCAACTAACTCC CTGACTCGAGATTATTCCGtGAGAGGcCCTAGTG CATGAATTCACACACAATGGTTCTCATCAGCGAC CTGACTCGAGTATGATCAAAATAACATCGAGCC

14 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 14/20 5 -UTR genu AsMT1a IF_prAsMT1a_F GAGTCGACCTGCAGGCATGCCATATGTTGTACTGTCTGAGCG IF_prAsMT1a_R CGGGATCGAAGCTTGCATGCATGATGTTTGTGTTGATG 5 -UTR genu AsMT1b IF_prAsMT1b_F GAGTCGACCTGCAGGCATGCTTCAATCCGCCCTAAACG IF_prAsMT1bc_R CGGGATCGAAGCTTGCATGCATGATGTTTGTATTGGTG 5 -UTR genu AsMT1c IF_prAsMT1c_F GAGTCGACCTGCAGGCATGCTTCCAAAGTATCCCTCTCAG IF_prAsMT1bc_R CGGGATCGAAGCTTGCATGCATGATGTTTGTATTGGTG 5 -UTR genu AsMT2 IF_prAsMT2_F GAGTCGACCTGCAGGCATGCGTTCTGGAATCTCTGAGTATTCG IF_prAsMT2_R CGGGATCGAAGCTTGCATGCATTGTAGTAGTTCGATACC 5 -UTR genu RaMT1 IF_prRaMT1_F GAGTCGACCTGCAGGCATGCGCAACCTCAAATTCTCCACG IF_prRaMT1_R CGGGATCGAAGCTTGCATGCATTGTTGTTAGTTAGTTGG 5 -UTR genu RaMT2 IF_prRaMT2_F GAGTCGACCTGCAGGCATGCCAAGACCCTGTGCACAAG IF_prRaMT2_R CGGGATCGAAGCTTGCATGCATAGTGATTGATTTGATATCG gen RaZAP1 RaZAP1F RaZAP1R TAGAACTAGTGGATCCATGGCTCGTCCAAGCCCACATT GCAGCCCGGGGGATCCGAATGACTTATTGCAGCCAGGT 5 -UTR/částečná 3 -CDS genu RaZAP1 primer AP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT RaZAP1-GW2 GACACACTGTTCGGTGCAGTGGTC 5 -UTR/částečná 3 -CDS genu RaZIP1 primer AP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT RaZIP1-GW1 GAGGCCTTTGAAGGCAGTGTCACC 5 -UTR/částečná 3 -CDS genu RaZIP2 primer AP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT RaZIP2-GW1 CCTAGAAGGAAACCGAGGAAG 5 -UTR genu RaCDF1 procdf1-in-f GAGTCGACCTGCAGGCATGCTGGCAACTCACGACTTGG procdf1-in-r CGGGATCGAAGCTTGCATGCATGAAGAGAGACGGGATTAG 5 -UTR genu RaCDF2 procdf2-in-f GAGTCGACCTGCAGGCATGCCCTTTGATCTTATCAAGTG procdf2-in-r CGGGATCGAAGCTTGCATGCATCTGTGTGCTCTCGACTGT

15 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 15/20 5 -UTR genu RaCDF3 procdf3-in-f GAGTCGACCTGCAGGCATGCCTGTGTCCAATATTCTTCC procdf3-in-r CGGGATCGAAGCTTGCATGCATGACGGGGTGTCATAGACT 5 -UTR genu RaCDF4 procdf4-in-f GAGTCGACCTGCAGGCATGCAACGGCCGTCTCGAGGCTAG procdf4-in-r CGGGATCGAAGCTTGCATGCATCTTGCGGTATCTATGTAG 5 -UTR genu RaZAP1 prozap1-in-f GAGTCGACCTGCAGGCATGCATCAAATTGAAATTATTG prozap1-in-r CGGGATCGAAGCTTGCATGCATGGCGTAAAGTGCGACCG Gen tpx1 Wars2 ATGGCTTCATTTAGCTATTTG TTCTTAACTATTCACAAATGCAC ATGGCGCTGTTCTCCGTGCGGAAG CTACAGAATCCCCACCAACTTCTTCACCTCCTCGAAC Nepřítomnost geneticky modifikovaných mikroorganismů v užívaných prostorách bude dokumentována odebráním vzorků a průkazem nepřítomnosti GMO nebo jejich produktů. (smotkem gázy navlhčeným sterilní vodou bude setřeno cca 50x50 cm plochy, gáza eluována malým množstvím vody a bude použita buď jako templát pro PCR s použitím primerů odvozených od sekvence insertu nebo k imunochemické detekci produktů transgenů). V případě positivních výsledků bude proveden dekontaminační proces za použití desinfekčního prostředku (viz g). Vzhledem k různorodosti vektorů a insertů používaných v laboratořích na Ústavu biochemie a mikrobiologie budou přesné postupy stanovení příslušných GMO uloženy u vedoucích laboratoří. n) Obce, případně osoby, kterým je havarijní plán předkládán podle 5 odst. 3 zákona. Kopie havarijního plánu bude předána odboru životního prostředí Obvodního úřadu městské části Praha 6 a hasičům. o) Správní úřady uvedené v 13 zákona a způsob jejich vyrozumění v případě havárie, popřípadě způsob varování občanů, v závislosti na místě havárie a jejich možných následcích. Vzhledem k charakteru práce na ÚBM a