MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ. Agronomická fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2006 Petra PŘICHYSTALOVÁ

2 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Genetická variabilita mikrosatelitů u koní Bakalářská práce Brno 2006 Vedoucí bakalářské práce: Prof. Ing. Josef Dvořák, CSc. Vypracoval/a: Petra Přichystalová 1

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma.... vypracoval (a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně, dne Podpis studenta.. 2

4 Touto cestou bych ráda poděkovala vedoucímu mé bakalářské práce panu Prof. Ing. Josefu Dvořákovi, CSc. a mojí konzultantce Bc. Ireně Vrtkové za odborné rady a pomoc při zpracování mé bakalářské práce. 3

5 SHRNUTÍ V mé práci se zabývám problematikou detekce mikrosatelitů prostřednictvím metod molekulární genetiky s využitím DNA markerů a určením genotypů těchto mikrosatelitů. Tato metoda se stala důležitou pro identifikaci jedinců a ověřování jejich původu, přičemž nahradila původní metody ověřování rodičovství prostřednictvím proteinů krevního séra nebo krevně skupinových systémů. Mezinárodní společnost pro genetiku zvířat (International Society of Animal Genetics - ISAG) doporučila k užití pro ověřování parentity u koní 17 mikrosatelitních markerů (AHT4, AHT5, ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20, HTG6, HMS2, HTG7, ASB17, ASB23, CA425, HMS1, LEX3), které byly analyzovány pří výzkumu variability mikrosatelitních markerů. Jejich prostřednictvím lze potvrdit správného či vyloučit nesprávného rodiče. 4

6 SUMARY In my work I engaged in problematic of detection of microsatellites through molecular genetic s metods using DNA markers and determinate the genotypes of these microsatellites. This metod became important for individual s identification and verification of their pedigree, whereas it replaced original metods for parentage verification through blood serum s proteins or blood-group systems. International Society of Animal Genetics (ISAG) recommended to use for verification of horse parentity 17 microsatellite markers (AHT4, AHT5, ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20, HTG6, HMS2, HTG7, ASB17, ASB23, CA425, HMS1, LEX3), which were analysed at research of variability microsatellite markers. Through them it is possible to confirm, correct or exclude incorrect parent. 5

7 OBSAH 1. ÚVOD TEORETICKÝ ZÁKLAD PŮVODNÍ METODY OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ Proteiny krevního séra Krevní skupiny MOLEKULÁRNÍ GENETIKA MIKROSATELITY Obecná charakteristika mikrosatelitů Mikrosatelity u koní GENETICKÝ POLYMORFISMUS Polymorfismus DNA METODY PRO TESTOVÁNÍ POLYMORFISMŮ Izolace DNA Polymerázová řetězová reakce - PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Sekvencování ZÁKONNÝ PODKLAD STANOVENÍ GENETICKÉHO TYPU STANOVENÍ GENETICKÉHO TYPU OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ Ověřování rodičovství v praxi Pravděpodobnost odhalení nesprávně uváděné parentity URČENÍ GENETICKÉHO TYPU A OVĚŘENÍ PŮVODU U KONÍ DNA- TESTEM V PRAXI TEST Č.1: TEST Č.2: TEST Č.3: TEST Č.4: TEST Č ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA

8 1. Úvod Koně provázejí člověka již od nepaměti a snad žádné jiné zvíře nemělo pro lidskou společnost tak velký kulturní a hospodářský význam, jako právě kůň. Lidé si již před několika tisíci lety uvědomili jeho přínosy a proto věnovali jeho chovu velkou pozornost. Právě u koní se uplatnily první plemenářské metody, kterých se později začalo využívat i u jiných druhů hospodářských zvířat. Při moderním šlechtění je nevyhnutelné jednoznačně určit jejich rodokmen a původ. Metody ověřování rodičovství u koní a domestikovaných zvířat obecně mají za sebou letitou historii, která v sobě odráží vývoj živočišné genetiky jako vědy a konkrétní úroveň jejích poznatků v dané době. Od konce šedesátých let 20. století, kdy se datují začátky ověřování rodičovství zvířat, do počátku devadesátých let, vycházela kontrola správnosti původu zvířat z metody testování biochemického polymorfismu krevních skupin a proteinů krevního séra. V 21. století velmi rychle nastupují poznatky molekulární biologie a genetiky a proto se i v oblasti ověřování parentity uplatňují analýzy DNA. Metody molekulární genetiky, které umožňují s vysokou přesností určit rodičovství u zvířat jsou založené na testování DNA mikrosatelitů. Variabilita mikrosatelitních markerů v genomu koní je vysoká, a proto jsou tyto krátké tandemové repetice v současnosti nejpoužívanější a nejspolehlivější metodou ke genetické identifikaci jedinců a následně i k ověřování jejich původu. 7

