Vybranné interpretace měkkých MS a MS/MS spekter

Transkript

1 Vybranné interpretace měkkých MS a MS/MS spekter

2 o. 1- určete MW, vysvětlení izotopů ESI/APCI + [M+H] () MW=324 1 chlor ( 35 Cl/ 37 Cl=:32) [TEA] (35) 327 (33) 326 (15) 328 (5) ESI/APCI - [M-H] () [HS 4 ] - 97 (51) 325 (32) 324 (13) 326 (6) šum bude v dalších spektrech pro jednoduchost zanedbán - izotopické píky nebudou většinou zakresleny

3 o. 2 - určete MW, popište ionty APCI [M+H 4 ] [M+CH 3 C] - D = 2 Úkol: jaké změny očekáváte po přídavku 5 mm octanu amonného do mobilní fáze APCI - [M+H] () [M+a] (29) 441 (5) D = 38 [M-H] () D = 22 [M+K] + MW=402 D =

4 o. 4 APCI + MW=421 1 brom lichý počet dusíků karboxylová skupina MF obsahuje H 4 CH 3 C 288 (5) 316 (4) [M+H] () 424 (96) [M+H-C 2 ] + [M+H 4 ] (2) 378 (2) 439 (5) 441 (5) APCI - [CH 3 C] - [M-H-C 2 ] - 59 (51) 378 (22) 376 (22) [M-H] () 422 (98) 480 (5) [M+CH 3 C] (5) APCI +, MS/MS 422 [M+H-C 2 ] () 380 (97) [M+H] (2) 424 (2)

5 o. 5 - určete MW ESI A/ [M+2H] 2+ B/ [M+H] + A/ [M+H] + B/ [2M+H] + A: MW=828 B: MW= A/ B/

6 o. 6 - určete MW a další strukturní informace APCI + [M+H] [M+H- 2 ] + [M+H-] [M+H-] [M+a] [M+H+AC] MW=450 nitroskupina sudý počet dusíků MF obsahuje acetonitril M -. APCI

7 1/ Určete polaritu záznamů. 2/ Určete MW a popište ionty. o. 10 [M+H] + -C 2 H 5 H 28 -C 46 [M-H] - -C 2 H 5 H 46

8 o určete M R a maximum informací APCI APCI - [Br] MW = Br, 1 CH - lichý počet dusíků [M+H-C 2 ] [M+H-C 2 ]+ [M-H]- [M-H-HBr] [M+H] [M+H 4 ] Úkol: nakreslete izotopickou obálku včetně intenzit pro dimerní ion [2M+H]+ [2M+H]

9 o. 9 - určete MW, popište ionty ESI/APCI () 149 (32) Ftaláty [M+H] + [M+a] (29) D = 22 MW=404 D = (4) 443 (5) [M+K] [C 8 H 7 4 ] + D = Výpočet elementárního složení ftalátů: [M+H] + [C 17+8 H ] + = [C 25 H 41 4 ] = /14 = 17 = 17xCH 2 = C 17 H 34 M C 25 H 40 4

10 Příklad interpretace spekter proteinů

11 Schéma značení fragmentových iontů peptidů (typická písemková otázka) Typické fragmenty pro CID MS/MS Typické fragmenty pro ETD, UVPD x 3 y 3 z 3 x 2 z 2 y 1 y 2 x 1 z 1 R1 R2 R3 R4 H 2 C C C C C C C CH H H H H H H H a 1 b 1 c 1 a 2 c 2 a 3 b 3 b 2 c 3 C-C (a, x); peptidová vazba (b, y); -Ca (c, z)

12 o. 8 [M+19H] 19+ [M+18H] Interpretace spektra? jaký typ látky jde? Jakou technikou změřeno? [M+17H] R= [M+20H] [M+16H] [M+15H] Zoom až [M+21H] [M+14H] [M+13H] Příklad výpočtu MW: A = = (MW + z) / z B = = (MW + z + 1) / (z + 1) - řešením vyjde z = = 18 A: MW = * = B: MW = * = , atd. Změřeno pomocí ESI + Protein MW=18521 Da

13 Zadání: Určete o jaký typ sloučeniny se jedná a určete její molekulovou hmotnost. Jakou instrumentací bylo změřeno níže uvedené MS spektrum? Protein - Hemoglobin A (a řetězec) MALDI/TF Zoom až R=16 000

14 Důležitost izotopické distribuce v interpretaci

15 Výchozí informace: bílá krystalická látka měřeno v ESI - Hodnoty ve spektru odpovídají nejintenzivnějším píkům izotopické distribuce jednotlivých iontů D 58 D 60 D D 58 [(acl) n +Cl] - D 58 2*Cl 4*Cl Detaily izotopické distribuce 5*Cl D D D D 58 D D D D *Cl U molekul složených z atomů, které nemají M+1 izotop se nevyskytují píky M+1, M+3, atd.

