UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BOTANIKY A EKOLOGIE DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 UIVERZITA KARLVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V RADCI KRÁLVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BTAIKY A EKLGIE DIPLMVÁ PRÁCE eurotropní a antioxidační aktivita vybraných druhů jednoděložných alkaloidních rostlin eurotropic and antioxidative activity in vitro of monocotyledonous alkaloidal plants. Vedoucí katedry: prof. RDr. Luděk Jahodář, CSc. Vedoucí diplomové práce: Ing. Lucie Cahlíková, Ph.D. radec Králové, srpen 2011 Stanislav Zavadil

2 PRLÁŠEÍ Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracoval samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. radec Králové, srpen podpis

3 Chtěl bych velmi poděkovat Ing. Lucii Cahlíkové Ph.D. za cenné rady při vypracování diplomové práce, za poskytnuté materiály a pomoc s interpretací MS spekter. Děkuji též Ing. Kateřině Macákové za stanovení biologických aktivit sumárních extraktů a izolovaných látek a doc. PharmDr. Jiřímu Kunešovi, Ph.D. z Katedry organické a bioorganické chemie Farmaceutické fakulty v radci Králové za změření a interpretaci MR spekter. Dále bych chtěl poděkovat doc. RDr. Ireně Valterové, CSc. z ÚCB AV ČR v Praze za možnost změření GC/MS spekter. Rovněž chci poděkovat celému kolektivu na katedře Farmaceutické botaniky a ekologie za příjemné pracovní prostředí a pomoc při řešení věcných i teoretických problémů.

4 BSA 1. ÚVD CÍL PRÁCE TERETICKÁ ČÁST Demence Alzheimerova choroba Klinický obraz Příčiny choroby Léčba Inhibitory acetylcholinesterázy Inhibitory MDA receptorů Další používaná léčiva a perspektivní látky Čeleď Amaryllidaceae becná charakteristika Klasifikace alkaloidů čeledi Amaryllidaceae Biosyntéza alkaloidů čeledi Amaryllidaceae Biologická aktivita alkaloidů čeledi Amaryllidaceae Taxonomické zařazení vybraných rodů čeledi Amaryllidaceae, jejich alkaloidy a biologická aktivita Rod ymenocallis ymenocallis litorallis ymenocallis festalis ymenocallis expansa Další druhy rodu ymenocallis Rod Chlidanthus Chlidanthus fragrans Rod erine erine bowdenii erine filifolia Další druhy rodu erine Rod Zephyranthes Zephyranthes concolor Zephyranthes candida

5 Další druhy rodu Zephyranthes EXPERIMETÁLÍ ČÁST Všeobecné postupy Destilace a odpařování Tenkovrstvá chromatografie Materiál a vybavení Rozpouštědla Chemikálie Příprava sumárních extraktů a GC/MS analýza Biologický materiál Příprava ethanolového a alkaloidního extraktu GC/MS analýza a identifikace alkaloidů Izolace a strukturní analýza belladinu z erine bowdenii MS analýza MR analýza Stanovení inhibiční aktivity alkaloidních extraktů a čistých alkaloidů vůči erytrocytární AChE a sérové BuChE Chemikálie a materiál použité pro stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity Přístroj použitý pro stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity Podmínky měření Příprava erytrocytárních pouzder Stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity (hodnoty IC 50 ) Stanovení antioxidační aktivity alkaloidních extraktů a čistých alkaloidů Chemikálie a materiál použité pro stanovení antioxidační aktivity Přístroje použité pro stanovení antioxidační aktivity Stanovení antioxidační aktivity (EC 50 ) VÝSLEDKY A DISKUZE Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny erine bowdenii Watson a jeho GC/MS analýza Strukturní analýza belladinu MS analýza belladinu MR analýza belladinu Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Zephyranthes grandiflora a jeho GC/MS analýza

6 5.4 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny ymenocallis sp. a jeho GC/MS analýza Antioxidační aktivita extraktů rostlin čeledi Amaryllidaceae a izolované látky ZÁVĚR LITERATURA SEZAM ZKRATEK

7 1. ÚVD 7

8 Rostliny patří odpradávna mezi první terapeutické prostředky, se kterými se člověk setkával. Již od starověku byly využívány k posílení organismu, jeho léčení a k předcházení nemocem. Původně se zpracovávaly a upravovaly celé rostliny nebo jejich části, nebylo známo, která látka či skupina látek mají vlastní léčebný efekt. Jejich účinek býval zjišťován empiricky, často připisován magickým silám. S pokrokem vědy, rozvojem analytických a separačních metod jsme dnes schopni odhalit, izolovat, zkoumat a využívat řadu rostlinných látek. Spektrum přírodních obsahových látek je velice široké a množství jejich účinků taktéž, což skýtá pro lidstvo mnoho skrytých možností, jak terapeuticky zvládnout onemocnění, z nich některá jsou v dnešní době syntetickými léčivy zatím hůře léčitelná. Významnou skupinu představují alkaloidy, sekundární metabolity rostlin, jejichž význam pro rostliny není zcela objasněn; pravděpodobně je syntetizují pro vlastní ochranu proti škůdcům, snad hrají roli při biosyntetických pochodech rostlinného metabolismu. Jsou syntetizovány z aminokyselin, ve své molekule obsahují dusík často vázaný do heterocyklu. Vyjímkou jsou pseudoalkaloidy (steroidní, terpenické), které mají jiný biosyntetický původ. Rostlina obvykle obsahuje jeden hlavní alkaloid doprovázený řadou strukturně příbuzných typů. bsah alkaloidů se mění zevními vlivy působícími na rostliny, kolísá během vegetace a zpravidla se snižuje či se jejich tvorba zastavuje při začátku kvetení. Ve vysokých dávkách mají toxické až letální působení, v nízkých dávkách jsou prospěšnými farmaky 1,2. Využívají se jako parentní látky nebo slouží jako modelové struktury pro tvorbu nových substancí s výhodnějšími vlastnostmi 3. Rostliny čeledi Amaryllidaceae představují jednu z 20 nejdůležitějších rostlinných alkaloidních rodin. Tato čeleď jednoděložných rostlin je intenzivně zkoumána. Výsledkem bádání je zatím izolace zhruba 500 alkaloidů rozdílné chemické struktury se širokou farmakologickou aktivitou, která zahrnuje účinky antitumorózní, antibakteriální, antifungální, antimalarické, antivirotické, analgetické a některé vystupují jako inhibitory acetylcholinesterázy (AChE). Mezi nimi vyniká galanthamin (Reminyl ), široce rozšířený mezi jednotlivými druhy zástupců této čeledi, který se využívá v terapii Alzheimerovy choroby (AD) jako selektivní, dlouze působící, reverzibilní a kompetitivní inhibitor AChE 4,5. Spolu s rivastigminem a donepezilem patří v současnosti mezi nejúčinější léky v terapii lehkých a středně pokročilých stadií AD, které prokazatelně zpomalují průběh nemoci, avšak ji neléčí 6. V pokročilých stádiích této choroby se využívají inhibitory -methyl-daspartátových (MDA) receptorů. bdobně jako předchozí cholinesterázové inhibitory podporují udržení kognitivních funkcí a zpomalují progresi nemoci. Mohou se vzájemně kombinovat. Memantin (Ebixa ) je z této skupiny zatím jediným využívaným v praxi 7. 8