celkovému množství používaných GMO kultur v jednotlivých pokusech připadají v úvahu pouze havárie menšího rozsahu (kontaminovaná plocha 1-4 m 2 ). GMO používané na ÚBM jsou určeny k vědeckým a pedagogickým účelům a tudíž jejich případné rozšíření nebude mít škodlivý vliv na lidskou populaci a životní prostředí. V případě havárie bude ihned vyrozuměn telefonicky event. em vedoucí pracoviště, osoby zodpovědné za likvidaci havárie jmenovitě uvedené v bodě d) tohoto havarijního plánu a odborný poradce a bude zajištěna okamžitá dekontaminace. S ohledem na práci s GMO na ÚBM v kategorii rizika I a II a na předpokládané havárie pouze menšího rozsahu, a vzhledem k tomu že se pracuje s transgenními organismy určenými pouze k vědeckým účelům, jejichž případné rozšíření nemá škodlivý vliv na lidskou populaci nebude nutné při takovéto havárii vyrozumět instituce státní správy: Ministerstvo životního

16 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 16/20 prostředí, Ministerstvo zdravotnictví a Ministerstvo zemědělství, Česká inspekce životního prostředí a nebude také provedeno varování občanů. Havarijní plán Ústavu biotechnologie VŠCHT Praha pro práci s uzavřeným nakládáním s GMO a) Název organizace: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Právní forma: Veřejná vysoká škola Sídlo a identifikační číslo uživatele: Technická 5, Praha 6, IČO , DIČ CZ Jméno, příjmení a trvalý pobyt vedoucího ústavu: Prof. Ing. Karel Melzoch, CSc, Mezouň 159, Karlštejn Odborný poradce: Prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc. Vysoká škola chemickotechnologická v Praze, Technická 5, Praha 6, telefon: , fax: , demnerok@vscht.cz Osoby odpovědné za likvidaci havárie: Dr. Ing. Leona Paulová, Ing. Irena Kolouchová, PhD a Ing. Ivana Křížová, PhD, Vysoká škola chemicko- technologická v Praze, Technická 5, Praha 6, telefon: , fax: , leona.paulova@vscht.cz b) Přesný popis prostor, kde probíhá nakládání s GMO: Prostory ÚB VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6, místnosti č.: 117 a 117a (viz přiložený Plánek prostor pro uzavřené nakládání s GMO). GMO budou uchovávány v uzavřeném mrazicím boxu ve formě glycerolového roztoku. Veškeré vybavení pro práci s GMO (termostaty, třepačky, sušárna, laminární očkovací box, bioreaktory, mikroskop, průtokový cytometr, odstředivky) jsou umístěny v místnostech 117, 115, I01, K04. Všechny prostory, ve kterých probíhá nakládání s GMO, vyhovují kategorii rizika I. c) Plán pracoviště Plány laboratoří 117, 115, I01, K04 jsou nedílnou součástí tohoto Havarijního plánu - příloha č. 5c. d) Popis havárie, která může vzniknout v prostorách nebo místě, kde probíhá nakládání. Havárie, které se mohou vyskytnout v uzavřených prostorách, kde probíhá nakládání s GMO, mohou mít charakter obecný (např. požár, poškození vodovodního řádu) nebo související přímo s nakládáním s GMO (neplánovaný únik GMO v uzavřeném prostoru a mimo uzavřený prostor k práci s GMO vymezený). Dle závažnosti havárie budou okamžitě učiněna adekvátní opatření k její likvidaci. V případě požáru bude vypnut hlavní přívod elektriky a plynu (vyznačeno na plánku prostor pro uzavřené nakládání s GMO) a dle rozsahu požáru bude zvolen způsob hašení (pěnové hasicí přístroje, voda). Pracovníci jsou povinni se řídit interním požárním řádem. Při likvidaci požáru bude zohledněna práce s GMO a dle potřeby a situace bude pracoviště následně