16 R=35000 Protein v ESI+ [C 769 H S 2 +10H] Interpretace izotopické obálky D je 0.1 (náboj je tedy 10) Protein jednou nabitý [C 769 H S 2 +H] + R= D je 1 (náboj je tedy 1) Klástr AgCl polysacharid R=3000 [(AgCl) 10 Ag] + R=13000 [(C 6 H 10 5 ) 40 +H] D je (náboj je tedy 1) D je Chybí izotopy M+1 atd. (náboj je tedy 1)

17 Určete o jaký typ sloučenin se jedná (všechny ionty jsou jednou nabité) D je 44

18 Interpretace LC/ESI- MS/MS (metabolity léčiv)

19 Metabolismus xenobiotik Základní funkce metabolismu xenobiotik (látky cizí organismu léčiva, pesticidy, kontaminanty, atd.) je transformace na derivát s vyšší rozpustností ve vodě, který může být snáze eliminován z těla Metabolismus xenobiotik má dva základní kroky: I. fáze reakční změny funkčních skupin: oxidační (hydroxylace, epoxidace) a redukční (redukce karbonylu) reakce, dealkylace na heteroatomu, hydrolýza esterů atd. II. fáze konjugační reakce (např. glukuronidace, sulfatace, glykosylace, reakce s aminokyselinami, metylace atd.) I. fáze II. fáze H H S 3 H Experimentální přístup HPLC/MS v obou módech polarity, správná volba ionizační techniky Určení molekulové hmotnosti: I. fáze APCI, ESI, APPI, II. fáze ESI Identifikace metabolitů je založena na interpretaci MS/MS spekter, retenčního chování (retenční indexy), UV spekter z PDA detektoru, popř. informací z dalších spektrálních technik

20 Defekty atomových hmotností Element ominal atomic mass [Da] Mass defect [mda] H C F Si P S Cl Br I ejběžnější metabolické reakce I. fáze ominal mass shift [ΔDa] Metabolic reaction (elemental composition change) Exact mass shift [mda] -44 Decarboxylation (-C 2 ) Alcohol dehydration (-H 2 ) Demethylation (-CH 2 ) Ring formation (-H 2 ) Ring opening (+H 2 ) Hydroxylation and cyclization (+-H 2 ) Hydroxylation (+) -5.1 Epoxidation (+) -5.1 xidation (+) Epoxidation and hydration (+H 2 2 ) +5.5

21 ejběžnější metabolické reakce II. fáze ominal mass shift [ΔDa] Conjugation reaction (elemental composition change) Drug functional group Exact mass shift [mda] +14 Methylation (+CH 2 ) H 2, H, SH Acetyl conjugation (+C 2 H 2 ) H 2, HH 2, S 2 H 2, H Glycine conjugation (+C 2 H 3 ) CH Phosphorylation (+P 3 ) H Sulfation (+S 3 ) H 2, S 2 H 2, H Glucosylation (+C 6 H 10 5 ) H, CH Glucuronidation (+C 6 H 8 6 ) H Indirect carbamate glucuronidation of amines (+C 7 H 8 8 ) H 2 + C X Glutathione conjugation halide substitution (-X+C 10 H S) Halide (X) Glutathione conjugation via epoxidation (+C 10 H S) Aromatic V review celkem popsáno 54 metabolických reakcí I. fáze a 25 reakcí II. fáze M. Holčapek, L. Kolářová, M. obilis, Anal. Bioanal. Chem, 216 (2008) 1962

22 Retence v závislosti na polaritě relativní retence typ metabolizace většina metabolitů (např. hydroxylace, redukce ketonu, dealkylace, glukuronidace, sulfatace, atd.) > 1 např. -oxidace, hydrogenace, b-oxidace, -H 2 (tvorba kruhu), -H 2 (dehydratace alkoholu)

23 jaké metabolity se jedná? H MW=363 -demethylace ba metabolity mají stejné elementární složení - D 31 jejich rozlišení na základě retence (standardy) t CH 3 H 2 R = 21.1 min MS/MS spekter výchozí léčivo D 14 MW=377 t R =21.7 min D 14 MS/MS 378 D 45 (CH 3 ) 2 H ba metabolity mají stejné elementární složení - jejich rozlišení na základě retence (standardy) nebo MS/MS -demethylace MW=363 H t R =13.8 min D 45 (CH 3 ) 2 H

