Metody separace buněk Funkční testy lymfocytů. RNDr. Jan Lašťovička, CSc. RNDr. Daniela Rožková, PhD. Ústav imunologie 2.

Transkript

1 Metody separace buněk Funkční testy lymfocytů RNDr. Jan Lašťovička, CSc. RNDr. Daniela Rožková, PhD. Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol

2 Metody izolace buněk Historické shrnutí - První pokusy kolem r Používání fyzikálních charakteristik (hustota) nebo biochemických odlišností (přítomnost specifických enzymů) (např. L-leucin-metylester je toxický pro monocyty s obsahem lysozymů a NK buňky) Boyum publikoval metodu separace na hustotním gradientu (FICOLL) - Podobné metody používaly arabinogalaktan (stractan) 13-17% léta objevují se metody založené na reakci Ag-Ab (panning, komplementová lýza) - Rozetové metody - Adherence makrofágů k plastům, B buňky + nylonová vlna

3 Separace buněk Výchozí materiál: Solidní orgán: Tkáň se rozřeže na malé částečky, které se ponoří do kultivačního média. Buňky se rostou v kultivační nádobě. Tkáň se rozvolní na jednotlivé buňky mechanicky homogenizátorem, enzymatickým natrávením (trypsinem, kolagenázou, pronázou, dispázou, elastázou apod.). Krev, kostní dřeň již rovnou buněčná suspenze Směsné populace buněk pro funkční testy potřeba izolovat určitý typ buněk od ostatních populací buněk Nádorová tkáň: oddělení nádorových buněk od nenádorových Kostní dřeň: CD34 + kmenové buňky od ostatních buněk Krev: izolace různých typů leukocytů

4 Principy separace Podle čeho se separuje Fyzikální vlastnosti Velikost buněk Hustota (densita) Rychlost sedimentace při centrifugaci Biologické vlasnosti: Přirozené schopnosti buněk (adherence buněk na plastik) Povrchová exprese molekul - markerů Kritéria pro výběr metody Čistota a výtěžek separace Doba zpracování Finanční náročnost

5 Typy leukocytů agranulocyty granulocyty

6 Diferenciální centrifugace Částice sedimentují na základě svých sedimentačních koeficientů Sedimentační koeficient závisí na hmotnosti, densitě částice a její interakci s kapalinou Buňky sedají na dno zkumavky peletka Vrchní část supernant nedochází k dosažení hustotní rovnováhy Částice (typ buňky) je charakterizována sedimentačním koeficientem zvolení vhodné centrifugační rychlosti

7 Centrifugace Parametry: rychlost rotace (počet otáček za minutu) RPM poloměr centrifugace (vzdálenost od středu rotoru, r). Výkyvný rotor Výpočet relativní centrifugační síly (RCF): RCF = 0, r.(q) 2 Q = rychlost otáčení (RPM) r = poloměr otáčení (cm) rychlost rotace

8 Základní separace krevních složek Transfuzní stanice Centrifugační rychlost g ( rpm) Základní složky Červené krvinky Sérum bohaté na destičky Buffy coat bílé krvinky+ destičky Destičky jsou separovány z vrchní frakce (výtěžek asi 50%) z buffy coatu

9 Sedimentační vlastnosti buněk Erytrocyty Trombocyty Lymfocyty Granulocyty počet / ul 5,000, ,000 2,500 4,500 poloměr (um) Objemový podíl (%) Hustota (g/ml) Sedimentační koeficient

10 Gradientová centrifugace Zonální centrifugace v hustotním médiu zóny odpovídají určité hustotě Centrifugace do rovnováhy buňky se zastaví v zóně, která odpovídá jejich hustotě v různé vzdálenosti ode dna zkumavky různá hustota média gradient hustoty Gradient se mění: Plynule (spojité gradienty) Skokově (nespojité gradienty)

11 Spojitý gradient : centrifugace na Percollu částečky oxidu křemičitého potažené polyvinylpyrrolidonem Při vysokých otáčkách se vytvoří gradient Na gradient se navrství vzorek Druhá centrifugace o nižších otáčkách Sběr prstenců Např. separace monocytů

