OPVK CZ.1.07/2.2.00/

Transkript

1 OPVK CZ.1.07/2.2.00/

2 Základní principy vývoje nových léčiv OCH/ZPVNL Mgr. Radim Nencka, Ph.D. ZS 2012/2013

3 První kroky k objevu léčiva

4 Nobelova cena za chemii 2013 Martin Karplus Michael Levitt Arieh Warshel "or the development of multiscale models for complex chemical systems"

5 Přístupy k objevování nových léčiv Chemistry&Biology, 2012, 72 84

6 Přístupy k objevování nových léčiv Nature Reviews Drug Discovery 2011, 10,

7 Target-based drug discovery

8 Identifikace cíle

9 Vlastnosti optimálního biologického cíle 1. Biologický cíl má významnou roli v patofyziologii onemocnění a/nebo významně ovlivňuje cílené onemocnění 2. Vliv modulace daného biologického cíle je méně významná za fyziologických podmínek než za nemoci 3. Výhodou může být známá krystalová struktura potenciálního cíle případně jiná strukturní informace

10 Vlastnosti optimálního biologického cíle

11 Vlastnosti optimálního biologického cíle 4. Zásadní je možnost připravit esej pro testování malých molekul HTS 5. Selektivita cíle: Mezidruhová selektivita - jiné enzymy u mikroorganismů než u člověka Neuniformní exprese v jednotlivých tkáních Multitargeting 6. Možná predikce vedlejších účinků 7. Příznivá IP situace

12 Identifikace biologického cíle Určení onemocnění Určení biologického cíle Dříve Léčivo neznámý target žádoucí odpověď (morfin analgetický účinek) Od cca 1970 objevování massangerů (endorfiny a enkefaliny)

13 Identifikace biologického cíle Dnes Bioinformatika Pokrok v genomice, transkriptomice a proteomice Poprvé objevování nových targetů bez ligandů

14 Molekulárně biologické intermezzo DNA mrna aktivní protein

15 Molekulárně biologické intermezzo DNA DNA Pre-mRNA Posttranskripční modifikace mrna mrna mrna aktivní protein

16 Molekulárně biologické intermezzo DNA DNA Pre-mRNA Posttranskripční modifikace mrna mrna mrna aktivní protein protein aktivní protein Posttranslační modifikace proteinu

17 Molekulárně biologické intermezzo DNA DNA Genom Pre-mRNA Posttranskripční modifikace mrna mrna mrna Transkriptom aktivní protein protein aktivní protein Posttranslační modifikace proteinu Proteom

18 Proteinové kinázy a regulace proteinu fosforylace tento proces je zprostředkován enzymy, které nazýváme proteinové kinasy přenašejí fosfátový zbytek z ATP na vybrané aminokyseliny jako např. serin/treonin nebo tyrosin konformační změna proteinu v závislosti na jeho fosforylaci regulace funkce jedné z proteinových kináz cyklindependentní kinázy 2 (CDK2), která musí být pro svou funkčnost sama fosforylována fosforylace umožňuje vazbu proteinu,který je dále fosforylován CDK2

19 Proteinové kinázy a regulace proteinu

20 Identifikace biologického cíle Nature Reviews Drud Discovery 2004,

21 Bioinformatika Identifikace rodiny genů pomocí vyhledávání sekvencí založeno na vyhledávání shody nebo podobnosti sekvencí Vyhledávání nových členů rodin, které jsou již známé jako vhodné biologické cíle Relativně snadné je to u sekvencí se shodou nad 30% - metody vyhledávaní shody jako BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) nebo FASTA Příklad GPCR dvě třetiny členů má pouze jeden exon = snadnější vyhledávání pro některé byly následně nalezeny ligandy x jiné stále orphan receptory

22 Moderní metodiky pro identifikaci cílů DNA microarrays slouží např. pro profilovaní RNA mikročipy s vysokou hustotou DNA na skle Až 500,000 krátkých DNA sekvencí ( mery) Determinace až 10,000 genu v jednom hybridizačním kroku i z tak mala jako 10ng RNA Přestože hledáme vlastně proteiny a není plná korelace s RNA profilování RNA má několik výhod

23 Moderní metodiky pro identifikaci cílů DNA microarrays

24 Moderní metodiky pro identifikaci cílů DNA microarrays Wikipedia

25 Profilování RNA Výhody: High-throughput Široké pokrytí genomu Malé množství vzorku Nevýhody: Ne vždy koreluje s množstvím proteinu Nezohledňuje modifikace a interakce proteinu

26 High-Throughput Next Gen Sequencing

27 Moderní metodiky pro identifikaci cílů Proteomika 2D Gelová elektroforéza Hmotnostní spektrometrie v kombinaci s HPLC Proteinové mikročipy (microarrays)

28 Moderní metodiky pro identifikaci cílů Proteomics in antitumor research, Drug Discovery Today: Technologies Volume 3, Issue 4, 2006,

29 2D gelová elektroforéza (2D-PAGE) Isoelectric focusing (IEF) rozdělení podle isoelektrického bodu (pi) IEF IPG strips

30 2D gelová elektroforéza (2D-PAGE) sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS- PAGE) denaturace pomocí dodecylsulfátu sodného navázaní SDS negativní náboj rozdělení dle MW SDS

31 2D gelová elektroforéza (2D-PAGE) různé možnosti detekce - Coomassie, stříbro, Flamingo, SYPRO Rozštěpení trypsinem na peptidy Identifikace proteinu Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF, ESI-MS/MS + Sekvenční analýzy peptidů

32 Shotgun přístupy LC-MS/MS RP-kapalinová chromatografie spojená s MS/MS MudPIT Multidimensional protein identification technology Dvoudimenzionální kapalinová chromatografie Silný katex + RP-LC spojeno s Ms/MS analýzou ICAT Isotope-coded affinity tags Kvantitativní analýza porovnání dvou vzorků každý značený jiným izotopem

33 Proteinové mikročipy Protein analysis on a proteomic scale Nature 422, /protein_array_analysis.html

34 Další metodiky identifikace a validace Analýza funkce genů pomocí cdna knihoven a RNAi Exprese gene-by-gene v miniaturizovaných buněčných esejích Rozsáhlé knockdown eseje na savčích buněčných liniích Two yeast-hybrid system

35 Validace Další metodiky identifikace a validace zahrnuje prověření že Daný biologický cíl se vyskytuje buňkách nebo tkáních,které mají relevanci k danému onemocnění. Může být ovlivněn molekulou, která má chrakter léčiva. Může být připravena screeningová esej pro tento cíl. Musí vykazovat požadovaný fenotyp na buněčných nebo zvířecích modelech.

36 Validace Další metodiky identifikace a validace Oligonukleotidy knockdown cílových genů Antisense RNA interference (RNAi)

37 Validace biologických cílů In vitro na buněčných liniích In vivo na zvířatech knockout Drosophila melanogaster zajímavé modely pro Alzheimerovu a Parkinsonovu chorobu Danio rerio - zebřička Transgenní myši

38 Fenotypový screening target deconvolution Postup z opačné strany známe ligand, který se váže na náš biologický cíl, ale nevíme jaký je ten cíl Pojem deconvolution použivaný proto, že velmi často se nejedná pouze o jeden cíl Léčivá látka v průměru interguje s 6 molekularními cíli

39 Fenotypový screening target deconvolution

40 Fenotypový screening target deconvolution

41