9 V důsledku pokroků medicíny a prodlužování průměrného věku populace stárne a incidence AD se zvyšuje. Pro společnost to představuje velkou zátěž z hlediska ekonomických i lidských zdrojů pro zajištění péče o osoby trpící AD. V roce 2006 bylo celosvětově postiženo AD přibližně 30 miliónů lidí, podle současných prognóz se v roce 2050 prevalence zčtyřnásobí, znamená to, že 1 člověk z 85 bude žít s AD 8. Abychom této epidemii předešli, je nutno intezivně hledat nové aktivní látky, které by prognózu nemocných zlepšily. Perspektivní skupinou jsou alkaloidy rostlin čeledi Amaryllidaceae. Předmětem této práce byla příprava sumárních ethanolových a alkaloidních extraktů vybraných zástupců čeledi Amaryllidaceae, stanovení jejich biologické aktivity (inhibice cholinesteráz, antioxidační aktivita) a GS/MS analýza alkaloidů. 9

10 2. CÍL PRÁCE 10

11 Cílem diplomové práce bylo: 1) Připrava sumárních ethanolových a alkaloidních extraktů vybraných zástupců čeledi Amaryllidaceae. 2) Příprava vzorků na biologické testování. 3) Stanovení inhibiční aktivity obou typů extraktů vůči lidské erytrocytární acetylcholinesteráze a sérové butyrylcholinesteráze. 4) Stanovení antioxidační aktivity pomocí DPP testu u obou typů extraktů. 5) GC/MS analýza alkaloidů. 11

12 3. TERETICKÁ ČÁST 12

13 3.1 Demence Pojem demence zahrnuje skupinu onemocnění, která jsou charakterizována úbytkem intelektových schopností, poruchami osobnosti, chování, společenského začlenění a pracovních aktivit. Jde o chronické progredující onemocnění s vysokým potenciálem invalidity a významným celospolečenským dopadem z pohledu lidského utrpení pacientů a rodinných příslušníků, i z pohledu celospolečenských nákladů. V pokročilé fázi znemožňuje demence samostatný život a pacient vyžaduje nepřetržitý dohled a péči druhé osoby. Výskyt demence stoupá s věkem. Ve věku nad 65 let je demencí postiženo 3 7 % běžné populace, v populaci seniorů nad 75 let trpí demencí přibližně 15 % a po 80. roce života již % osob. Jen 10 % nemocných s demencí je mladších 65 let a tyto demence označujeme jako tzv. presenilní demence. dhaduje se, že v České republice je v současnosti nemocných s demencí a 70 % z nich je ve věku 80 let a více 9. Podle příčiny lze demence klasifikovat na několik typů: 1. Atroficko-degenerativní demence mezi něž patří AD, korová nemoc s Lewyho tělísky, demence při Parkinsonově chorobě aj. 2. Ischemicko-vaskulární demence vznikající jako následek cévních postižení mozku. Do této skupiny patří například multiinfarktová demence, vaskulární demence s náhlým začátkem nebo Binswangerova choroba. 3. Třetí skupinu představují další symptomatické demence, které jsou způsobeny postižením mozkových funkcí v následku jiných chorob, zraněním mozku nebo intoxikacemi Alzheimerova choroba Alzheimerova choroba (AD) je nejčastější demencí, představuje minimálně 50 % všech demencí a dalších % demencí smíšené etiologie, kde je AD spojena s jinou příčinou (např. vaskulární) Klinický obraz Pro AD je typický pomalý a nenápadný počátek. Z tohoto důvodu si okolí nemocného často prvních projevů demence nepovšimne. Prvními příznaky bývají drobné změny osobnosti, chování, návyků a zvyků. emocný přestává být aktivní a začíná se spíše izolovat. Ztrácí pružnost v myšlení, objevuje se postupná degradace v oblasti etické i estetické. 13

14 Poruchy kognitivních funkcí mohou být zřejmé hned od počátku, někdy se projevují až při progresi choroby. emocný je může po určitou dobu i maskovat. Již v poměrně časných stádiích se projevují problémy s orientací v prostoru, a to i v místech nemocnému důvěrně známých. Typické jsou dále poruchy úsudku a neschopnost abstraktního myšlení. Poruchy paměti jsou difúzní, ale typické pro AD. ejdříve je postižena recentní pamět, dlouhodobá paměť bývá relativně dlouho zachována. Myšlení nemocného se stává chudým, neohebným, nemocný postrádá schopnost syntézy, analýzy a logických úvah. Významně se snižuje slovní zásoba, řeč je stereotypní. Ve sféře emoční je jedním z nejtypičtějších příznaků postupné emoční oploštění. bjevují se známky deprese, jindy může být přítomna euforie. ěkdy se mohou objevit afekty vzteku, dysforie. sobnost nemocného se mění velmi brzy. To je jeden z příznaků, který klinicky významně odlišuje AD od demence vaskulárního typu. bjevuje se egocentrismus, egoismus, sobeckost, podezřívavost, nemocní o sebe přestávají pečovat. Ve finálních stádiích se osobnost nemocného zcela rozpadá 12. U AD rozlišujeme tato 3 stadia: 1. stadium mírná forma zhoršování paměti, zejména pro zcela nedávné události, přechodná časová dezorientace, neschopnost vybavit si, který je den, měsíc a rok, prostorová dezorientace, nejprve neschopnost se orientovat na méně známých místech, pak i na místech známých, ztráta iniciativy, pokles zájmu o zaměstnání a koníčky, stále obtížnější rozhodování, obtížné hledání slov. 2. stadium středně těžká forma významné výpadky paměti, včetně jmen členů vlastní rodiny, snížená schopnost postarat se sám o sebe, je zapotřebí pomoci při mytí či oblékání, časté případy, kdy se nemocný ztratí nebo zabloudí i na známých místech, zhoršování řečových schopností, halucinace, bludy. 3. stadium těžká forma, úplná závislost obtíže při příjmu potravy, neschopnost rozpoznat přátele, členy vlastní rodiny, obtíže s chůzí, inkontinence moči a/nebo stolice, výrazné poruchy chování

