PROTEOMIKA Prezentace z přednášek na adrese:

Transkript

1 2018

2 PROTEOMIKA 2018 Proteomika, proteiny, co a proč. Metody práce s bílkovinami (Petrák 15/10) Značení bílkovin, separační metody, 2-DE (Petrák 22/10) 2-DE záludnosti, digesce a identifikace bílkovin pomocí MS-úvod (Petrák 29/10) Principy hmotnostní spektrometrie (Man 5/11) Identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie (Man 12/11) Shot-gun strategie, kvantitativní metody (Petrák 19/11) Proteomika membránových proteinů, proteinové komplexy (Petrák 26/11) Klinická proteomika, speciální metody, top-down (Petrák 3/12).??? (Petrák 10/12)

3 PROTEOMIKA 2018 Prezentace z přednášek na adrese: Včetně textu Proteomika úvod do studia a doporučené literatury v pdf Scopes Robert, Protein purification. Principles and Practice Springer-Verlag, 3rd edition

4 Co je proteomika? Proteom? Protein? Experimentální strategie proteomiky Vlastnosti AMK a proteinů METODY PRÁCE S PROTEINY dezintegrace, lyzace, frakcionace detergenty srážení, precipitace, denaturace koncentrace, filtrace stanovení koncentrace značení bílkovin separace proteinů

5 Proteom Kompletní sada bílkovin přítomná v daný okamžik v studovaném organismu, tkáni, buňce nebo organele. Zahrnuje PTM, změny lokalizace, jejich metabolický obrat a interakce bílkovin. Proteomika soubor metod, konceptů a přístupů používaných ke kvatitativnímu a kvalitativnímu popisu proteomů Expresní/diferenční proteomika usiluje o (semi) kvantitativní porovnávání proteomů, tj. o identifikcaci bílkovin, které jsou odlišně exprimovány (zastoupeny) mezi dvěma nebo více vzorky.

6 PROČ PROTEOMIKA KDYŽ MÁME TRANSKRIPTOMIKU?»!!! špatná korelace hladin mrna a skutečných hladin bílkovin!!! alternativní sestřih, RNA editing, stabilita mrna vliv mikrorna+pirna a RNA-vazebných proteinů regulace translace (rychlost, preference cap, poly (A) a UTR) alternativní translace cílená degradace proteinu (N -end rule, PEST sekvence, export, komplexy) cca 400 typů posttranslačních modifikací? PROTOŽE PROTEINY A NIKOLIV GENY PŘEDSTAVUJÍ FENOTYP! (PROTEOTYP?)

7 Rozpětí koncentrace/počtu kopií jednotlivých proteinů na buňku ( ) Schwanhäusser B, et al. Nature. 2011;473(7347): corrigendum in Nature, March 2013

8 Stabilita mrna a stabilita proteinu Schwanhäusser B, et al. Nature. 2011;473(7347): corrigendum in Nature, March 2013

9 Stabilita mrna/stabilita proteinu Schwanhäusser B, et al. Nature. 2011;473(7347):

10 Rychlost transkripce a translace Schwanhäusser B, et al. Nature. 2011;473(7347): corrigendum in Nature, March 2013

11 Kolik kopií proteinu vznikne z jedné molekuly mrna? Wilhelm M, et al Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature May 29;509(7502):582-7.

12 Komplexita proteomu Kolik je proteinů? ~ lidských genů Existence proteinu prokázána pro ~18000

13 Komplexita proteomu Kolik je proteinů? ~ lidských genů? mrna? 4-6 různých (+ ncrnas)??? Proteinů??? Kódující gen mrna mrna mrna mrna mrna JAK JE DEFINOVÁN PROTEIN? GENOCENTRICKÝ vs. PROTEOCENTRICKÝ POHLED PROTEIN a PROTEOFORMA

14 Jak je definován protein? alfa ENOLÁZA ENO1 mrna a enoláza (434 AA, cytosolický enzym) plasminogenový receptor (na PM) MBP-1 (340 AA, jaderný, DNA vazebný) Jsou DVĚ molekuly, lišící se strukturou, funkcí a lokalizací JEDNÍM proteinem? Je protein definován kódujícím genem? Strukturou? Funkcí?

15 Jak je definován protein? Angiotensin converting enzyme (ACE) Nejméně dva tkáňové specifické transkripty Dva odlišné membránové proteiny, dva rozpustné cirkulující proteiny s odlišnou funkcí Jungblut, PR. et al.

16 Jak je definován protein? Protein versus proteoforma HSP27 nejméně 30 proteoforem Enolase 1 38 proteoforem Heat shock cognate 71 kda protein 31 Vimentin 29 atd Thiede B, et al. Mol Cell Proteomics Feb;12(2): Jungblut PR, et al, 2008 Chem Cent J Jul 18;2:16.