9 2. Teoretický základ 2.1 Původní metody ověřování rodičovství Začátky ověřování rodičovství zvířat se datují od šedesátých let 20. století, kdy ověřování původu zvířat vycházelo ze dvou základních metod. Byly to metoda testování proteinů krevního séra a metoda biochemického polymorfismu krevních skupin. Nevýhodou ověřování parentity pomocí těchto dvou metod je to, že jsou zde nutné vzorky čerstvé, nesrážené krve. To způsobuje problémy s jejich dopravou do laboratoří. Navíc mají při kontrole rodičovství hodnotu pouze vylučovací. Tyto dvě metody se hojně používaly do počátku devadesátých let, v dnešní době jsou užívány pouze v omezené míře u jiných druhů zvířat (Dvořák,2002) Proteiny krevního séra Princip této metody vychází ze skutečnosti, že některé bílkoviny (albuminy, transferiny, kyselá fosfatáza, apod.) v krevním séru vykazují tzv. polymorfismus, což znamená, že se vyskytují v krvi jedinců v rámci druhu v různých, geneticky determinovaných formách, které se dědičně přenáší z rodičů na potomky. Existence polymorfního proteinu je vlastně konkretizovaný projev účinku genu. Pokud tedy nalezneme konkrétní formu bílkoviny u potomka, zákonitě ji musíme nalézt také u rodiče. Tato metoda sice ve své době jistě posloužila svému účelu, její rozlišovací schopnost však není příliš vysoká. Navíc při testu tohoto typu nezkoumáme gen jako takový, ale pouze jeho projev (Schröffelová,2002) Krevní skupiny Krevní skupiny se k ověřování rodičovství (parentity) využívaly již v šedesátých letech 20. století. K detekci krevních skupin správněji řečeno erytrocytárních antigenů slouží imunologické metody. Jejich základem je specifická reakce protilátky s antigenem. Oblast genetiky studující tuto problematiku dostala název Imunogenetika. U koní je uváděno 7 systémů. Největší heterogenitu má systém EAD. Zahrnuje jedenáct identifikovaných antigenních faktorů a 26 alel. Další krevně skupinový systém je EAA se sedmi faktory a dvanácti alelami. V pořadí třetí systém, co do vhodnosti pro 8

10 ověřování parentity, je EAP se čtyřmi faktory a osmi alelami. Se třemi antigennímí faktory a sedmi alelami je systém EAQ. Zbývající tři systémy EAC, EAK a EAU vykazují vždy pouze jeden antigen a dvě alely (Dvořák,2002). 9

11 2.2 Molekulární genetika Testování polymorfismu DNA mikrosatelitů, jenž je založeno na molekulární genetice, je v současnosti nejpoužívanější a nejspolehlivější metodou ke genetické identifikaci jedinců v populaci koní a následně i k ověřování jejich parentity. V 21. století velmi rychle nastupují poznatky molekulární genetiky a proto se i v oblasti ověřování parentity zvířat uplatňují analýzy DNA, přičemž se zjišťuje polymorfizmus DNA a zároveň se stanovují mikrosatelity. Molekulární genetika se zabývá studiem genů přímo zodpovídajících za přenos genetické informace z rodičů na potomstvo. Klíčem k pochopení principu těchto testů je existence DNA. Deoxyribonukleová kyselina tvoří materiální základ dědičnosti. Lze tedy říci, že v její molekule je zakódovaná kompletní informace o živém organismu. Tato informace pochází rovným dílem od obou rodičů, jak od matky, tak od otce. Molekulu DNA si lze představit jako dvojici stočených vláken (jedno pochází od otce, druhé od matky), které jsou tvořeny sledem nukleotidů (Adenin, Guanin, Cytosin a Thymin). Jejich pořadím je daný tzv. čtyřpísmenkový genetický kód. Nukleotidy AGCT sestavené v určitém pořadí tvoří sekvenci. Toto pořadí je u jedinců v rámci druhů podobné, avšak ne totožné, a proto pro každého jedince originální. I když zatím nikdo přesně neví proč, nalézáme mezi kódujícími sekvencemi oblasti, kde se najednou nelogicky opakuje krátký, 2-6 bázemi tvořený motiv, třeba GC několikrát za sebou. Čím je počet opakování motivu větší, tím je úsek delší a naopak. Tyto úseky DNA s různým počtem opakování motivů nazýváme mikrosatelity. Jejich délky se u jedinců v rámci druhů liší, tj. jsou, podobně jako výše uvedené sérové proteiny, polymorfní (Schröffelová,2002). Výhody molekulárně genetické metodologie jsou: - zdrojem DNA pro analýzy mohou být vedle krve (může být i zmražená) např. sperma, chlupové cibulky nebo malý kousek jakékoli tkáně zvířete - polymorfismus DNA je o několik řádů vyšší než u proteinů - DNA lze uchovávat dlouhou dobu a je tak možné provést opakované ověření - využívá jednotnou technologii analýzy, která je ve velké míře automatizovaná 10

