Základy hmotnostní spektrometrie

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Základy hmotnostní spektrometrie"

Romana Novotná
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Základy hmotnostní spektrometrie

2 Hmotnostní spektrometrie Spektrometrické metody metody založen ené na interakci hmoty a záenz ení Hmotnostní spektrometrie je fyzikáln ln chemická metoda, která využívá elektrické a magnetické pole k separaci nabitých týchástic s cílem c urit jejich hmotnost (pomr r m/z)

ln chemická metoda, která využívá elektrické a magnetické pole k

3 Kvalitativní Organická hmotnostní spektrometrie k charakterizaci (identifikaci) organických slouenin na základz klad hmotnosti molekulárn rních iont, adukt a fragment ke studiu reakcí iont v plynné fázi Kvantitativní pro kvantifikaci organických slouenin ve vzorku na základz klad intenzity odezvy detektoru pro vybraný ion nebo skupinu iont

fragment ke studiu reakcí iont v plynné fázi Kvantitativní pro kvantifikaci

4 Základní pojmy Hmotnost (m) Da (Dalton), u poet atomových hmotnostních jednotek, íseln rovný molárn rní hmotnosti m/z úinná hmotnost Poet nábojn boj (z) z - poet elementárn rních nábojn boj (vtšinou 1) Ionty pozitivní a negativní NE kationty a anionty Hmotnostní spektrometrie NE spektroskopie

boj (z) z - poet elementárn rních nábojn boj (vtšinou 1) Ionty pozitivní

5 Hmotnostní spektrometr Iontový zdroj - pevod neutráln lních (i nabitých tých) ) látek l na ionty v plynné fázi Hmotnostní analyzátor separace iont podle pomru m/z Detektor detekce iont

6 Iontové zdroje Iontový zdroj - pevod neutráln lních (i nabitých tých) ) látek l na ionty v plynné fázi Neexistuje univerzáln lní ionizaní technika pro všechny molekuly, pro rznr zné typy slouenin jsou vhodné rzné ionizaní techniky Rozdlen lení ionizaních technik Tvrdé Mkké Ionty M + e - M e - M + HA [M+H] + + A - M + B - [M-H] - + HB (Viz. následujn sledující pednáška M. Šandy)

slouenin jsou vhodné rzné ionizaní techniky Rozdlen lení ionizaních technik Tvrdé Mkké Ionty M +

7 Hmotnostní analyzátory Hmotnostní analyzátor separace iont v plynné fázi podle pomru m/z (využívá princip pohybu nabitých týchástic v elektrickém m nebo magnetickém m poli) Hmotnostní analyzátory Skenující - postupn propouští ionty rzných r hmotností (sektor, kvadrupól) Zadržuj ující ionty zachytí ionty, pak je analyzuje (iontová past, orbitrap, ICR) Prletový mías, který potebuj ebují ionty k pekonání dané vzdálenosti (TOF) Viz. pednp ednáška v 11:00 h

ionty rzných r hmotností (sektor, kvadrupól) Zadržuj ující ionty zachytí ionty, pak je analyzuje (iontová past,

8 Detektory, vakuová technika Detektor - zaízen zení pevádjící menou veliinu inu na elektrický proud MS pevádí proud nabitých týchástic na elektrický proud ICR a ORBITRAP výjimka nepotebuj ebují detektor signálem je proud indukovaný ve stn analyzátoru Vakuováerpadla Pro vakuum? Ve vakuu nedochází ke srážkám m iont s neutráln lními ásticemi zvýší se stedn ední volná dráha letu Dvojstupov ová evakuace 1. pedvakuum (100 0,1 Pa), rotaní olejová pumpa 2. vysoké vakuum (0, Pa), difuzní pumpa, turbomolekulárn rní pumpa

9 Vakuová technika difuzní pumpa turbomolekulárn rní pumpa

10 Hmotnostní spektrum

11 Hmotnostní spektrum Hmotnostní spektrum grafické znázorn zornní závislosti intenzity iont na jejich pomru hmotnosti ku náboji n (m/z) Kontinuáln lní (profilové) záznam znam detektoru umož žuje odeíst šíku píku Centroidové (histogram) pevedeno na sloupcový graf pehlednjší poloha = tžt žišt píku, intenzita = výška nebo plocha píkup Spektra normalizována na rozsah osy y 0-100% spektrum profilové histogram

šíku píku Centroidové (histogram) pevedeno na sloupcový graf pehlednjší poloha = tžt žišt píku,

12 Izotopové klastry Izotopy - atomy chemického ho prvku, které mají stejný poet proton, ale rozdílný poet neutron,, tedy stejné atomovéíslo a rozdílnou atomovou hmotnost Pírodní smsi si izotop - zastoupení izotop jednotlivých prvk je konstantní Prvky X (monoizotopické): 19F, 23Na, 31P, 127I X+1: vodík (1H, 2H), uhlík (12C, 13C), dusík k (14N, 15N) X+2: chlor (35Cl, 37Cl), brom (79Br, 81Br) kyslík (16O, 18O)

zastoupení izotop jednotlivých prvk je konstantní Prvky X (monoizotopické): 19F, 23Na, 31P, 127I X+1:

13 Izotopové klastry Izotopové složen ení víceatomového iontu je dáno d kombinací izotopového složen ení atom,, které jej tvoí

14 Izotopové klastry alkoholdehydrogenáza C 1764 H 2859 N 469 O 516 S 26

15 Hmotnost iontu v MS Nominální hmotnost: z celoíselných hmotností prvk (p.. CO 2 : 12u + 2 x 16u = 44 u) Monoizotopická hmotnost: z pesných p hmotnostní prvk nejvíce zastoupených izotop (p.. CO 2 : x = ) Prmrn rná hmotnost: vážený prmr r hmotností jednotlivých izotop podle jejich zastoupení (p.. CO 2 : x = 44.01) P.: inzulín C 257 H 383 N 65 O 77 S 6

zastoupených izotop (p.. CO 2 : 12.0000 + 2 x 15.9949 = 43.