17 Komplexita proteomu Kolik je proteinů? ~ lidských genů? mrna???? Proteinů??? mrna Kódující gen mrna mrna mrna mrna 3 PROTEOFORMY versus 1 PROTEIN nebo 1 PROTEIN GROUP

18 Dosud nejdetailnější mapa lidského proteomu Wilhelm M, et al Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature May 29;509(7502): Kim MS, et al. A draft map of the human proteome. Nature May 29;509(7502):

20 KLASICKÁ STRATEGIE PROTEOMICKÝ EXPERIMENT Separace směsi BÍLKOVIN Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace Štěpení vybraných bílkovin + čištění peptidů Měření přesné hmotnosti peptidů ( a jejich fragmentů) Získání hmotnostních spekter Porovnání hmotností sady peptidů (jejich fragmentů) s údaji o všech dostupných ORFs v databázích Identifikace bílkovin

21 KLASICKÁ STRATEGIE PROTEOMICKÝ EXPERIMENT Štěpení všech bílkovin (trypsin) Separace směsi BÍLKOVIN Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace Separace směsi PEPTIDŮ Štěpení vybraných bílkovin + čištění peptidů Měření přesné hmotnosti peptidů ( a jejich fragmentů) Získání hmotnostních spekter SHOT-GUN STRATEGIE Porovnání hmotností sady peptidů (jejich fragmentů) s údaji o všech dostupných ORFs v databázích Identifikace bílkovin (+ kvantifikace)

23 Ser-Tyr Cys

24 GLYCIN K.GLUTAMOVÁ Kyselé a zásadité skupiny polypeptidu jsou protonovány a deprotonovány v závislosti na ph prostředí. Izoelektrický bod (pi) AMK

25

26 KLADNĚ NABITÉ AMINOKYSELINY (ph 7) +

27 ph 7 ZÁPORNĚ NABITÉ AMINOKYSELINY

28 Další skupiny ionizovatelné v bazickém prostředí

29 Izoelektrický bod bílkovin Celkový náboj proteinu (net charge) je součtem všech jeho negativních i pozitivních nábojů. Kyselé a zásadité skupiny polypeptidu jsou protonovány a deprotonovány v závislosti na ph prostředí. ph < pi ph=pi ph > pi

30 Izoelektrický bod bílkovin Proteiny mají nejnižší rozpustnost v oblasti ph kolem jejich izoelektrického bodu!!! Kontaminace, ztráty, degradace, modifikace, reproducibilita

31 Velikost proteinu (MW) Vypočteno na základě AA sekvence, nezapočítány PTM

32 Rozpětí koncentrace/počtu kopií jednotlivých proteinů na buňku ( ) Schwanhäusser B, et al. Nature. 2011;473(7347): corrigendum in Nature, March 2013

33 Rozpětí koncentrace/počtu kopií jednotlivých proteinů na buňku ( ) Desítky kopií až desítky milionú kopií na buňku Beck et al., Mol Syst Biol Nov 8;7:549

34 Hydrofobicita proteinu Amino Acid Name One Letter Code Hydropathy Score Isoleucine I 4.5 Valine V 4.2 Leucine L 3.8 Phenylalanine F 2.8 Cysteine C 2.5 Methionine M 1.9 Alanine A 1.8 Glycine G -0.4 Threonine T -0.7 Tryptophan W -0.9 Serine S -0.8 Tyrosine Y -1.3 Proline P -1.6 Histidine H -3.2 Glutamic acid E -3.5 Glutamine Q -3.5 Aspartic acid D -3.5 Asparagine N -3.5 Lysine K -3.9 Arginine R -4.5 GRAVY SCORE Grand average hydropathy (součet hydrofobicity (-4.5 až 4.5) jednotlivých aminokyselin dělený počtem aminokyselin)

35 Hydrofobicita proteinu Spíš rozpustné GRAVY SCORE Grand average hydropathy (součet hydrofobicity (-4.5 až 4.5) jednotlivých aminokyselin dělený počtem aminokyselin) Spíš transmembránové Kyte, J., and Doolittle, R.F. (1982) J.Mol.Biol. 157,

36 KLASICKÁ STRATEGIE PROTEOMICKÝ EXPERIMENT Štěpení všech bílkovin (trypsin) Separace směsi BÍLKOVIN Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace Separace směsi PEPTIDŮ Štěpení vybraných bílkovin + čištění peptidů Měření přesné hmotnosti peptidů ( a jejich fragmentů) Získání hmotnostních spekter SHOT-GUN STRATEGIE Porovnání hmotností sady peptidů (jejich fragmentů) s údaji o všech dostupných ORFs v databázích Identifikace bílkovin (+ kvantifikace)