12 - DNA polymorfismus poskytuje nesčetné varianty, minisatelitních a mikrosatelitních sekvencí, takže jeho hodnota je téměř identifikační (Dvořák,2002). 11

13 2.3 Mikrosatelity Obecná charakteristika mikrosatelitů Mikrosatelitní DNA neboli mikrosatelity, také nazývané STR (short tandem repeats krátká tandemová opakování), jsou krátké tandemové repetice složené z mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidových motivů. Jinak řečeno, jsou to segmenty DNA, ve kterých se mnohokrát opakují specifické motivy nukleotidových sekvencí. Základem těchto repetitivních úseků jsou sekvence o velikosti od 1 do 4 až 6 bazických párů. Složení elementů mikrosatelitů určitých bází DNA (např. CA) se nazývá mikrosatelitní motiv. Četnost následného opakování těchto elementů (např. GA, CTA) je v desítkách až stovkách. Blok opakujících se mikrosatelitních elementů, např. tandemová repetice 215-ti motivů CTA, (CTA) 215 se označuje termínem mikrosatelitní jednotka (Dvořák,2002). Významným znakem mikrosatelitů je vysoký stupeň polymorfismu způsobený variabilním počtem tandemových repetic (obvykle 10-30). Polymorfismus mikrosatelitů lze rychle a spolehlivě testovat pomocí PCR a PAGE. Z toho důvodu jsou mikrosatelity vhodnými markery pro vazbové mapování genů a studium diversity, včetně určování rodičovství (parentity) (Knoll, Vykoukalová, 2002) Mikrosatelity u koní Při moderním šlechtění je nevyhnutelně nutné určit rodokmen a původ zvířat. Existuje několik metod, které je možné uplatnit při identifikaci zvířat: popis barvy a odznaků, analýza krevní skupiny, použití mikročipů nebo výžehů. Využívání mikrosatelitů se stalo důležitou metodou pro ověřování rodičovství. V populaci koní je možné použitím 17 mikrosatelitních markerů identifikovat jednotlivá zvířata. Při výzkumu týkajícím se variability mikrosatelitních marekrů v genotypech koní se analyzovalo 17 mikrosatelitních marekrů (ATH4, ATH5, ASB2, ASB17, ASB23; HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7; HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, VHL20, CA425, LEX3), které doporučuje mezinárodní společnost pro genetiku zvířat (International Society of animal genetics - ISAG). Vypočítávaly se alelové frekvence, polymorfní informační obsah, pravděpodobnost vyloučení z parentity a teoretická heterozygotnost (Burócziová,2005). 12

14 V koňském genomu je jeden z nejhojněji zastoupených repetičních motivů (TG)n motiv, který vykazuje značně velký stupeň polymorfismu a jeho frekvence je odhadována zhruba 1 na bp v genomu koní. Oproti tomu frekvence (TC)n repetic je vůči zmíněným (TG)n repeticím daleko nižší, i když jsou zhruba stejně polymorfní (Hamanová). Například jedním z prvně objevených mikrosatelitů u koní je HTG6, který se skládá ze dvou neustále se opakujících bází: T a G, přičemž počet opakování mikrosatelitního motivu se liší od 4 do26 (Bowling, 1996). U koní se genotyp mikrosatelitů uvádí velkými písmeny, přičemž jednotlivá písmena charakterizují určitou alelu. Spolehlivost ověřování původu prostřednictvím mikrosatelitního panelu v případě, že je stanoven nebo znám genetický typ otce, matky a potomka je 99,99% (Burócziová,2005). Tab.č.1: 12 mikrosatelitních markerů Lokus Chromozom Sekvence primeru VHL CAA GTC CTC TTA CTT GAA GAC TAG-3 5 -AAC TCA GGG AGA ATC TTC CTC AG-3 HTG CTA TCT CAG TCT TGA TTG CAG GAC-3 5 -CTC CCT CCC TCC CTC TGT TCT C -3 HTG CCT GCT TGG AGG CTG TGA TAA GAT-3 5 -GTT CAC TGA ATG TCA AAT TCT GCT-3 HTG CCT GAA GCA GAA CAT CCC TCC TTG-3 5 -ATA AAG TGT CTG GGC AGA GCT GCT -3 HTG CAA TTC CCG CCC CAC CCC CGG CA-3 5 -TTT TTA TTC TGA TCT GTC ACA TTT -3 AHT AAC CGC CTG AGC AAG GAA GT-3 5 -GCT CCC AGA GAG TTT ACC CT-3 AHT ACG GAC ACA TCC CTG CCT GC-3 5 -GCA GGC TAA GGG GGC TCA GC-3 ASB CCA CTA AGT GTC GTT TCA GAA GG-3 5 -CAC AAC TGA GTT CTC TGA TAG G-3 HMS2 5 -CTT GCA GTC GAA TGT GTA TTA AAT G-3 5 -ACG GTG GCA ACT GCC AAG GAA G-3 HMS CCA ACT CCT TGT CAC ATA ACA AGA-3 5 -CCA TCC TCA CTT TTT CAC TTT GTT-3 HMS GAA GCT GCC AGT ATT CAA CCA TTG-3 5 -CTC CAT CTT GTG AAG TGT AAC TCA-3 HMS CAG GAA ACT CAT GTT GAT ACC ATC TGT TGT TGA AAC ATA CCT TGA CTG T -3 13