ošetřeno desinfekčním prostředkem (chlornan sodný 0,5-1%, Ajatin 0,5-2%). V případě poškození vodovodního řádu a vytopení laboratoře bude nejdříve uzavřen hlavní přívod vody, kultury GMO budou přeneseny do jiného uzavřeného prostoru a prostor bude přiměřeně asanován a vysušen. Při současném úniku GMO do prostředí budou použity desinfekční chemické prostředky a po ukončení asanace bude sledována přítomnost transgenů nebo jejich produktů metodami uvedenými v bodě j) havarijního plánu. Při neplánovaném úniku GMO na ÚKCHB je nutné brát do úvahy kategorii rizika. Pro celé pracoviště je navržena kategorie rizika A. Při úniku GMO zařazených

17 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 17/20 do této kategorie v uzavřeném prostoru i mimo něj nehrozí bezprostřední ohrožení zdraví lidí ani ohrožení životního prostředí a GMO je možno likvidovat postupem v laboratoři běžným (sterilace v parním sterilizátoru při 121 o C, 0,15 MPa, 50 min). Za havárie ve vlastním slova smyslu se nepovažují malé úniky GMO (několik mililitrů), při nichž uniklé GMO mohou být rychle a spolehlivě zlikvidovány. Za havárii je nutno považovat rozšíření GMO mimo laboratoře (chodby) určené k uzavřenému nakládání s GMO. Mohou nastat havárie následujícího typu: při přenosu nádob s transgenním materiálem např. z kultivační místnosti do sterilovny může dojít k rozlití většího objemu této kultury (např. 1litr). Zasažená místa je nutné s použitím ochranných rukavic vysušit, odpad zlikvidovat autoklávováním a místo ošetřit v dostatečném rozsahu dvěma typy desinfekčních roztoků: např. Ajatinem (0,5-2%) a následně chlornanem sodným (0,5-1%). e) Přehled možných následků havárie na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí a biologické rozmanitosti, včetně způsobů zjišťování těchto následků a účinné ochrany před nimi. Pedagogická a vědecká práce se na ÚBT VŠCHT Praha provádí s geny, u nichž nejsou známy nepříznivé následky na zdraví lidí či zvířat ani na biologickou diverzitu. K selekci transgenních organismů se používají geny s rezistencí k antibiotikům (např. zeocin), které jsou lokalizovány na extrachromosomálních vektorových plasmidech. Z toho vyplývá, že bez selekčního tlaku nejsou transgenní organismy zvýhodněny oproti netransgenním organismům. Naopak lze konstatovat, že přítomnost vektoru znevýhodňuje transgenní organismus v těchto podmínkách. K zamezení úniku transgenních organismů mimo uzavřený prostor a jejich šíření zejména při přepravě materiálu uvnitř objektu např. z kultivačních místností do místností na sterilaci jsou učiněna následující opatření: malé objemy budou přenášeny v plastikových uzavřených obalech, větší objemy v uzavřeném bioreaktoru opatřeném mikrofiltry Sartorius. f) Postupy detekce přítomnosti geneticky modifikovaných organismů nebo produktů: V případě kvasinky Pichia pastoris na Ústavu biotechnologie jsou z povrchů a prostředí odebírány vzorky, které jsou očkovány na selektivní YPD agar s obsahem zeocinu, protože rezistence k zeocinu je základním selekčním markerem, odlišujícím používané GMO od výchozích kmenů a ostatních mikroorganismů. Správné nastavení podmínek pozitivní selekce je kontrolováno paralelním očkováním referenčního kmene GMO. V případě pozitivní kultivace by byla identita GMO potvrzena nebo vyvrácena PCR analýzou. V případě bakterie Rhodococcus erythropolis na Ústavu biotechnologie jsou z povrchů a