16 Vícenásobn nabité ionty [M M + 3H] 3+ [M M + 2H] 2+ [M M + H] H + [M + H] + [M + 2H] 2+ [M + 3H] 3+

17 Dimery, multimery [2M + H] + [M + H] + i trimery, tetramery, diference o m

18 Rozlišen ení Míra separace dvou pilehlých p pík Rozlišen ení 10% údolí nejmenší rozdíl l hmotností mezi stejn vysokými píky, p u nichž je výška údolí rovna definovanému zlomku výšky pík (nap. 10% údolí) pro sektorové pístroje (konstantní rozlišen ení pro celý hmotnostní rozsah) Rozlišen ení FWHM (full( width at half maximum) pomr r hmotnosti iontu a šíky jeho píku p v polovin výšky pro kvadrupóly ly,, iontové pasti, prletov letové analyzátory (konstantní šíka píkup ku) 10% údolí FWHM R = m/ m

10% údolí) pro sektorové pístroje (konstantní rozlišen ení pro celý hmotnostní rozsah) Rozlišen ení FWHM (full( width at

19 Pesnost uren ení hmotnosti vyjáden ení schopnosti hmotnostního ho analyzátoru urit správnou hodnotu m/z Nomináln lní hmotnost zm ena na pístroji p s jednotkovým (nízkým) rozlišen ením nap.. odliší šíme od sebe ionty m/z 500 od 501 Pesná hmotnost zm ena na pístroji p s vysokým rozlišen ením, pesnost se vyjaduje v ppm ( pesná hmotnost < 5 ppm) nap.. rozliší šíme m/z m 500 od lepší pesnost uren ení elementárn rního složen ení Kalibrace seízen zení iontové optiky tak, aby nam ené spektrum smsi si látek l se známými pomry m/zm odpovídalo dalo jejich teoretickým hodnotám Kalibraní smsi: si: polyethylenglykoly, klastry NaI, CsI, smsi si peptid, UltramarkTM (fluor luorované fosfazeny), komerní smsi si

20 Praktické dsledky Nízké rozlišen ení vysoké rozlišen ení

21 MS/MS, MS n Tandemová hmotnostní spektrometrie 1. separace iontu 2. fragmentace vybraného iontu 3. detekce fragment CID - procesy v kolizní cele urychlení iont elektrickým polem srážky iont s neutráln lními molekulami (N 2, Ar, He) v kolizní cele zvyšov ování energie ion rozpad iont urov ování struktury, specifická detekce

22 MS jako detektor v separaních On-line spojení s metodách plynovou chromatografií (GC/MS) kapalinovou chromatografií (HPLC/MS) kapilárn rní zónovou elektroforézou (CZE/MS) Výhody vysoká citlivost vysoká selektivita univerzálnost kvantitativní i kvalitativní analýza Nevýhody vyšší cena pístrojep vyšší odborné nároky na operátora

23 GC/MS První chromatografická metoda spojená s MS malý prtok nosného plynu kompatibilní s MS Instrumentace Analyty: iontové zdroje: EI, CI analyzátory: Q, IT mén polárn rní,, termáln ln stabilní,, s nízkou n molekulovou hmotností Široce využívan vaná technika analýza složitých smsí (nap. environmentáln lní a forenzní analýzy) možnost prohledávat databáze MS spekter rychlá identifikace látek

24 GC/MS záznamz znam

25 Spojení HPLC pozdji HPLC/MS odpaen ení velký objem plynu = technický problém ešení API zdroje (APCI, APPI, ESI) Instrumentace iontové zdroje: APCI, APPI, ESI analyzátory: Q, IT, orbitrap,, TOF Analyty: od malých molekul po biopolymery od málo m polárn rních po iontové omezen kompatibilní MF s pufry a iont-párovými inidly analýza potravin, léiv, l proteomika,, atd. Rychle se rozšiuj ující oblast MS

26 Zatím m málo m rozší šíená Výhody CZE/MS velmi vysoká separaní úinnost analýza iont nízká spoteba vzorku Technické problémy ovlivov ování separaního naptí a naptí zdroje malá kompatibilita separaních pufr s MS Analyty analýza peptid,, identifikace protein

27 Historie MS v R R (SSR)( Konstrukce prvního hmotnostního ho spektrometru (1953) V. ermák, V. Hanuš,.. Jech, J. Cabicar Ústav fyzikáln lní chemie a elektrochemie SAV První komerní MS instrumenty MCH-1303 (poátek 60.let) Ústav fyzikáln lní chemie SAV Ústav organické chemie a biochemie

28 Dkuji za pozornost

Podobné dokumenty

INTERPRETACE HMOTNOSTNÍCH SPEKTER

INTERPRETACE HMOTNOSTNÍCH SPEKTER Hmotnostní spektrometrie hmotnostní spektrometrie = fyzikálně chemická metoda založená na rozdělení hmotnosti iontů v plynné fázi podle jejich poměru hmotnosti a náboje