15 3.2.2 Příčiny choroby Příčiny AD mohou být genetické, virové, zánětlivé, často poúrazové a také v důsledku cerebrální ischémie (iktu) 14. a úrovni mozku je tato choroba provázena zásadními změnami, podle nichž se často hovoří o cholinergní a amyloidní hypotéze. Cholinergní hypotéza popisuje stav, kdy v mozku nemocného dochází k postižení acetylcholinergního systému, nastavení odlišného poměru AChE a BuChE, postižení systému excitačních aminokyselin (hlavně glutamátergního) a dalších neurotransmiterových systémů 15. Savčí mozek totiž obsahuje dvě hlavní formy cholinesteráz, AChE (EC ) a BuChE (EC ). bě formy jsou rozlišeny geneticky, strukturně a také reakční kinetikou. Zatímco význam acetylcholinu jako jednoho z klíčových mediátorů lidského organizmu je dobře znám, butyrylcholin není fyziologickým substrátem v savčím mozku a role BuChE je dosud obtížně interpretovatelná. V lidském mozku se BuChE nachází v neuronech, gliových buňkách, stejně tak v neuritovém plaku a tangles (agregáty hyperfosforylovaného tau-proteinu) u pacientů s AD. AChE je predominantní u zdravých jedinců, BuChE hraje pravděpodobně pouze určitou minoritní roli v regulaci hladiny mozkového acetylcholinu. Aktivita BuChE vzrůstá s přibývajícím věkem a je rovněž zvýšená u pacientů s AD, zatímco aktivita AChE zůstává nezměněna, popřípadě klesá 16. Dle posledních literárních údajů hraje BuChE významnou roli v pokročilých stádiích AD. Z tohoto důvodu bude třeba se na tuto skutečnost v oblasti terapie AD zaměřit 17. Amyloidní hypotéza začala krystalizovat v roce 1986, kdy vědci objevili gen na chromozomu 21, který produkuje amyloidový prekurzorový protein (APP). Tento protein, jehož funkce není doposud známa, je běžným integrálním proteinem v membráně neuronů a je hojně produkován ve zdravém lidském mozku. Gen pro APP obsahuje určitou sekvenci pro amyloidní peptid, který je v důsledku poruchy agregován do tzv. senilních plaků. Tyto plaky jsou nejběžnějším kriteriem využívaným pro diagnostiku patologie při AD v mozku pacientů trpících touto poruchou. Ve zdravém mozku dochází k štěpení APP za pomoci enzymů na neškodné rozpustné fragmenty, které pak volně plují mezi neurony. Pravděpodobně přispívají ke schopnosti neuronů formovat mezi sebou nová spojení, což je zásadní funkce pro tvorbu paměťových stop. Avšak specifický enzym (betaa gama-sekretáza), jež se objevuje důsledkem mutace v genu pro APP, štěpí APP za vzniku prekurzorů, které se shlukují v neurotoxické oligomery. Ty dále polymerují v patologický protein beta-amyloid, o kterém se předpokládá, že narušuje přenos signálu na synapsi 18,19. 15

16 Tvorba zmíněných plaků představuje ložiska další degenerace, při níž dochází ke spuštění celé neurodegenerativní kaskády (vznik toxických cytokinů, vznik zánětu, škodlivé působení reaktivních forem kyslíku a dusíku, poškození neuronální bílkoviny tau-proteinu, zvýšení apoptózy nervových buněk Léčba Léčba AD vychází ze znalosti jednotlivých patogenetických článků, nikoli ze znalostí základní příčiny. Současná terapie nám tedy umožňuje chorobu modulovat, především prodlužovat lehká stadia a oddalovat těžká stadia demence. U AD jsou 2 farmakoterapeutické postupy, které jsou založeny na důkazech (evidence-based) t. j. na výsledcích více rozsáhlých, multicentrických, multietnických, randomizovaných dvojitě slepých studií 11. Jedná se o: Inhibitory acetylcholinesterázy u lehkých a středních forem AD Inhibitory MDA receptorů v pokročilých stadiích AD Inhibitory acetylcholinesterázy Inhibitory acetylcholinesterázy užívané u AD musí dobře pronikat hematoencefalickou bariérou a inhibovat AChE v mozku více než v srdci, střevě nebo neuromuskulární ploténce. Pomalejší odbourávání acetylcholinu zvyšuje jeho koncentraci v synaptické štěrbině a tím se upravuje cholinergní přenos na nervových synapsích v CS. Inhibice cholinesteráz snižuje tvorbu i toxicitu beta-amyloidu a zasahuje tak do neurodegenerativních mechanizmů AD. d podání inhibitorů nelze očekávat vyléčení demence ani dlouhodobé podstatné zlepšení. lavní efekt spočívá ve zpomalení průběhu demence, v oddálení těžkých stadií nemoci. Inhibitory acetylcholinesterázy prodlužují období soběstačnosti a běžných denních aktivit nemocného a snižují zátěž rodiny a jiných pečovatelů 18. V současné době jsou v ČR používány 3 inhibitory: rivastigmin, donepezil a galanthamin. Představují chemicky nejednotnou skupinu, liší se v typu inhibice a v tom, zda podstatně odbourávají či neodbourávají molekuly butyrylcholinesterázy. Rivastigmin (Exelon ), karbamátový derivát, působí pseudoireverzibilní inhibici cholinesteráz a kromě mozkových acetylcholinesteráz účinně inhibuje i butyrylcholinesterázy. avíc zvyšuje i obsah cholinacetyltransferázy, enzymu syntetizujícího v cholinergních neuronech acetylcholin. Je vysoce specifický vůči monomerní formě acetylcholinesteráz G1 a allostericky moduluje nikotinové receptory. 16

17 Donepezil (Aricept ) náleží mezi piperidinové deriváty, které působí reverzibilní inhibici acetylcholinesteráz, pro něž je značně specifický, butyrylcholinesterázy inhibuje naprosto nevýznamně. Galanthamin (Reminyl ) je alkaloid izolovaný z některých druhů čeledi Amaryllidaceae. Je to látka, která se vyznačuje duálním působením na acetylcholinergní systém; kromě toho, že reverzibilně inhibuje acetylcholinesterázy, také allostericky moduluje pre- i postsynaptické nikotinové receptory. Touto modulací se zlepšuje jednak uvolnění acetylcholinu z presynaptických zakončení, tak se do určité míry zabraňuje desenzitizaci postsynaptických muskarinových receptorů 20. Zásah do aktivity (resp. inhibice) obou cholinesteráz lidského mozku z hlediska zlepšení kognitivních funkcí je stále významným krokem k ovlivnění průběhu tohoto nevyléčitelného onemocnění, ačkoliv jsou hledána i léčiva jiných farmakoterapeutických skupin 21. V současnosti je snahou najít takové látky, které by vykazovaly duální inhibici vůči AChE i BuChE, jelikož BuChE se ukázala jako nový a významný cíl v terapii AD Inhibitory MDA receptorů Skupina inhibitorů MDA receptorů je zastoupena jediným dnes používaným léčivem, memantinem (Ebixa ) 7. Memantin pomáhá snižovat poškozování nervových buněk vyplývající z nadměrné stimulace MDA receptorů během neurotransmise glutamátem. Memantin se na tyto receptory váže s vyšší afinitou než Mg 2+ ionty a inhibuje tak delší příliv Ca 2+ iontů, který způsobuje vlastní cytotoxicitu a poškození buněk. Podstatné je, že neblokuje kompletně glutamátenergní neurotransmisi, jelikož pro správnou funkci buněk (učení, paměť) je určitá MDA stimulace nezbytná. Přesto, že je prokázána spojitost s nadměrnou MDA aktivací a progresivní ztrátou nervové tkáně, memantin jako slabý MDA inhibitor vykázal pouze minimální zlepšení kognitivních funkcí u nemocných s AD Další používaná léčiva a perspektivní látky V terapii AD je používána řada farmakoterapeutických přístupů, které však nejsou podloženy dostatečnými výsledky klinických studií. ěkteré z nich vykazují mírnější prokazatelné efekty na kognitivní i nekognitivní funkce a jsou vhodné pro kombinaci s inhibitory mozkových cholinesteráz i s memantinem. Mezi taková farmaka náleží např. extractum ginkgo biloba (např. Tanakan ) nebo nicergolin (Ergotop ). Dále jsou používána nootropní farmaka - piracetam (např. Pirabene ) nebo pyritinol - tyto látky však 17