15 Tab.č.2: Panel mikrosatelitů u koní MS Nejčastější alely Označování alel -počet VHL 7 ILMNOQR HTG4 5 GLMNO HTG6 4 GJOP HTG7 4 KMNO HTG10 9 IKLMOPQRS ATH4 5 HJKMO ATH5 5 JKMNO HMS2 5 HKLMR HMS3 6 IMNOPR HMS6 5 KLMOP HMS7 6 JKLMNO 14

16 2.4 Genetický polymorfismus Polymorfismus může být v genetice definován jako výskyt více než dvou alternativních alelických variant určitého genu v populaci. Jestliže se v genu vyskytnou 2 alternativní alely, hovoříme o jednoduchém alelismu. Základem genetického polymorfismu je mnohočetný alelismus.(dvořák et al., 1992) Tento pojem je používán již od roku 1940, kdy jej Ford a kolektiv definovali jako existenci více než jedné normální alely v jednom genetickém lokusu, převyšující svým výskytem 1% výskyt v populaci (nejméně 2% heterozygotů v populaci) (ucebnice.euromise.cz ). Na základě dodržení této hranice můžeme polymorfismus rozdělit do dvou skupin (Dvořák et al.,1992): 1) mutační formy- nedostaly se do populace a četnost výskytu je menší jak 1% 2) populační formy- v populaci jsou zastoupeny více než dvě alternativní genetické formy a další možnost se vyskytuje ve frekvenci vyšší než 1%. Široký pojem genetického polymorfismu lze podle objektu studia členit do několika skupin - na polymorfismus biochemický, imunologický, morfologický a polymorfismus DNA. V rámci této práce se budeme zabývat posledním z nich ( Polymorfismus DNA Polymorfismus DNA mikrosatelitů lze využít k mapování genomu, konstrukci chromozomových map a ověřování parentity. Je dán opakováním různého počtu elementů (např. CT) v mikrosatelitní jednotce, jinak řečeno délkou mikrosatelitní jednotky repetitivních motivů. Dědičnost její délky (velikosti) je jednoduchá, mendelistická a kodominantní. V určitém mikrosatelitním lokusu jsou v genomu jedince přítomny 2 mikrosatelitní jednotky (2 alely mikrosatelitů). Jedinec může mít obě alely (mikrosatelitní jednotky): stejně dlouhé = homozygotní typ různě dlouhé = heterozygotní typ (Dvořák,2002) 15

17 Variabilita na úrovni DNA je zpravidla způsobená bodovou mutací v sekvenci nukleotidů nebo různým počtem opakování nukleotidových motivů. Z tohoto hlediska můžeme polymorfismus DNA rozdělit na: 1) bodový polymorfismus - je způsoben změnou v sekvenci bází, nejčastěji bodovou mutací (většinou záměna nukleotidu nebo delece několika bází) v určitém místě DNA. 2) repetitivní polymorfismus - jedná se o sekvence, které se v genomové DNA vyskytují v mnoha kopiích (narozdíl od jednotkových, které jsou v genomu přítomny v jedné nebo několika málo kopiích). Satelity přítomné na určitém místě v genomu mohou mít v rámci populace různý počet opakujících se bází a různou délku. Podle toho rozlišujeme (Lupečková, 2001): a) mikrosatelity - jsou tvořeny 1-4 bp b) minisatelity - sekvence jsou dlouhé bp 16