12 Nespojitý (diskontinuální) gradient Navrství se na sebe roztoky o různých hustotách Poslední vrstvu tvoří buněčná suspenze Buňky zůstanou mezi roztokem s vyšší a nižší hustotou, než je jejich hustota. Sacharidová média Sacharidy Složité polysacharidy (Ficoll)

13 Ficoll-Paque Vodný roztok o hustotě 1.077g/ml, obsahuje 5.7g FICOLL400 a 9g ditrazoátu sodného FICOLL400 - syntetický vysokomolekulární polymer sukrózy a epichlorohydrinu, molekul. váha

14 Gradientová centrifugace - separace mononukleárních buněk Mononukleární buňky (PBMC): bílé krvinky vyjma granulocytů Monocyty (20%), lymfocyty (70%) Buňky se navrstvují na denzitní médium Ficoll

15 Promývání buněk Ve fosfátovém pufru PBS (phosphate buffered saline) izotonický = stejná osmolarita jako přirozené prostředí buněk (krev) Udržuje přirozené Ph = 7,2 7,4 Obvykle bez iontů Ca 2+, Mg 2+ Centrifugace obvykle 300 g (1300 rpm) Rozpustit v 800 ml of destilované H2O: 8 g of NaCl 0.2 g of KCl 1.44 g of Na2HPO4 12H2O 0.24 g of KH2PO4 ph nastavit na 7.4 pomocí HCl Doplnit destilovanou H2O do 1 litru.

16 Aferéza Na centrifugačním přístroji separátoru jsou odděleny složky krve. Požadovaná složka je odebrána. Ostatní složky se vrací zpět do oběhu pacienta. Používáno pro separaci, ale též jako léčebná metoda. Terapie: LDL aferéza odstranění low density lipoproteinu u pacientů s dědičnou hypercholesterolemií Fotoferéza (nádorová onemocnění krve, transplantace) Výměna nebo deplece červených krvinek (talasémie, malárie) Terapeutická výměna plazmy (odstranění autoprotilátek) Darování složek: Plazmaferéza Tromboferéza Leukaferéza

17 Centrifugační elutriace umožňuje pomocí speciálního zařízení rozdělit buňky podle rychlosti sedimentace, tj. nejen podle hustoty, ale i objemu. Tato metoda je však technicky mnohem složitější a vyžaduje zvláštní vybavení. Přístroj elutriátor

18 Odstraňování erytrocytů: hypotonická lýza Metoda založená na větší náchylnosti erytrocytů k hypotonickému šoku ve srovnání s lymfocyty a ostatními jadernými buňkami Způsobeno rozdílnou stabilitou membrány Osmotická lýza amonium chloridem 0,84%, různé protokoly s použitím destilované vody nebo lyzačních roztoků. Inkubace 15-30s (voda) nebo cca 10 min (speciální roztoky), pak zpět do izotonického prostředí a promýt Použití hlavně při přípravě vzorků pro průtokovou cytometrii: Značení protilátkami v plné krvi Lýza erytrocytů Promytí Měření na cytometru a analýza.

19 Separace monocytů pomocí adherence na plastové povrchy Monocyty mají přirozenou schopnost adherovat na povrch kultivačního plastiku Buňky se nechávají adherovat několik hodin Lymfocyty a ostatní mononukleární buňky zůstávají plovoucí v médiu Čistota separace : kolem 70 80% Účinnost separace: méně než 50% Výhody: finančně nenáročné Nevýhody: prodloužená doba separace Variabilita mezi dárci

20 Membránové znaky imunocytů Molekuly antigenů a epitopy na povrchu imunocytů jsou popsány a tříděny od r CD (Cluster of Differentiation) V současnosti definováno 339 znaků

21

22 Separace populací leukocytů na základě povrchových znaků Pozitivní separace: marker použitý k separaci je přítomen na izolovaných buňkách CD14+ monocyty CD4+ lymfocyty Negativní separace/ Deplece: odstranění určitého typu buněk Kombinace obou přístupů: izolace složitěji definované populace Čistota separace: většinou nad 90% Čistota vs. výtěžek