18 neprokázaly efekty v léčbě demencí v rozsáhlých kontrolovaných klinických studiích, a proto jejich použití není racionální 11. Mezi jiná léčiva a látky ovlivňující průběh AD lze řadit inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu, nesteroidní antiflogistika, inhibitory beta-sekretázy, huperzin A, polyfenoly kurkumin a resveratrol, žen-šen, nutraceutika omega-3 mastné kyseliny, alfa-lipoovou kyselinu, fosfatidylserin, koenzym Q10, vitamíny A, E, hormony melatonin a jiné Čeleď Amaryllidaceae becná charakteristika Čeleď Amaryllidaceae je skupinou jednoděložných rostlin zahrnující přibližně 85 rodů a 1100 druhů, které jsou rozšířeny zejména v tropických a teplých oblastech světa. Představují velmi významný a bohatý zdroj nových látek pro terapeutické účely. ejvýznamnějšími sekundárními metabolity těchto rostlin jsou tzv. amarylkovité alkaloidy, strukturně patřící mezi isochinolinové alkaloidy. Pro svoji biologickou hodnotu jsou tyto alkaloidy předmětem intenzivního výzkumu, zejména v rámci vlastní izolace, stanovení biologické aktivity a jejich chemie Klasifikace alkaloidů čeledi Amaryllidaceae Alkaloidy čeledi Amaryllidaceae jsou podle nejnovějších literárních zdrojů rozděleny dle své chemické struktury do 18 základních typů: belladinový, krininový, galanthaminový, lykorinový, galanthindolový, homolykorinový, galasinový, montaninový, kripowellinový, cheryllinový, buflavinový, plikaminový, tazettinový, gracilinový, augustaminový, pankratistatinový, gracilaminový a hostasininový (Tab. I) 5. 18

19 Tabulka I Strukturní typy alkaloidů čeledi Amaryllidaceae, jejich příklady a rostlinné rody je obsahující 5. Strukturní typ Příklad alkaloidu Rostlinné rody Belladinový Crinum, erine Me C 3 Me Belladin Krininový Krinin Ammocharis, Brunsvigia, Crinum, Eucharis, arcissus, erine, ymenocallis Galanthaminový Me Crinum, ymenocallis, Leucojum, Lycoris, arcissus Galanthamin C 3 Lykorinový Lykorin Amaryllis, Ammocharis, Brunsvigia, Crinum, Eucharis, isppeastrum, ymenocallis, Leucojum, arcissus, Zephyranthes Galanthindolový 3 C Galanthus, Lycoris omolykorinový Galanthindol 3 C 3 C 3 C omolykorin Clivia, Galanthus, aemathus, Lycoris, arcissus 19

20 Galasinový 3 C Galasin Me Galanthus, osta plantaginea (Liliaceae) Montaninový Me Boophane, aemathus, ymenocallis, arcissus Kripowellinový Cheryllinový Montanin R 1 R 2 Me Kripowellin A (R 1, R 2 = C 2 C 2 ) Kripowellin B (R 1, R 2 = C 3 ) Crinum Crinum Me Cheryllin C 3 Buflavinový Boophane Me Me Buflavin C 3 Plikaminový Me Cyrtanthus, Galanthus C 3 Plikamin 20

21 Tazettinový Me Tazettin C 3 Crinum, Eucharis, Galanthus, ippeastrum, ymenocallis Gracilinový Galanthus Gracilin C 3 Augustaminový C 3 Crinum Augustamin Pankratistatinový Crinum, ippeastrum, ymenocallis, Zephyranthes Pankratistatin Gracilaminový C 3 Galanthus C 3 Gracilamin ostasininový + - osta plantaginea (Liliaceae) ostasinin Me 21

22 3.3.3 Biosyntéza alkaloidů čeledi Amaryllidaceae Vlastní biosyntéza je výsledkem několika intramolekulárních oxidativních couplingů prekurzorových látek příbuzných k norbelladinu 25. orbelladin vzniká reakcí 3,4-dihydroxybenzaldehydu s tyraminem za vzniku Shiffovy base. ásledná redukce base a methylace skeletu norbelladinu vede k zisku klíčového intermediátu, 4'-methylnorbelladinu, který je považován za výchozí sloučeninu v biosyntéze alkaloidů čeledi Amaryllidaceae (br. 1) Tyramin 3,4-Dihydroxybenzaldehyd Shiffova base Me 4' orbelladin 4'--Methylnorbelladin br. 1 Biosyntéza norbelladinu a 4'--methylnorbelladinu Biologická aktivita alkaloidů čeledi Amaryllidaceae Do dnešní doby bylo izolováno téměř 500 strukturně různých alkaloidů z rostlin čeledi Amaryllidaceae. Jsou to sloučeniny se širokým spektrem biologické aktivity, jež zahrnuje účinky protinádrorové, antibakteriální, antifungální, antimalarické, antivirotické, analgetické a anticholinergní 4. Protinádorové působení amarylkovitých alkaloidů je dlouhodobě známé a intezivně studované. Velká pozor je věnována lykorinovému typu alkaloidů, jako je pankratistatin 27 i jeho přírodním a syntetickým derivátům 28. Tyto alkaloidy vykázaly potencionální antikarcinogenní účinky. ejnovější poznatky říkají, že tato skupina alkaloidů působí cytostaticky spouštěním apoptózy nebo programovanou buněčnou smrtí, cestou časné aktivace kaspázy-3, enzymu, který hraje klíčovou roli v konečné fázi apoptózy. Zmíněné 22

23 alkaloidy navíc působí selektivně cytotoxicky vůči vybraným typům nádorů a představují tak zdroj nových, cíleně působících chemoterapeutik 29,30. Alkaloidy krininového typu, jmenovitě krinin, haemathamin, krinamin, ambellin, amabilin, josefinin, 1,2-epoxyambellin a 6α-hydroxyundulatin, společně s dvěma syntetickými krininovými analogy byly zkoumány jako potenciální induktory apoptózy. Ve studii byl použit model nádoru potkaních jater (5123tc) a nenádorový model linie lidských embryonálních ledvin (EK-293t). Při porovnání vlivu alkaloidů na jednotlivé buněčné linie se ukázalo, že krinamin a haemathamin jsou silně účinné induktory apoptózy u nádorové linie již v mikromolárních koncentracích. Vliv na nenádorovou linii byl minimální, zmíněné alkaloidy tedy působí selektivní apoptózu rakovinných buněk obdobně jako pankratistatin a jeho deriváty. Z hlediska vztahu struktury a účinku bylo dále zjištěno, že pro vlastní účinek je nezbytná přítomnost volné sekundární alkoholické skupiny v poloze C-11 a α-5,10b-ethanolový můstek. a odhalení mechanismu účinku, identifikaci místa působení a použití krininových alkaloidů na širším spektru lidských a zvířecích nádorových modelů se intenzivně pracuje 31. Velkým problémem při léčbě nádorových onemocnění je rozvoj mnohočetné lékové rezistence (MDR). Příčin tohoto jevu může být řada, v současnosti nejzkoumanějším je P-glykoprotein, transmembránový transportér, který je zodpovědný za eflux chemoterapeutika vně nádorové buňky, snížením jeho intracellulární koncentrace a tím pádem i selháním terapie. Z tohoto důvodu byly vybrané amarylkovité alkaloidy, 2--acetyllykorin, homolykorin, pretazettin, trisphaeridin a ismin podrobeny nejen studii na antiproliferativní působení, ale i na ovlivnění MDR. Z hlediska antiproliferativních účinků vykázaly výborné výsledky proti lidským i myšším buněčným liniím pretazettin, trisphaeridin a 2--acetyllykorin. K zhodnocení jejich inhibiční aktivity k P-glykoproteinu byla použita rhodaminová studie na modelu myššího MDR lymfomu. Pretazettin zvýšil intracellulární koncentraci rhodaminu 30 a trisphaeridin 50 u léčených buněk v porovnání s kontrolním vzorkem. Tato zjištění vedla k závěru, že pretazettin a trisphaeridin významně blokují P-glykoproteinem zprostředkovaný eflux léčiv 32. Alkaloid narciklasin působí cytotoxicky v lidských nádorových buňkách, ale ne v normálních fibroblastech, aktivací kaspáz (kaspáza-8, kaspáza-10), iniciátorů apoptózy u modelu lidské rakoviny prsu (MCF-7) a karcinomu prostaty (PC-3). Předpokládá se, že vysoká selektivita narciklasinu k nádorovým buňkám je dána díky zmíněné cestě aktivace apoptózy, ke které u normálních buněk nedochází