18 2.5 Metody pro testování polymorfismů Metody pro testování polymorfismů jsou založeny na několika po sobě následujících krocích: izolace DNA, polymerázová řetězcová reakce (PCR), RFLP a sekvencování Izolace DNA DNA lze teoreticky izolovat z jakékoliv tkáně obsahující nativní buňky (z krve, chlupových cibulek, kůže,...). Ve většině případů se používá klasická metoda využívající enzym proteinázu K a organická rozpouštědla fenol a chloroform. Digesce (vyluhování tuhé látky dávkami rozpouštědla za tepla) proteinázou K probíhá ve speciálním pufru, jehož složení brání rozkladu DNA. Vzniklá směs se dále promíchá s fenolem a chloroformem a po centrifugaci se vytvoří dvě jasně oddělené fáze. Nahoře ve vodní fázi bude DNA a dole nebo na rozhraní fází budou zbylé složky lyzátu. Vodní fáze se oddělí a extrakce se ještě jednou zopakuje, tentokrát však jen s chloroformem, čímž se odstraní zbytky fenolu. Vodní fáze se opět oddělí a DNA se vysráží čistým lihem. Takto získaná DNA je následně použita jako templát pro PCR (Zima et al., 2004). V dnešní době jsou ale pro izolaci DNA nejvíce používány komerčně vyráběné soupravy (kity) Polymerázová řetězová reakce - PCR Polymerázová řetězová reakce patří mezi základní molekulárně-genetické metody, které slouží k získání dostatečného množství DNA pro další analýzy (přičemž množství původního vzorku DNA může být extrémně malé - teoreticky i jediná molekula). Tuto metodu poprvé popsali v roce 1985 Saiki a Mullis, přičemž v roce 1987 ji nechali patentovat (Knoll, Vykoukalová, 2002). Pro genotypizaci mikrosatelitních lokusů i proteinových markerů je standardně využívána metoda polymerázové řetězcové reakce a polymorfismu délky restrikčních fragmentů (PCR/RFLP). Polymerázová řetězová reakce je metoda, která slouží k získání dostatečného množství specifické DNA pro další analýzy (např. RFLP). PCR je založena na extenzi primerů a enzymatické amplifikaci (namnožení) molekul DNA za cyklického opakování tří kroků lišících se pouze teplotními podmínkami. 17

19 Syntéza DNA, dle matricové DNA neboli templátu, je katalyzována tepelně rezistentním enzymem, např. Taq polymerázou. K syntéze komplementárních vláken dochází prodlužováním dvou primerů, jednořetězových oligonukleotidů. Umístění obou primerů tak ohraničuje namnožený úsek DNA. Každý PCR cyklus se skládá ze tří teplotních fází: 1) Denaturace, při které je dvouvláknová DNA denaturována na dvě jednovláknové templátové molekuly DNA. Probíhá při teplotě 90-95ºC po dobu 45 sekund 2) Annealing, neboli navázání primerů na namnoženou DNA. Tato fáze je z celého procesu nejdůležitější, protože na správném navázání primerů závisí úspěch celé PCR. Při ní se teplota obvykle pohybuje mezi 45 a 60ºC a doba trvání je asi 30 sekund 3) Extenze (elongace), kdy dochází k syntéze nových řetězců, navazujících na 3 konce primerů. Tato reakce je katalyzována Taq polymerázou při teplotě 72ºC a doba trvání této fáze závisí na délce syntetizovaného fragmentu (White, 1997) Amplifikace DNA má exponenciální charakter, protože v každém cyklu se množství templátové DNA zdvojnásobí. K dosažení požadovaného množství cílových úseků DNA je tedy nutno asi 30 až 50 cyklů (Knoll, Vykoukalová, 2002). 18

20 Obr. 1 Schéma PCR Jako optimalizace PCR je označován proces výběru a testování nejvhodnějších parametrů, které mohou ovlivnit reakci. Může to být například složení reakční směsi, dále teplotní nebo časový průběh reakce (Knoll, Vykoukalová, 2002) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Polymorfismus v délce restrikčních fragmentů zahrnuje enzymatické štěpení fragmentu DNA (PCR produktu) restrikčními endonuklázami enzymy, které se specificky vážou na DNA a štěpí ji ve specifických místech uvnitř nebo blízko rozpoznávací sekvence nukleotidů. Rozlišují se tři skupiny restrikčních endonukleáz: I., II. a III. Endonukleázy I. a III. typu nemají přesnou polohu štěpení vzhledem k rozpoznávací sekvenci, proto se běžně nepoužívají. V molekulární genetice jsou významné endo-nukleázy II. typu, které štěpí vždy v rozpoznávací sekvenci a nebo v její těsné blízkosti (Knoll, Vykoukalová, 2002). Vzniklé DNA fragmenty jsou různé velikosti a následně jsou elektroforeticky 19

21 separovány v agarózovém gelu. Viditelnost DNA fragmentů a následné zjištění polymorfismů umožňuje přídavek ethidium bromidu do gelu (Zima et al., 2004) Sekvencování Sekvencování je metoda, při níž se stanovuje přímo sekvence nukleotidů DNA. Většina sekvenčních metod je založena na enzymatické reakci. Do sekvenční reakce se dává směs normálních nukleotidů s modifikovanými nukleotidy (dideoxynukleotidy ddntp), které nemají OH skupinu nutnou pro navázání dalšího nukleotidu. Jejich zařazením do řetězce DNA se reakce zastaví. Tak jsou získány fragmenty různé délky končící vždy příslušným ddntp. Posloupnost bazí se vyhodnocuje po separaci na polyakrylamidovém gelu nebo kapilární elektroforézou. Značení při sekvenční reakci se provádí radioaktivně, stříbrem nebo fluorescenčně. Pro sekvencování se využívá automatických sekvenátorů vycházejících z klasické nebo termální cyklické reakce a založené na gelové či kapilární elektroforéze (Knoll, Vykoukalová,2002). 20