prostředí odebírány vzorky, které jsou očkovány na selektivní TSB agar s obsahem kanamycinu, protože rezistence ke kanamycinu je základním selekčním markerem, odlišujícím používané GMO od výchozích kmenů a ostatních mikroorganismů. Správné nastavení podmínek pozitivní selekce je kontrolováno paralelním očkováním referenčního kmene GMO. V případě pozitivní kultivace by byla identita GMO potvrzena nebo vyvrácena PCR analýzou. V případě bakterie Rhizobium radiobacter na Ústavu biotechnologie jsou z povrchů a prostředí odebírány vzorky, které jsou očkovány na selektivní LB agar s obsahem gentamicinu, protože rezistence ke gentamicinu je základním selekčním markerem, odlišujícím používané GMO od výchozích kmenů a ostatních mikroorganismů. Správné nastavení podmínek pozitivní selekce je kontrolováno paralelním očkováním referenčního kmene GMO. V případě pozitivní kultivace by byla identita GMO potvrzena nebo vyvrácena PCR analýzou.

18 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 18/20 g) Metody a postupy, použitelné ke zneškodnění geneticky modifikovaných organismů nebo produktů a dekontaminaci uzavřeného prostoru. K inaktivaci GMO v uzavřených prostorách a jejich následné dekontaminaci bude užito postupů odpovídajících typu a rozsahu kontaminace (chemické desinfekční prostředkychlornan sodný 0,5-1%, Ajatin 0,5-2%, germicidní lampy výkon 2x25W). Míra kontaminace a účinek desinfekčních prostředků bude zjišťován stěry kontaminované plochy (smotkem gázy navlhčeným sterilní vodou bude setřeno cca 50x50 cm plochy, gáza eluována malým množstvím vody a bude použita pro kultivace na selekční půdě obsahující antibiotikum zeocin) nebo bude použita buď jako templát pro PCR. V případě pozitivních výsledků bude dekontaminační proces opakován za použití vyšší koncentrace nebo dalšího desinfekčního prostředku. Odvoz deaktivizovaného odpadu je likvidován centrálně. Oligonukleotidy (všechny sekvence oligonukleotidů jsou zapsány v pořadí 5-3 ) Ribozomální podjednotka prokaryot TTGTACACACCGCCCGTC TTCGCCTTTCCCTCACGGTA β-actin RNA polymeráza II AGCCTCGCCTTTGCCGA CTGGTGCCTGGGGCG GCACCACGTCCAATGACAT GTGGGGGTGCTTGGATAA Ribozomální protein L13 CGGACCGTGCGAGGTAT : CACCATCCGCTTTTTCTTGTC Phosphobilinogen deaminasa GGCTGCAACGGCGGAA CCTGTGGTGGACATAGCAATGATT Erythromycinová resistence: GCGGAATGCTTTCATCCTAA GCGTGTTTCATTGCTTGATG Spectinomycinová rezistence: AATTTCCGCCAAAATGTCAG GGGATAGCGGGAATAAGCTC Tetracyklinová rezistence: CAAAGTTGCAGCCGAATACA GTATGATTCTCCGCCAGCAT Gen spo0a AGGCGCCTTTGCTTTATTTT

19 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 19/20 Gen ALB Gen ALB Gen ALB GGCAATAACTCTTGGTGCAGA GGCGCAGCTTGGTATTAGTC GGATCTGGCGGATCAGAATA TGTTCCGTTTTTGTTGGACA GGTGTTGGAGCCGTAAATGT TTTTGAAACAGCGTCAGCAC TGTCATAGATCCCCCAGCTC h) Metody pro izolaci prostor a zařízení zasažených havárií, včetně metod kontroly účinnosti izolace V případě úniku geneticky modifikovaných mikroorganismů bude vymezen zasažený prostor, výrazně označen a ohraničen (křídou, fixem, výstražné nápisy) a bude zamezen přístup osob. Prostor bude ošetřen 0,5-1% chlornanem sodných nebo 0,5-2% Ajatinem. Po chemické asanaci se kontaminovaná plocha ozáří germicidní lampou. Jednotlivé drobné předměty, které byly unikem zasaženy, budou sterilovány v parním sterilizátoru při 120 O C a přetlaku 0,15 MPa. Nepřítomnost geneticky modifikovaných mikroorganismů bude dokumentována odebráním vzorků