24 Methanolový extrakt osmi druhů rodu Galanthus a jednoho druhu rodu Leucojum, zástupců čeledi Amaryllidaceae, vykázal významnou in vitro cytotoxicitu vůči třem typům lidských nádorových buněčným liniím, včetně ela (karcinom krčku děložního), CT-116 (kolorektální karcinom) a L-60 (akutní myeloidní leukémie). Linie CT-116 byla vůči působení extraktů v porovnání s ostatními nejcitlivější 34. Montanin, izolovaný z cibulí druhu Rhodophiala bifida (Amaryllidaceae) byl podroben in vitro testu antimikrobiální aktivity. Alkaloid prokázal silný účinek proti pěti kmenům mikrobů (Saccharomyces cerevisie, Pseudomonas eruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis a Escherichia coli) 35. Montanin, izolovaný z druhu ippeastrum vittatum, má psychofarmakologické působení včetně anxiolytického, antidepresivního a antikonvulzivního účinku 36. ěkolik lykorinových derivátů bylo testováno na svou inhibiční aktivitu vůči prvokům Trypanosoma brucei a Plasmodium falciparum. Proti T. brucei vykázal nejvyšší inhibiční aktivitu 2--acetyllykorin, P. falciparum bylo nejcitlivější k 1--(3R)- hydroxybutanoyllykorinu, 1,2-di--butanoyllykorinu a 1--propanoyllykorinu 37. Velice významná je inhibiční aktivita amarylkovitých alkaloidů vůči AChE, jejíž inhibice patří mezi základní přístupy v dnešní léčbě AD. Alkaloid galanthamin (Reminyl ), široce rozšířený mezi jednotlivými druhy zástupců této čeledi, se využívá v terapii AD jako selektivní, dlouze působící, reverzibilní a kompetitivní inhibitor AChE 4. Uvedení galanthaminu do léčebné praxe podnítilo zvýšený zájem o fytochemický průzkum amarylkovitých z hlediska jejich alkaloidního obsahu. Byla provedena celá řada studíí, které se zabývají anticholinergní aktivitou jak alkaloidních extraktů, tak i jednotlivých izolovaných alkaloidů. Screeningové studie holandských a švýcarských autorů prokázaly inhibiční účinky alkaloidních extraktů řady druhů 38,39. Při studiu inhibiční aktivity izolovaných alkaloidů různých strukturních typů se podle posledních zjištění zdá, že vlastní inhibiční aktivita je spojena se strukturními typy alkaloidů náležících do skupiny galanthaminové a lykorinové, přičemž galanthamin a jeho deriváty vykazují silnější inhibice AChE než lykorinové typy 40, Taxonomické zařazení vybraných rodů čeledi Amaryllidaceae, jejich alkaloidy a biologická aktivita Říše: Podříše: Plantae (rostliny) Tracheobionta (cévnaté rostliny) 24

25 ddělení: Magnoliophyta (krytosemenné) Třída: Liliopsida (jednoděložné) Řád: Asparagales (chřestotvaré) Čeleď: Amarylidaceae (amarylkovité) 42 Rod: ymenocallis Chlidanthus erine Zephyranthes Rod ymenocallis Rod ymenocallis Salisbury byl poprvé popsán roku Zahrnuje zhruba 70 až 80 druhů, přičemž řada ještě není popsána a uznána za příslušníky tohoto rodu. Původními oblastmi výskytu jsou rozmanitá přírodní území jižních a jihovýchodních států USA (Indiana, Kentucky, Virginia, Georgia, Florida, Alabama, Louisiana, Texas). ejvětší druhové pestrosti a zastoupení dosahuje rod ymenocallis ve Střední Americe, zejména v Mexiku, odkud se rozšířil i do severních států Jižní Ameriky (Venezuela, Guyana, Brazílie) 43. Z hlediska fytochemického poznání byla poprvé provedena roku 1920 studie obsahových látek druhu ymenocallis litorallis Salisb. Izolován byl lykorin, který je široce rozšířen mezi zástupci čeledi Amaryllidaceae. Jednalo se v té době o již známou látku, která byla poprvé identifikována v cibulích druhu arcissus pseudonarcisus roku Lykorin vykazoval emetickou aktivitu a tato zjištění vedla k farmakologickým studiím extraktů a čistých látek získaných z rostlin této čeledi. Další výzkum v oblasti biologické aktivity lykorinu přinesl zprávy o jeho antifungálních, antivirotických a protinádorových účincích. Přestože alkaloidy rodu ymenocallis vykazovaly řadu zajímavých biologických aktivit, zůstávaly stranou zájmu až do roku 1993, kdy Pancratium littorale Jacq. (Amaryllidaceae), ze kterého byl izolován isokarbostyrilový alkaloid pankratistatin, bylo reklasifikováno jako ymenocallis litorallis Salisb. Pankratistatin vykázal protinádorovou aktivitu vůči sarkomům, melanomům a rovněž antivirotické působení. avíc byly izolovány nové látky, narciklasin a 7-deoxy-narciklasin, s dalšími zajímavými účinky. Tato zjištění vedla k přezkoumání některých druhů ymenocallis a jejich alkaloidního profilu ymenocallis litorallis Druh. litorallis (br. 2) byl podroben celé řadě fytochemických studií, při nichž byl z cibulí izolován alkaloid haemathamin, galanthamin, trisphaeridin 45, lykorin, tazettin, 25