22 2.6 Zákonný podklad stanovení genetického typu Zákon 154/2000Sb. O šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat a o změně některých souvisejících zákonů (plemenářský zákon) přikazuje stanovovat genetický typ a ověřovat původ některých kategorií zvířat. Vyhláška MZe 357/2001Sb. vyžaduje pro označení koní slovní a grafický popis ve spojení s výžehem nebo se stanovením genetického typu, přičemž genetický typ musí být povinně stanoven u hřebců vybraných pro plemenitbu. Výsledek ověření původu nebo stanovení genetického typu se vyjadřuje podle 29, odstavce (2), vyhlášky č. 471/2000Sb. (Přibáňová, 2005). 21

23 2.7 Stanovení genetického typu Pro stanovení genetického typu koní platí dle dohody Mezinárodní společnosti genetiky zvířat (ISAG) minimální standardní sada mikrosatelitů. Ta obsahuje sedmnáct mikrosatelitních markrů: AHT4, AHT5, ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20, HTG6, HMS2, HTG7, ASB17, ASB23, CA425, HMS1, LEX3. Tyto mikrosatelity povinně testují všechny laboratoře, takže výsledky jsou mezinárodně porovnatelné. Je-li tedy zvíře importováno ze zahraničí, kde již bylo testováno, je jeho test použitelný pro potřeby ověřování původů i v ČR a není nutné jej přetestovávat (Přibáňová, 2005). 22

24 2.8 Ověřování rodičovství Podstata ověření spočívá v tom, že jedno z vláken DNA u potomka musí obsahovat mikrosatelit s otcovskou délkou a druhé vlákno s mateřskou délkou úseku. Pokud je délka mikrosatelitu u potomka jiná, než u udávaných rodičů, nejedná se o jejich potomka. Ke genetické identifikaci a následnému ověřování rodičovství se vybírají mikrosatelity s délkou bp (bp = pár bází, např. GC). Dva nepříbuzní jedinci mohou mít v genetické výbavě úseky o stejné délce. Proto musíme k průkaznému ověření původů prověřit několik mikrosatelitních oblastí (obvykle 10-12), aby se zvýšila pravděpodobnost vyloučení nesprávného původu. Frekvence výskytu mikrosatelitů o stejné délce je samozřejmě vyšší v rámci stejného plemene a velice vysoká při úzké příbuzenské plemenitbě. Pokud je původ potomka označený jako nesouhlasný, je to výsledek takřka stoprocentní. Souhlasný původ lze v závislosti na stupni příbuzenské plemenitby deklarovat s přesností přibližně 96 %. Pravděpodobnost vyloučení falešného potomka v případě, že je testován pouze jeden s rodičů, se snižuje zhruba o třetinu. Délky testovaných mikrosatelitů se odečítají laserovou technologií ve vysoce kvalitním automatickém sekvenátoru a vyhodnocují se pomocí přesných počítačových programů (Schröffelová,2002) Ověřování rodičovství v praxi K provedení testu je nutná jaderná tkáň testovaných zvířat. Nejběžnější a rutinně používané je malé množství nevysrážené krve, ale lze použít i semeno samců, kůži, chlupové cibulky nebo stěr bukální sliznice. Z tohoto materiálu se izoluje vzorek DNA. V něm se pomocí přesně definovatelných a opakovatelných postupů namnoží požadované úseky DNA - mikrosatelity. Jejich délky se pak měří na automatickém sekvenátoru. Takto získané genetické profily potomka a jeho rodičů se posléze porovnávají. Z porovnání naměřených délek mikrosatelitů následně vychází jednoznačný závěr ve smyslu odsouhlasení nebo zpochybnění správnosti původu zvířete. Izolovanou DNA lze v laboratoři uchovávat desítky let a test v případě potřeby opakovat. Již stanovené genetické profily otestovaných zvířat se uchovávají v databázi a je kdykoliv možné je použít ke srovnání s jiným známým genetickým profilem. To umožňuje ihned identifikovat zvíře a kdykoliv testovat nové potomstvo již otestovaných 23

25 rodičů. Test není nutno opakovat ani v případě, že se původní potomek sám stane rodičem (Schröffelová,2002) Pravděpodobnost odhalení nesprávně uváděné parentity Mikrosatelity mají velkou variabilitu (polymorfizmus) a je jich známo řádově statisíce (tzn. jsou poznány primery, s nimiž lze amplifikovat určitý úsek DNA s mikrosatelity). K vyhodnocování jejich spolehlivosti jsou sestaveny různé rovnice. Ke zhodnocení efektivnosti vybraných mikrosatelitů pro různé varianty podkladových informací slouží následující rovnice: Pravděpodobnost vyloučení nesprávného rodiče, je-li znám genotyp potomka a obou rodičů PE1 (Paternity exclusion) PE(1) = k 1 2 x i 2 i= k x i i= 1 k + x i= 1 i 4 Pravděpodobnost vyloučení nesprávného rodiče, je-li genotyp jednoho z rodičů neznámý PE2 (One parental genotyp unavailable) k PE(2) = 1 4 x i k k x i + 4 i= 1 i= 1 x i 3 k 3 x i= 1 i= 1 2 i 4 Pravděpodobnost vyloučení obou rodičů, je-li znám genotyp potomka a obou rodičů PE3 (Parentage exclusion exclude both parents) k PE(3) = x i 4 4 x i 5 3 x i 6 8 i= 1 k i= 1 k i= k x i i= 1 k + 8 i= 1 x i 2 k i= 1 x i k i= 1 x i 3 2 Platí, že PE(3) > PE(1) > PE(2) 24