24 jaké metabolity se jedná? MW=393 -oxidace t R = 23.4 min D D 61 (CH 3 ) 2 H výchozí léčivo D 16 MW=377 D 16 t R =21.7 min MS/MS 378 D 45 (CH 3 ) 2 H ba metabolity mají stejné elementární složení - jejich rozlišení na základě retence (standardy) nebo MS/MS hydroxylace MW=393 t R =13.7 min D 45 (CH 3 ) 2 H H

25 Zadání: V LC/HR-MS záznamu vzorku plasmy potkana, kterému bylo perorálně podáno léčivo dimefluron (C 23 H 23 4 ) byly nalezeny dva metabolity o stejném elementárním složení C 28 H jaké metabolity se jedná? (UV spektra výchozí látky a léčiva jsou naprosto odlišná). Fáze I: redukce karbonylu C 28 H C 6 H 8 6 = DC 22 H 23 4 D-C demethylace - C 23 H 23 4 Fáze II: glukuronidace [M+H] +, t R = 10.6 min H D 176 C 6 H 8 6 D 194 C 6 H 10 7 H + GLU [M+H] +, t R =15.7 min H CH 2 CHHCH 3 D 57 D 194 C 6 H GLU D 176 C 6 H 8 6 H

26 Zadání: V LC/HR-MS záznamu vzorku plasmy potkana, kterému bylo perorálně podáno léčivo dimefluron (C 23 H 23 4 ) byly nalezeny dva metabolity (MW=541). a základě HR-MS měření různé elementární složení (viz níže). jaké metabolity se jedná? 1. C 28 H C 29 H [M+H] +, t R =10.6 min 1) Fáze I: demethylace, red. karbonylu 2) Fáze I: red. karbonylu H Fáze II: glukuronidace Fáze II: glukosylace D 176 C 6 H 8 6 výchozí léčivo H + GLU D 194 C 6 H 10 7 D 180 C 6 H 12 6 H H glukosylace [M+H] +, t R = 13.6 min CH 2 H H D 162 C 6 H 10 5

27 Výchozí zadání: V LC/HR-MS záznamu vzorku plasmy potkana, kterému bylo perorálně podáno léčivo benfluron (C 21 H 19 2 ) byl nalezen metabolit o elementárním složení C 21 H 21 6 S. jaký metabolit se jedná? C 21 H 21 6 S S 3 = DC 21 H 21 3 DH 2, - C 21 H 19 2 Fáze I: hydroxylace, redukce karbonylu t R =15.8 min. M=C 21 H 21 6 S Fáze II: sulfatace I. D 80 S 3 H S C 21 H 19 2 H H H nebo II. H S H Kdyby byly 2* místo S, M+2 izotop by měl 4.3 D 71 (CH 3 ) 2 HCH=CH 2 D 45 (CH 3 ) 2 H ESI + - MS/MS (416) D 80 S 3 D 98 H 2 S 4

28 Retence v závislosti na polaritě H CH H relativní retence typ metabolizace H většina metabolitů (např. hydroxylace, redukce ketonu, dealkylace, glukuronidace, sulfatace, atd.) > 1 např. -oxidace, hydrogenace, b-oxidace, -H 2 (tvorba kruhu), -H 2 (dehydratace alkoholu) b-oxidace M2 -H 2 (M6) (tvorba laktonu) R. Jirásko, a kol. Anal. Bioanal. Chem, 405 (2013) 7181.

29 atorvastatin M=558 Význam měření tandemových spekter H CH H D 160 ESI - MS/MS of 557 D 119 D 160 F D 119 D 104 H b-oxidace M=498 b-oxidace + hydroxylace M=514 ESI - D 119 MS/MS of 497 D CH D CH D F F ESI - D 135 MS/MS of 513 H H H D D 119 D 135

30 Význam měření tandemových spekter M=574, C 33 H F = atorvastatin + (kde proběhla oxidace?) H CH H D 135 MS/MS of 573 D 160 F H + + ESI - MS/MS of 573 D struktury fragmentových iontů D nebo F 278 F 294 CH 3 C D 58 CH 3 MS/MS of 573 D 160

31 Další příklady interpretace MS a MS/MS

32 o identifikujte! APCI - 50AC/W 2 CH 2 CH 2 2 C CH 2 2 CH 2 2 MW=316 pentrit APCI - 50AC/W + 5 mm H 4 Cl [M+Cl] ápověda: jde o hlavní složku původního pardubického produktu ápověda 2:... nejde o hmotnostní spektrum perníku:-)

33 Důležitost vysokého rozlišení a MS/MS -87 MS/MS (834) Lipid Prekurzorový ion Typická neutrální ztráta PS 38: [M+a] + D 87 (C 3 H 5 2 ) PC 40: [M+H] + D 59 (C 3 H 9 ) D 183 (C 5 H 14 4 P) HexCer 42: [M+a] + D 162 (C 6 H 10 5 ) D 180 (C 6 H 12 6 )