26 hippeastrin 45,46, littoralin, pretazettin, makronin, homolykorin, lykorenin, -methyllykorenin, lykoramin, demethylmaritidin, vittatin, 5,6-dihydrobikolorin 46. V jiných pracích byl rovněž z cibulí ještě získán 11-hydroxyvittanin 47, pankratistatin, narciklasin, 7-deoxynarciklasin, 7-deoxy-trans-dihydronarciklasin 27, krinin acetát, -acetyldihydrokrinin, lykorin diacetát, norpluvin diacetát a bowdensin 48. Struktury vybraných alkaloidů jsou dále uvedeny (br. 3).. littoralis je středem zájmu především z hlediska protinádorové aktivity přirozeně obsažených alkaloidů 27, tak i upravených, semisyntetických alkaloidů z této rostliny, například některých analogů pankratistatinu, které vykazují slibnou biologickou aktivitu 28. br. 2 ymenocallis littorallis ( Francisco Manuel Blanco) 49 Z hlediska anticholinergní aktivity nebyl druh. littoralis dosud zkoumán. Byla provedena studie druhu. 'Sulphur Queen' (syn.. spofforthiae 'Sulphur Queen'), hybridu vzniklého křížením peruánských druhů. narcissiflora a. amancaes 50. Byly připraveny 2 typy extraktů ze suchých cibulí, z nichž methanolový vykázal slabou a toluenový extrakt žádnou inhibiční aktivitu vůči AChE v porovnání se standardem galanthaminem

27 Me Me 3 C Demethylmaritidin aematamin ippeastrin Me C3 Lykoramin Me Me 3 C Lykorenin Me C 3 Littoralin arciklasin Trisphaeridin br. 3 Příklady struktur alkaloidů izolovaných z. littoralis ymenocallis festalis. festalis je hybrid vzniklý zkřížením druhů. longipetala a. narcissiflora. V několika málo pracích byly z cibulí izolovány alkaloidy: tazettin, lykorin 51,52, epimakronin, ismin, trisphaeridin 51, haemathamin, galanthin, narcissidin, karanin 52 a 3-metoxy-8,9- methylendioxy-3,4-dihydrofenantridin 53. Ve studii na antiproliferativní účinky vybraných alkaloidů (lykorin, haemathamin) byla potvrzena jejich aktivita vůči rakovinnému modelu (lymfom) 51. V jiné práci byla testována antitumorózní aktivita isminu a trisphaeridinu 32. Inhibiční aktivita vůči AChE byla provedena v jediné studii, methanolový extrakt ze suchých cibulí byl aktivní, stejně připravený toluenový extrakt vykázal slabou inhibiční aktivitu k AChE

28 ymenocallis expansa Fytochemická analýza extraktů cibulí a listů druhu. expansa odhalila přítomnost tazettinu, haematidinu, hippeastrinu. ba alkaloidní extrakty vykázaly významné cytotoxické působení při testování na lidských i myšších rakovinných modelech 54. Pankratistatin a narciklasin byl izolován z cibulí v jiné studii Další druhy rodu ymenocallis V následujícím přehledu jsou shrnuty další druhy rodu ymenocallis, kterým byla doposud věnována pozornost po fytochemické stránce. U každého druhu jsou uvedeny alkaloidy, jež byly v dané rostlině identifikovány (Tab. II). Tabulka II Druh Další druhy rodu ymenocalis a jejich alkaloidy Izolované alkaloidy. tubiflora lykorin, pseudolykorin 44,56, pretazettin 56, lykoramin, -desmethylgalanthamin, anhydrolykorin, anhydro-pseudolykorin, 4,5-dehydroanhydrolykorin, 4,5-dehydro-anhydro-pseudolykorin, 1--acetylpseudolykorin 44.. arenicola lykorin, tazettin, galanthamin, haemathamin, zaidin 57, varadin 58, havanin 59 a karibilin 60, amisin, mesembrenol, mesembrenon 61.. speciosa lykorin, tazettin, haemathamin, hippeastrin, nerinin 62, pankratistatin, narciklasin 55.. rotata lykorin, tazettin, haemathamin, galanthamin 62,63, hippeastrin, homolykorin 62, vitatin, 3-epimakronin, ismin, pretazettin, lykoramin, -demethylgalanthamin, demethylmaritidin, -demethyllykoramin 63. amancaes lykorin, tazettin, haemathamin, galanthamin, hippeastrin, nerinin, galanthin 62. calathina lykorin, tazettin, haemathamin, galanthamin, nerinin, homolykorin, vittanin 62. harrisiana lykorin, tazettin, haemathamin, galanthin, narcisidin, karanin, haematidin, pseudolykorin 52. bolivariana lykoramin, galanthamin 44. guianensis lykoramin, galanthamin, anhydrolykorin, anhydro-pseudolykorin, lykorin, pseudolykorin 44. lobata lykoramin, galanthamin, anhydrolykorin, anhydro-pseudolykorin, lykorin, pseudolykorin 44 28

29 Rod Chlidanthus Rod Chlidanthus představuje nepočetnou skupinu druhů, které jsou domácí v Jižní Americe. Většina druhů je morfologicky velmi podobná. Pro svou okrasnou hodnotu je pěstován zejména Ch. fragrans (br. 4), druh původem z peruánských And 64. br. 4 Chlidanthus fragrans Chlidanthus fragrans Z fytochemického hlediska byl Ch. fragrans dlouhou dobu minimálně prozkoumán, byly k dispozici pouze 2 analýzy obsahových látek cibulí, které potvrdily přítomnost alkaloidu tazettinu, lykorinu, chlidantinu a galanthaminu 66,67. Extrakt methanolový i toluenový, připravený ze suchých cibulí, vykázal pozitivní inhibiční aktivitu vůči AChE v jedné screeningové studii 38. ejnovější práce týkající se obsahu alkaloidů Ch. fragrans a anticholinergní aktivity alkaloidních extraktů byla vypracována na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie Farmaceutické fakulty v radci Králové a byla publikována v mezinárodním časopisu s fytochemickou tématikou

30 Rod erine Rod erine zahrnuje přibližně 23 druhů, místem výskytu vázaných na oblasti Jižní Afriky. Jedná se o vytrvalé cibuloviny, které osidlují především prostředí s letními dešti a studenými, suchými zimami. Většina druhů rodu erine je pěstována pro své elegantní a okrasné květy. Pro zahradnické účely byl vypěstován bezpočet hybridů. Rostliny jsou rovněž využívány v tradiční medicíně domorodých obyvatel Jižní Afriky. Kmeny Zulu a Soto používají odvarů z cibulí pro léčbu kašle a nachlazení, k zlepšení stavu jater a ledvin, k úlevě od bolesti zad a jako lék na neplodnost 69. Řada druhů byla fytochemicky prozkoumána, zejména. bowdenni (br. 5) a v některých případech byly u několika zástupců rodu provedeny i zkoušky jejich biologické aktivity. br. 5 erine bowdenii erine bowdenii Během 50. a 60. let 20. století byl druh. bowdenii podroben řadě fytochemických studií, při kterých byly izolovány tyto alkaloidy: ambellin, undulatin 71,72, krinamidin, krinidin, lykorin 71, bowdensin, buphanidrin, buphanisin, krinamin, nerbowdin, undulatin 72, lykorenin, 30