26 Pravděpodobnost vyloučení nesprávného jedince s využitím celého panelu CEP (Combined exclusion probability): CEP = 1 (1- PE 1 )(1- PE 2 )(1- PE 3 ) (1- PE k ) (Dvořák, 2002) 25

27 3. Určení genetického typu a ověření původu u koní DNAtestem v praxi Cílem mé práce bylo mimo jiné i vyhodnocení správnosti určení genetického typu a ověření původu u testovaných koní. Obdržela jsem výsledky tří následujících testů: TEST č.1: Otec / Hřebec: Caletto III (č.202/04) Matka / Klisna: Vilma (č.1191/05) Potomek: Velehrad (č. 1153/05) MS genotyp Otce / 202/04 Matky / 1191/05 Potomka / 1153/05 ATH 4 H/O J/O H/O ATH 5 K/M M/O M/M HMS 1 J/M I/M I/M HMS 2 H/R J/K J/R HMS 3 I/Q I/M I/P HMS 6 K/M M/N M/M HMS 7 L/O J/L J/L HTG 4 K/L L/P K/L HTG 6 J/O I/J J/O HTG 7 N/O O/O N/O HTG 10 K/M O/R K/O VHL 20 M/O I/I I/O ASB 2 N/N N/P N/P ASB 17 ASB 23 CA 425 LEX 3 R/R S/U J/J N/N Při porovnání genotypů všech tří jedinců bylo zjištěno, že testovaný jedinec (Velehrad, č.1153/05) je potomek uvedených rodičů. 26

28 TEST č.2: Otec / Hřebec: Caletto III (č. 202/04) Matka / Klisna: Astra (č.463/05) Potomek: Arnošt (č.1155/05) MS genotyp Otce / 202/04 Matky / 463/05 Potomka / 1155/05 ATH 4 H/O J/J J/O ATH 5 K/M J/M J/K HMS 1 J/M J/M J/J HMS 2 H/R J/L H/L HMS 3 I/Q I/N I/Q HMS 6 K/M P/P K/P HMS 7 L/O J/N J/O HTG 4 K/L M/M K/M HTG 6 J/O O/O J/O HTG 7 N/O O/O O/O HTG 10 K/M K/S M/S VHL 20 M/O L/M L/O ASB 2 N/N M/N M/N ASB 17 N/R G/R ASB 23 I/J J/U CA 425 J/N J/J LEX 3 M/P M/M Při porovnání genotypů všech tří jedinců bylo zjištěno, že testovaný jedinec (Arnošt, č.1155/05) je potomek uvedených rodičů. 27

29 TEST č.3: Otec / Hřebec: Caletto III Matka / Klisna: Fantasie (č.1192/05) Potomek: Fanošek (č.1154/05) MS genotyp Otce / 202/04 Matky / 1192/05 Potomka / 1154/05 ATH 4 H/O J/L J/O ATH 5 K/M K/M J/K HMS 1 J/M M/M J/M HMS 2 H/R J/L L/R HMS 3 I/Q I/R I/- HMS 6 K/M L/P K/M HMS 7 L/O J/L O/O HTG 4 K/L K/M K/M HTG 6 J/O J/J O/O HTG 7 N/O O/O M/O HTG 10 K/M I/K I/K VHL 20 M/O I/L M/R ASB 2 N/N N/O I/N ASB 17 ASB 23 CA 425 LEX 3 G/G I/K N/O N/N Při porovnání genotypů všech tří jedinců bylo zjištěno, že testovaný jedinec (Fanošek, č. 1154/05) není potomek uvedených rodičů. 28