23 Separace populací leukocytů na základě povrchových znaků typy separací Tvorba shluků s červeným krvinkami rozety: Klasická izolace T lymfocytů Rozety vytvořené pomocí protilátek komerční kity Imunomagnetická separace komerční kity Sortování buněk pomocí průtokové cytometrie

24 Separace pomocí tvorby rozet Založeno na přítomnosti specifických receptorů na T a B lymfocytech Lidské T lymfocyty exprimují molekulu CD2 receptor pro SRBC (tzv. E-rozety) B lymfocyty exprimují molekulu LFA-3 a vážou myší erytrocyty (tzv. M-rozety) Rozety jsou vidět pod mikroskopem jako lymfocyt obklopený erytrocyty SRBC můžeme pak odstranit hypotonickou lýzou Pomocí gradientové centrifugace můžeme buňky s navázanými erytrocyty separovat

25 Rozety vytvořené vazbou protilátek Používáno pro negativní separaci, zahušťování populace Na červených krvinkách vazba protilátky na glykoforin A Princip separace Separace CD4 lymfocytů

26 Separační techniky s použitím monoklonálních protilátek Panning protilátka je navázána na plastový povrch (nevýhodou je velká spotřeba protilátek) Imunoafinitní separace Selekce pomocí magnetického pole (MACS) Selekce průtokovou cytometrií (FACS)

27 Imunoafinitní separace Protilátka je navázána na nosič Vlastnosti nosiče (magnetismus nebo hustota) umožní separaci protilátkou označených buněk Často využíván princip sloupcové chromatografie Protilátky jsou připojené ke kuličkám Cell Marker buněčné populace nosič Výhody: vysoká čistota a výtěžek Nevýhody: časová a finanční náročnost Protilátka specifická pro buněčný marker

28 Magnetická separační kolona Po inkubaci s magnetickými partikulemi buňky procházejí kolonou umístěnou v silném magnetickém poli Magneticky označené buňky jsou zadrženy v koloně a odděleny od neznačených buněk Po vyjmutí kolony z magnetického pole jsou zadržené buňky vymyty Obě populace jsou použitelné k dalším experimentům

29 Imunomagnetická separace Naznačení buněk protilátkami s navázanými magnetickými partikulemi Kolonka v magnetickém poli. Buňky s navázanou protilátkou zůstávají v kolonce. Promytí. Kolonka se odstraní z magnetického pole. Buňky s navázanou protilátkou se vymyjí z kolonky Pozitivní separace vyšší čistota separace na vyizolovaných buňkách jsou navázány protilátky, které mohou ovlivnit vlastnosti buněk ve funkčních testech

30 Imunomagnetická separace Naznačení nechtěných populací buněk protilátkami s navázanými na magnetické partikule Kolonka v magnetickém poli. Buňky s navázanou protilátkou zůstávají v kolonce. Neoznačené buňky (požadovaná populace) se vymyjí do nové zkumavky. negativní separace - vyizolované buňky jsou untouched

31 Separační kolona MiniMACS

32 MACS automated Magnetic Cell Sorting Magnetické mikropartikule konjugované s monoklonálními protilátkami, komerční soupravy k izolaci libovolné buněčné subpopulace Buňky lze izolovat za 40 min přímo z plné krve, čistota 95-98% Rychlost metody až 10 mil buněk za vteřinu Kompatibilita s průtokovou cytometrií fluorescenční i magnetické značení lze provádět zároveň

33 MACS Automated Magnetic Cell Sorting

34 FACS Fluorescence Activated Cell Sorting Průtoková cytometrie je standardní metoda pro analýzu buněk v suspenzi Buňky jsou označené monoklonální protilátkou s navázaným fluorochromem Když buňka prochází detektorem, je pomocí elektrického výboje vychýlena ze své dráhy a nasměrována do sběrné zkumavky Vysoká čistota separace až 99% Zisk cca buněk za vteřinu

35 Sortování buněk průtokovou cytometrií Průtoková cytometrie Umožňuje velmi přesně definovat populaci pomocí vhodné kombinace protilátek Vysoká čistota Nevýhody: časově náročné Ovlivnění životnosti buněk Obtížné zajištění sterility Nízké výtěžky