31 methylpseudolykorin, pluviin 73, v 70. letech navíc přibyl powellin, 6-hydroxybuphanidrin a 6- hydroxypowellin 74. ejnověji byl získán ungeremin 75, 11--acetylambellin a filifolin 76. Struktury některých alkaloidů jsou uvedeny na následujícím obrázku (br. 6). Me Me Me Me Me Me Ambellin Me Buphanidrin Me Me Filifolin - + erbowdin Undulatin Ungeremin br. 6 Strukturní vzorce vybraných alkaloidů izolovaných z. bowdenii. olandští autoři provedli u. bowdenii 2 screeningové studie inhibiční aktivity k AChE. V první byl z cibulí připraven methanolový a toluenový extrakt; oba působily silnou inhibici AChE, nikoliv však vyšší než standard galanthamin 38. V druhé studii byl připraven extrakt ethanolový, rovněž z cibulí, který působil také významně inhibičně 77. Další studie byla uskutečněna švýcarskými vědci; ethanolový extrakt z cibulí inhiboval AChE 39. Při fytochemických studiích druhu. bowdenii byla izolována celá řada alkaloidů, některé z nich byly testovány pro svou inhibiční aktivitu k AChE. Ze všech testovaných alkaloidů vykázal zajímavou inhibiční aktivitu undulatin (IC 50 = 37 µm) a ungeremin (IC 50 = 0,35 µm). V obou případech byla ke stanovení inhibiční aktivity použita modelová AChE z elektrického úhoře 76, erine filifolia Této stálezelené rostlině byla po fytochemické stránce doposud věnována menší pozornost. V jediné studii z roku 2005 bylo izolováno 8 alkaloidů různých strukturních typů. Jako hlavní složky byly identifikovány: belladin, 11--acetylambellin a undulatin. V menších 31

32 množstvích byly izolovány: ambellin, 6α-hydroxybuphanidrin, -demethybelladin, 6α-methoxybuphanidrin a filifolin. Filifolin byl podroben in vitro testům biologické aktivity. Proti potkanním myoblastům nevykázal cytotoxické účinky a jeho antiprotozoální aktivita vůči prvokům Trypanosoma brucei rhodensiense, T. cruzi, Leshmania donovani a Plasmodium falciparum byla nulová Další druhy rodu erine V následujícím přehledu jsou shrnuty další druhy rodu erine, kterým byla doposud věnována pozornost po fytochemické stránce. U každého druhu jsou uvedeny alkaloidy, jež byly v dané rostlině identifikovány (Tab. III). Tabulka III Druh Další druhy rodu erine a jejich alkaloidy Izolované alkaloidy. flexuosa lykorin, undulatin 73,78, galanthamin, haemathamin, galanthin, neruscin 73, flexinin, krinamidin, buphanamin, ambellin, krinidin, powellin, powellamin 78. crispa lykorin, buphanamin, ambellin, krinamidin, undulatin, amaryllidin, narcissidin, acetylnerbowdin, krispanin 79. masonorum karanin, lykorin, haemathamin, krinidin, tazettin, narcissidin, masonin 80. undulata lykorin, nerispin, undulatin 66,81, ambellin, krispin 66, buphanamin, krinidin, nerundin Rod Zephyranthes Rod Zephyranthes zahrnuje přibližně 60 druhů, domácích v jihovýchodních státech USA, Mexiku, Antilách, Jižní Americe. ěkteré druhy rostou i v Jižní Africe. Jedná se o velmi oblíbené okrasné rostliny, jež jsou pro své nádherné květy s oblibou pěstovány v teplých oblastech světa 82. Druhy rodu Zephyranthes jsou široce používány v lidovém léčitelství v mnoha zemích. dvary z listů Z. candida jsou v Jižní Africe využívány k léčbě diabetes mellitus a Z. parulla v Peru jako protinádorové léčivo 83. Z. rosea a Z. flava jsou používány v tradiční indické medicíně 84, Zephyranthes concolor Druh Z. concolor patří mezi několik málo zástupců rodu, u kterých byla provedena GC/MS analýza alkaloidního extraktu. Byly identifikovány tyto alkaloidy: galanthamin, který 32

33 byl ve vzorku zastoupen v největší míře, dále chlidanthin, sanguinin 86. V navazující studii stejných autorů byly dále objeveny stopy hordeninu, methylgalanthaminu, epinorgalanthaminu, narwedinu, acetylgalanthaminu, montaninu a lykorinu (br.7). Me Me Me C 3 C 3 C 3 epi-orgalanthamin Chlidanthin arwedin C 3 Lykorin Sanguinin br. 7 Strukturní vzorce vybraných alkaloidů izolovaných ze Zephyranthes concolor Alkaloidní extrakt Z. concolor byl podroben testu inhibiční aktivity k AChE metodou mikrodestičkového testu (microplate assay) s použitím modelové AChE z elektrického úhoře. Test inhibice byl proveden v koncentracích 100 µg/ml, 10 µg/ml a 0,1 µg/ml. Při nejvyšší koncentraci vykázal extrakt Z. concolor 97% inhibici AChE, při nižších koncentracích byla inhibice též významná (10 µg/ml = 88 ± 0,2% inhibice, 0,1 µg/ml 20,2 ± 3,5% inhibice AChE). Zjištěná inhibiční acetylcholinesterázová aktivita bude s největší pravděpodobností způsobena vysokým podílem galanthaminu a jeho derivátů, které byly v extraktu identifikovány Zephyranthes candida Z. candida (br. 8) byla věnována pozornost po fytochemické stránce především v 60. letech minulého století. Při studii alkaloidního obsahu cibulí byl identifikován lykorin, zephyranthin, tazettin, nerinin, haemanthidin 88 a cytostaticky působící alkaloid transdihydronarciklasin 89. Ve screeningové studii vykázal z cibulí připravený toluenový a methanolový extrakt slabou inhibiční aktivitu k AChE 38 33

34 br. 8 Zephyranthes candida Další druhy rodu Zephyranthes V následujícím přehledu jsou shrnuty další druhy rodu Zephyranthes, kterým byla doposud věnována pozornost po fytochemické stránce. U každého druhu jsou uvedeny alkaloidy, jež byly v dané rostlině identifikovány (Tab. IV). ejnovější práce, které se zabývají alkaloidy rodu Zephyranthes, jejich izolací, identifikací a stanovením anticholinesterázové aktivity byly vypracovány na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie Farmaceutické fakulty v radci Králové. Zjištěné výsledky byly publikovány v mezinárodních časopisech s fytochemickou tématikou 91,92. Tabulka IV Druh Další druhy rodu Zephyranthes a jejich alkaloidy Izolované alkaloidy Z. citrina galanthin, haemathamin, lykorin, lykorenin, oxomaritidin, maritidin, vittatin, narcissidin 93,94 Z. robusta galanthamin, lykoramin, vittatin, nerbowdin, haemathamin, tazettin, galanthin 91 34