30 Poté co jsem zjistila negativní výsledek testu č. 3 mi bylo sděleno, že mohlo dojít k záměně hříběte. Z toho důvodu mi byl předložen k vyhodnocení nový test. TEST č.4: Otec / Hřebec: Caletto III Matka / Klisna: Fantasie (č.1192/05) Potomek: Fanošek (č.1226/05) MS genotyp Otce /204/04 Matky / 1192/05 Potomka / 1226/05 ATH 4 H/O J/L J/K ATH 5 K/M K/M K/K HMS 1 J/M M/M I/M HMS 2 H/R J/L L/L HMS 3 I/Q I/R N/R HMS 6 K/M L/P P/P HMS 7 L/O J/L J/L HTG 4 K/L K/M K/M HTG 6 J/O J/J G/J HTG 7 N/O O/O K/O HTG 10 K/M I/K L/O VHL 20 M/O I/L L/N ASB 2 N/N N/O O/O ASB 17 ASB 23 CA 425 LEX 3 M/Q J/S J/N I/I Při porovnání genotypů všech tří jedinců bylo zjištěno, že testovaný jedinec (Fanošek, č. 1226/05) opět není potomek uvedených rodičů. 29

31 Po vyhodnocení testu č. 4, který byl opět negativní, jsem obdržela jiný test (č.5), přičemž testovaný potomek měl být po jiném otci, než byl původně uváděn. TEST č.5 Otec / Hřebec: Great Pleasure (č. 190/04) Matka / Klisna: Fantasie (č.1192/05) Potomek: Fanošek (č.1226/05) MS genotyp Otce /190/04 Matky / 1192/05 Potomka /1226/05 ATH 4 H/K J/L J/K ATH 5 K/N K/M K/K HMS 1 I/M M/M I/M HMS 2 H/L J/L L/L HMS 3 I/N I/R N/R HMS 6 L/P L/P P/P HMS 7 L/L J/L J/L HTG 4 K/M K/M K/M HTG 6 G/O J/J G/J HTG 7 K/N O/O K/O HTG 10 K/O I/K L/O VHL 20 I/N I/L L/N ASB 2 O/O N/O O/O ASB 17 ASB 23 CA 425 LEX 3 M/Q J/S J/N I/I Při porovnání genotypů všech tří jedinců jsme zjistili, že testovaný jedinec (Fanošek, č. 1226/05) je potomek uvedených rodičů. 30

32 5. Závěr V této bakalářské práci jsou, dle zadání, zpracovány literární podklady na téma Genetická variabilita mikrosatelitů u koní, je vysvětlen termín mikrosatelit a přiblížena původní metodologie ověřování rodičovství vycházející z testování proteinů krevního séra a krevně skupinových systémů. Je zde také popsána základní problematika detekce mikrosatelitů prostřednictvím novodobé metody molekulární genetiky s využitím DNA markerů. Dále je v rámci teoretických základů uvedena část týkající se určování genetického typu a ověřování původu jedinců. Na ni pak navazuje část praktická. Při jejím zpracování byly porovnávány genotypy mikrosatelitů potomka s genotypy mikrosatelitů potenciálních rodičů. Na základě zjištěných výsledků, které se týkaly potvrzení správného či vyloučení nesprávného rodiče, jsme si ověřili vhodnost využití mikrosatelitních panelů pro identifikaci jedinců a ověřování parentity u koní. Je zřejmé, že využívání této metody je opodstatněné a v dnešní době má nezastupitelnou roli v moderním šlechtění. 31

33 6. Použitá literatura BOWLING, A.T. Horse genetics. Wallingford, 1996, ISBN , s BURÓCZIOVÁ, M., ČERMÁKOVÁ, J., DVOŘÁK, J. Využitie DNA-mikrosatelitov pri overování pôvodu koní. In MendelNet Agro 05, Proceedings of Ph.D. students conference, MZLU Brno, ISBN X. 2005, s DVOŘÁK, J., ČEPICA, S., DVOŘÁK, P., HRUBAN,V., KUCIEL, J., MÁCHA,J., RUBEŠ, J., Genetika hospodářských zvířat(scriptum). MZLU Brno,1992, ISBN , s. 95 DVOŘÁK, J., PUTNOVÁ, L., VRTKOVÁ, I. Ověřování parentity u prasat, skotu a koní. MZLU Brno, KNOLL, A, VYKOUKALOVÁ, Z. Molekulární genetika zvířat (scriptum). MZLU Brno, ,10-13,23,29 s. ISBN SCHRÖFFELOVÁ, D. Můj táta? Kde je a kdo ho zná? Svět Myslivosti, 2001, roč.2, č. 4, s. 18. WHITE, B.A. PCR cloning protocols. Totowa, New Jersey : [s.n.], ISBN , s.3-4 ZIMA, J., MACHOLÁN,M., MUNCLINGER, P., PIÁLEK, J. Genetické metody v zoologii. Praha : [s.n.], ISBN , s , Internetové zdroje HAMANOVÁ, K. Polymorfismus DNA se zaměřením na mikrosatelity u koní [online]. [cit ] Dostupný z WWW: < LUPEČKOVÁ, I. Genetický polymorfismus, [online]. 2001[cit ]. Dostupný z WWW:,< plemene.htm 32

34 PŘIBÁŇOVÁ, M. Zákonný podklad stanovení genetického typu_id=174 [online] [cit ]. Dostupný z WWW: < < ion=biostat2&node=38>. < 33