34 Příklad identifikace degradačních produktů

35 o. 15 identifikujte degradační produkty Výchozí informace: barvivo C.I. Direct Red 7 bylo elektrolyticky degradováno za redukčních podmínek, vzniklé produkty byly analyzovány pomocí HPLC/MS Úkol: identifikujte produkty a navrhněte reakční mechanismus degradace ESI- () 355 H 2 H 3 C CH 3 H 2 Výchozí barvivo C.I. Direct Red 7 (C 34 H S 2 ) S 3 H (52) 711 (10) 733 S 3 H ESI- Degradační produkt A () 237 H 2 H 2 APCI+ Degradační produkt B () 245 H 3 C CH 3 S 3 H H 2 H 2 (12)

36 o. 15 identifikujte degradační produkty barvivo C.I. Acid Yellow 9 bylo elektrochemicky degradováno v acl kvůli čistění odpadních vod, HPLC/ESI-MS záporný mód, v základním skenu převládal ion, ze kterého bylo následně automaticky měřeno MS/MS spektrum H 3 S MS/MS 356 Acid Yellow M R = S 3 H H HPLC A B C 12.9 MS/MS 172 Produkt A 108 MS/MS 173 Produkt B H 3 S H 2 H3 S H

37 o. 15 identifikujte degradační produkty barvivo C.I. Acid Yellow 9 bylo elektrochemicky degradováno v acl kvůli čistění odpadních vod, HPLC/ESI-MS záporný mód, v základním skenu převládal ion, ze kterého bylo následně automaticky měřeno MS/MS spektrum H 3 S MS/MS 356 Acid Yellow M R = S 3 H H HPLC A B C 12.9 MS/MS 191 Produkt C H 3 S Cl

38 o. 15 shrnutí výsledků barvivo C.I. Acid Yellow 9 bylo elektrochemicky degradováno v acl kvůli čistění odpadních vod, HPLC/ESI-MS záporný mód, v základním skenu převládal ion, ze kterého bylo následně automaticky měřeno MS/MS spektrum H 3 S 4H +,4e - H 2 H 3 S H 2 H 2 H 2 S 3 H Cl -, ClH. H 2 S 3 H Cl -, ClH. H 3 S Cl Cl -, ClH. H 3 S H Cl -, ClH. H 3 S Cl H 2 4H +,4e - Cl H 3 S H 2 H 2 H 3 S Cl H Cl -, ClH. S 3 H Cl -, ClH. Cl -, ClH. H 3 S Cl H 2 4H +,4e - Cl H 3 S H 2 H 2 H 3 S Cl H Cl S 3 H Cl Cl Reference: Rapid Commun. Mass Spectrom. 20 (2006) 2807

39 Typické zkouškové otázky základní termíny vč. typů iontů a hmotností iontů, význam izotopů v hmotnostní spektrometrii, vysvětlit na příkladech, dusíkové pravidlo (EI versus měkké) vysvětlit základní principy ionizačních technik: EI, CI, ESI, APCI, APPI, MALDI určení M R proteinů pomocí ESI, fragmentace proteinů jaký je rozdíl mezi EI spektry a spektry měřenými měkkými ionizačními technikami, vysvětlit na modelovém příkladu vysvětlit základní fyzikální principy hmotnostních analyzátorů: magnetický analyzátor s dvojí fokusací iontů, Q, iontová past (sférická vs. lineární), TF (včetně použití reflektronu, zpožděné extrakce iontů a QqTF uspořádání), rbitrap, ICR-MS co je to tandemová hmotnostní spektrometrie a MS n, k čemu se používá, typy fragmentací co je to hmotnostně spektrometrické zobrazování (jaké ionizace), a jaké jsou jeho aplikace základní princip spektrometrie iontové pohyblivosti a jaké jsou její aplikace jak byste správně provedli kvantitativní měření pomocí HPLC/HR-MS a HPLC/MS (QqQ), význam interního standardu, validace jaké kroky jsou důležité při identifikaci neznámé látky pomocí hmotnostní spektrometrie důležité parametry (ne)ovlivňující MS spektra při LC/MS (požadavky na mobilní fázi apod.) jakými způsoby lze provést kalibraci hmotnostní stupnice a u jakých přístrojů je zvláště důležitá vysvětlit princip a praktické využití GC/MS a HPLC/MS pro jaký typ látek je možné techniky využít, jak budete volit ionizační techniku podle typu analytu (na čem bude volba záviset) základní pravidla interpretace EI hmotnostních spekter, základní typy fragmentací pravidla interpretace EI spekter a spekter měřených měkkými ionizačními technikami