35 4. EXPERIMETÁLÍ ČÁST 35

36 4.1 Všeobecné postupy Destilace a odpařování Rozpouštědla byla před použitím destilována, nejprve byl zachycen předek (asi 5 %, většinou s vodným azeotropem), poté bylo vydestilováno zbylých cca 90 % rozpouštědla. Rozpouštědla byla uchovávána v hnědých nádobách. dpařování chromatografických frakcí bylo prováděno na vakuové odparce Bűchi Rotavapor R 114 vybavené vodní lázní Bűchi Waterpath B-480 při 40 C za sníženého tlaku Tenkovrstvá chromatografie Chromatografie na tenké vrstvě byla prováděna v systému normálních komor. Ty byly nasyceny mobilní fází. Sycení komor trvalo 30 minut. V případě komor pro preparativní tenkovrstvou chromatografii 60 minut. Chromatografie byla prováděná vzestupně Materiál a vybavení Rozpouštědla Cyklohexan, p.a. (Penta) Diethylamin, p.a. (Lachner) Diethyleter, p.a. (Penta) Ethanol 95%, denaturovaný methanolem, p.a. Ethylacetát, p.a. (Penta) Chloroform, p.a. (Penta) Methanol LC-MS CRMASLV (Sigma-Aldrich) Toluen, p.a. (Penta) Chemikálie Amoniak, 25% vodný roztok, p.a. (Lachema) Kyselina chlorovodíková 35%, p. a. (Lachema) 36

37 4.3 Příprava sumárních extraktů a GC/MS analýza Biologický materiál Čerstvé cibule rostlin erine bowdenii, Chlidanthus fragrans, Zephyranthes grandiflora a ymenocalis sp. byly získány od komerčního prodejce Lukon Glands (Sadská, Česká republika). Verifikace vzorků byla provedena doc. RDr. Lubomírem pletalem CSc. Dokladné vzorky jsou uloženy v herbáři na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie Farmaceutické fakulty v radci Králové Příprava ethanolového a alkaloidního extraktu Čerstvé cibule rostlin (3 15 g) byly rozemlety a extrahovány ethanolem (3 50 ml) při pokojové teplotě 24 hodin. Poté byla směs zfiltrována přes křemelinu a rozpouštědlo odpařeno. Bylo odebráno 2 10 mg pro biologické testy (cholinesterázová, antioxidační aktivita). Zbývající odparek byl rozpuštěn v 10 ml 2% Cl a za účelem odstranění neutrálních sloučenin vytřepán diethyletherem (3 15 ml). Poté byl k vodné fázi přidán 25% amoniak a p bylo upraveno na 10. Vodná fáze byla vytřepána ethylacetátem (3 15 ml). rganická fáze byla odpařena do sucha, vysušena v exsikátoru a z každého odparku bylo odebráno 2 10 mg na biologické testy. Zbytek byl rozpuštěn v methanolu LC-MS a připraven roztok o koncentraci 10 mg/ml pro GC/MS analýzu GC/MS analýza a identifikace alkaloidů K identifikaci složek alkaloidních extraktů rostlin bylo použito spojení plynový chromatograf (Focus Thermo Scientific, USA) se split/splitless nástřikem (1:10; 280 C) a hmotnostní spektrometr (200 C, GC-MS MD 800 Fisons, Manchester, UK) s ionizací nárazem elektronů při 70 ev. K separaci látek byla použita kolona DB-5 (5% fenylmethylsilikon) 30 0,25 mm s tloušťkou vrstvy 0,25 µm (Agilent Technologies Santa Clara, CA, USA). Teplotní program analýzy: C, 15 C/min; 180 C, 1 min; C, 5 C/min; 300 C, 5 min; interval detekce iontů m/z Průtok nosného plynu (helium) 1 ml/min. K identifikaci složek bylo použito porovnání jejich hmotnostních spekter s těmi, která byla zahrnuta v knihovně spekter ational Institute of Standards and Technology Library (IST 08, USA), porovnáním s daty v literatuře a s izolovanými či komerčně dostupnými standardy. 37

38 4.4 Izolace a strukturní analýza belladinu z erine bowdenii Alkaloidní extrakt z cibulí erine bowdenii byl nanesen na preparační TLC desky (Silikagel 60, F 254, Merck). Desky byly vyvíjeny v mobilní fázi To:Et 2 (95:5, třikrát). Byly izolovány čtyři podfrakce A1 A4. Podfrakce A1 (45 mg) byla opět nanesena na chromatografické desky a vyvíjena v mobilní fázi cx:et 2 (95:5, třikrát). Bylo získáno 20 mg čisté olejovité látky, která na základě MS, MR analýzy a porovnáním těchto dat s literaturou byla identifikována jako belladin. Vzhledem k malým množstvím ostatních podfrakcí (A2 A4) nebyly tyto směsi použity pro další izolace čistých látek MS analýza motnostní spektra belladinu byla měřena na LC/MS Thermo Finningan LCQDuo, iontová past, ionizace elektrosprejem v kladném módu (ESI + ). Látka byla rozpuštěna v methanolu LC-MS MR analýza MR spektra byla měřena na spektrometru Varian Inova 500 s pracovní frekvencí Mz pro 1 a Mz pro 13 jádra. 13 C MR spektra byla měřena v 5 mm SW širokopásmové sondě, 1 a všechna 2D spektra v inverzní 5mm ID PFG sondě s využitím standardních pulzních sekvencí. Experimenty byly měřeny v deuterochloroformu při 25 C. odnoty chemických posunů jsou v ppm a jsou vztaženy k internímu standardu (hexamethyldisilan; 0,04 ppm v 1 spektrech) nebo signálu solventu (76,99 ppm v 13 C spektrech). 4.5 Stanovení inhibiční aktivity alkaloidních extraktů a čistých alkaloidů vůči erytrocytární AChE a sérové BuChE Chemikálie a materiál použité pro stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity Chemikálie: 10mM acetylthiocholin jodid (Sigma-Adrich) 10mM butyrylthiocholin jodid (Sigma-Adrich) 38

39 0,1M fosfátový pufr, p 7,4 (chemikálie pro přípravu pufru: dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného, p.a. (Lachema); dodekahydrát hydrogenfosfrečnanu disodného, p.a. (Lachema) 5mM 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina, 98% (Sigma-Aldrich) uperzin A (TAZGUI Tai an zhonghui Plant Biochemical Co., Ltd., China) Galanthamin hydrobromid (Changsha rganic aerb Inc., China) Dimethylsulfoxid (Sigma-Adrich) Materiál: Jako zdroj acetylcholinesterázy byla použita pouzdra lidských erytrocytů. Zdrojem butyrylcholinesterázy byla lidská plazma. Měření bylo prováděno v jednorázových semimikro-polystyrénových kyvetách 1,5 ml PLASTIBRAD Přístroj použitý pro stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity Spektrofotometr UV-1601 CE SIMADZU Podmínky měření Experimenty byly prováděny za těchto podmínek: - při laboratorní teplotě - v prostředí fosfátového pufru (p 7,4) - při vlnové délce spektrofotometru 436 nm - v jednorázových polystyrénových kyvetách (optická délka 10 mm) Příprava erytrocytárních pouzder Erytrocytární pouzdra byla připravena z čerstvě odebrané krve, ke které byl přidán 1 ml citrátu sodného na 10 ml krve podle lehce modifikované metody Stecka a Kanta 95. Plazma (ubuche) byla odstraněna z plné krve centrifugací při rychlosti 4000 ot./min za použití centrifugy Boeco U-32R s rotorem ettich Erytrocyty byly přemístěny do 50ml zkumavek a třikrát promyté 5mM fosfátovým pufrem (p 7,4) obsahujícím 150 mm chloridu sodného ( ot./min., Avanti J-301, rotor JA-30.50). Promyté erytrocyty byly míchány s 5mM fosfátovým pufrem (p 7,4) po dobu 10 minut, čímž došlo k jejich lýze. 39