36

37 HODNOCENÍ SPECIFICKÉ BUNĚČNÉ IMUNITY Je nutné pro efektivní diagnostiku: primárních imunodeficiencí sekundárních imunodeficiencí (infekce, malnutrice, trauma, nádory, účinky terapie) autoimunitních imunopatologických nemocí ZÁKLADNÍ KLINICKÉ PROJEVY PORUCH SPECIFICKÉ BUNĚČNÉ IMUNITY opakované infekce plic, GIT, kůže virové infekty intracelulární bakterie (M.tuberculosis) oportunistické infekce (r. Candida, Pneumocystis carinii)

38 DIAGNOSTICKÉ LABORATORNÍ POSTUPY JSOU KOMPLEXNÍ jsou navrhovány na základě podrobného klinického vyšetření jsou hodnoceny v kontextu klinického stavu ZÁKLADNÍ TESTY: - počet leukocytů, dif. KO, abs. počty VÝBĚROVÉ TESTY: - vlastní imunologické vyšetřovací metody

39 I) KOŽNÍ TESTOVÁNÍ: intradermální aplikace anamnestických na thymu závislých antigenů mikrobiálního původu ANAMNESTICKÉ AG: předpokládá se předchozí kontakt přirozená expozice: candidin, toxoplasmin umělá expozice = aktivní imunizace (tetanový toxoid) INDURACE po 48 hodinách (reakce pozdní přecitlivělosti) histologicky infiltrace CD4 + T lymfo a makrofágy INTERPRETACE: pozitivita = neporušená T buněčná imunita negativita = anergie

40 II) EX VIVO LABORATORNÍ TESTY kvantifikace počtu buněk imunitního systému (krev, jiné tekutiny a tkáně) funkční testy KVANTIFIKACE BUNĚK IMUNITNÍHO SYSTÉMU NĚKDY VYŽADUJE SEPARACI BUNĚK

41 Druhy lymfocytů a jejich funkce CD8+ B lymfocyty: produkce protilatek (neutralizace mikrobů, aktivace komplementu), fagocytóza CD4+ Th lymfocyty: aktivace makrofágů, pomoc CD8+ a B lymfocytům CD8+ Th lymfocyty: zabíjení infikovaných buněk, NK buňky (natural killer): zabíjení infikovaných buněk, nádorových b.

42 Funkční testy lymfocytů Stimulace směsné populace (PBMC) nebo izolovaných populací Sledování: Proliferace ( T lymfocyty) produkce protilátek (B lymfocyty) produkce cytokinů (T lymfocyty) cytotoxicity (CD8+ buňky, NK buňky) in vitro kultivace kultivační media (růstové faktory, cytokiny) CO2 atmosféra

43 Stimulační agens ve funkčních testech Aktivace specifickým antigenem: proteinový (tetanus PPD) Polysacharidový (pneumokok) Aktivace nespecifickým mitogenem polyklonální aktivátory Často lektiny - specifická vazba na membránové cukry Název charakter Aktivace T buněk Aktivace B buněk phytohaemagglutinin (PHA) rostl. lektin ano ne concanavalin A (cona) rostl. lektin ano ne lipopolysacharid (LPS) složka stěny G- bakterií ne ano pokeweed mitogen (PWM) rostl. lektin ano ano Protilátka proti CD3 Myší protilátka ano ne PMA + ionomycin Nízkomol. aktivátory sign. drah ano ano

44

45 PŘIROZENĚ CYTOTOXICKÉ BUŇKY IN VITRO DIAGNOSTIKA heterogenní populace usmrcují buňky infikované viry, infekční agens a nádorově transformované buňky nejdůležitější populace jsou NK buňky NK BUŇKY: CD56 + (NCAM-1) Aktivita NK buněk: je testována lytická aktivita NK buněk terčová linie je označena radioaktivním Cr suspenze označených terčových buněk je smíchána s izolovanými PBMC (obsahují NK buňky) během inkubace jsou terčové buňky lyzovány a do supernatantu se uvolňuje radioaktivní Cr uvolněná radioaktivita je funkcí NK cytotoxicity

46