38 FYZIKÁLNÍ Dezintegrace buňky, homogenizace tkáně Mechanické homogenizátory Mlýny a French press Glass beads Sonikace Hypotonie Zamražení Subfrakcionace FYZIKÁLNE-CHEMICKÉ, CHEMICKÉ Detergenty Organická rozpouštědla Enzymatická příprava protoplastů (lysozym, zymoláza, celuláza)

39 Dounce homogenizer Potter-Elvehjem homogenizer

40 Ultrazvukový homogenizátor Bead beater French press Střižný homogenizátor Třecí miska

41

42

44 Detergenty - amfifilní molekuly vytvářející ve vodě micely - interagují s hydrofobní částí proteinů i s vodou - dezintegrují membrány a solubilizují proteiny SDS

45 Properties of common detergents. Agg.# = Aggregation number, which is the number of molecules per micelle. CMC Critical Micellar Concentration Detergent Type Agg.# MW mono (micelle) CMC mm (%w/v) Cloud Point C Dialyzable Triton X-100 Nonionic (90K) 0.24 (0.0155) 64 No Triton X-114 Nonionic 537 ( ) 0.21 (0.0113) 23 No NP-40 Nonionic (90K) 0.29 (0.0179) 80 No Brij-35 Nonionic (49K) 0.09 (0.0110) >100 No Brij-58 Nonionic (82K) 0.08 (0.0086) >100 No Tween 20 Nonionic 1228 ( ) 0.06 (0.0074) 95 No Tween 80 Nonionic (76K) 0.01 (0.0016) No Octyl glucoside Nonionic (8K) (~0.70) >100 Yes Octyl thioglucoside Nonionic 308 ( ) 9 (0.2772) >100 Yes SDS Anionic (18K) 6-8 ( ) >100 No CHAPS Zwitterionic (6K) 8-10 ( ) >100 Yes CHAPSO Zwitterionic (7K) 8-10 (~0.505) 90 Yes

46 CMC (kritická micelární koncentrace) koncentrace volného detregentu při jejímž překročení se vytvářejí micely definované velikosti (62 molekul pro SDS, 18 kda)

47 CMC (kritická micelární koncentrace) koncentrace volného detregentu při jejímž překročení se vytvářejí micely definované velikosti (62 molekul pro SDS, 18 k) Roste s T a klesá s I.

48 Koncentrace nad CMC Koncentrace pod CMC

49 Koncentrace nad CMC Not dissolved or Koncentrace pod CMC

50 Detergenty Ionogenní (SDS, CHAPS,deoxycholate ) Silnější, často denaturující ANIONICKÉ ZWITTERIONOVÉ CHAPS

51 Detergenty Neionogenní Triton X-100 Triton X-114 Tween 20 Tween 40 Nonidet Digitonin

52 Detergenty CP (cloud point) teplota při jejímž překročení dochází agregaci micel a k fázové separaci (polyoxyethylenových ) detergentů od vodného pufru

53 Properties of common detergents. Agg.# = Aggregation number, which is the number of molecules per micelle. Detergent Type Agg.# MW mono (micelle) CMC mm (%w/v) Cloud Point C Dialyzable Triton X-100 Nonionic (90K) 0.24 (0.0155) 64 No Triton X-114 Nonionic 537 ( ) 0.21 (0.0113) 23 No NP-40 Nonionic (90K) 0.29 (0.0179) 80 No Brij-35 Nonionic (49K) 0.09 (0.0110) >100 No Brij-58 Nonionic (82K) 0.08 (0.0086) >100 No Tween 20 Nonionic 1228 ( ) 0.06 (0.0074) 95 No Tween 80 Nonionic (76K) 0.01 (0.0016) No Octyl glucoside Nonionic (8K) (~0.70) >100 Yes Octyl thioglucoside Nonionic 308 ( ) 9 (0.2772) >100 Yes SDS Anionic (18K) 6-8 ( ) >100 No CHAPS Zwitterionic (6K) 8-10 ( ) >100 Yes CHAPSO Zwitterionic (7K) 8-10 (~0.505) 90 Yes

54 Detergenty CP (cloud point) teplota při jejímž překročení dochází agregaci micel a k fázové separaci (polyoxyethylenových ) detergentů od vodného pufru Triton X114 (22 o C ) Fázová separace Tritonem X-114 metoda frakcionace hydrofobních membránových proteinů ohřátím nad CP. Poloha detergentové frakce závisí na hustotě pufru.