z původně zasaženého místa a průkazem nepřítomnosti GMO nebo jejich produktů. i) Popis a nákres uložení asanačních prostředků použitelných ke zneškodnění předmětných geneticky modifikovaných organismů nebo produktů a dekontaminaci zasaženého prostoru. Koncentrovaný a naředěný roztok (0,5-1%) chlornanu sodného a koncentrovaný a naředěný roztok (0,5-2%) Ajatinu budou umístěny v označené skříni v laboratoři 117, 115, I01 a K04. Zde jsou také umístěny přenosné germicidní lampy. j) Postupy na ochranu zdraví člověka a zvířat a ochranu životního prostředí v případě nežádoucího ovlivnění vzniklou havárií, případně metod na zneškodnění nebo sanaci rostlin a zvířat, které se nacházely v oblasti v době havárie, v souladu se zvláštními právními předpisy. Při charakteru práce na ÚKCHB se nepředpokládá, že by používané GMO nežádoucím způsobem ovlivnily živé organismy nebo životní prostředí. K zneškodnění uniklého GMO budou použity metody uvedené v bodě j) tohoto Havarijního plánu. k) Popis postupu zajištění následného monitoringu prostor a pozemků po ukončení asanace Po ukončení asanace zasaženého prostoru bude účinnost dekontaminace zjišťována stěry kontaminované plochy (smotkem gázy navlhčeným sterilní vodou bude setřeno cca 50x50 cm plochy, gáza eluována malým množstvím vody a bude použita pro kultivace na selekční půdě obsahující antibiotikum). V případě pozitivní selekce je přítomnost potvrzena pomocí PCR analýzy a dekontaminační proces bude v případě nutnosti opakován. l) Obce, případně osoby, kterým je havarijní plán předkládán podle 5 odst. 3 zákona

20 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 20/20 Kopie havarijního plánu bude předána odboru životního prostředí Obvodního úřadu městské části Praha 6, územně příslušnému hasičskému sboru a krajskému úřadu. m) Správní úřady uvedené v 13 zákona a způsob jejich vyrozumění v případě havárie, popřípadě způsob varování občanů, v závislosti na místě havárie a jejich možných následcích. Vzhledem k charakteru práce na ÚKCHB a celkovému množství používaných GMO kultur v jednotlivých pokusech připadají v úvahu pouze havárie menšího rozsahu (kontaminovaná plocha do 2 m 2 ). GMO používané na ÚKCHB jsou určeny k vědeckým a pedagogickým účelům, a tudíž jejich případné rozšíření nebude mít škodlivý vliv na lidskou populaci a životní prostředí. V případě havárie bude ihned vyrozuměn telefonicky nebo em vedoucí pracoviště, osoby zodpovědné za likvidaci havárie jmenovitě uvedené v bodě d) tohoto havarijního plánu a odborný poradce a bude zajištěna okamžitá dekontaminace. S ohledem na práci s GMO na Ústavu biotechnologie v kategorii rizika I a na předpokládané havárie pouze menšího rozsahu, nebude nutné při takovéto havárii vyrozumět instituce státní správy: Ministerstvo životního prostředí, Ministerstvo zdravotnictví a Ministerstvo zemědělství, Česká inspekce životního prostředí a nebude také provedeno varování občanů. Vyjádření odborného poradce: Uzavřené nakládání s GMM, BL a s GMVR specifikovanými v návrhu a pro účely uvedené pro pracoviště Ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT Praha spadá podle 7 zákona 78/2004 Sb. do prvé "I" a druhé II kategorie rizika. Uzavřené nakládání pro pracoviště Ústavu biotechnologie VŠCHT Praha spadá podle 7 zákona 78/2004 Sb. do prvé "I" kategorie rizika v Praze Prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc. Odborný poradce