Ondřej Duben. Stanovení selenu metodou HG-AAS s prekoncentrací a atomizací v plazmovém výboji s dielektrickou bariérou

Transkript

1 U N I V E R Z I T A K A R L O V A V P R A Z E P ř í r o d o v ě d e c k á f a k u l t a Studijní program: Klinická a toxikologická analýza Ondřej Duben Stanovení selenu metodou HG-AAS s prekoncentrací a atomizací v plazmovém výboji s dielektrickou bariérou Selenium determination by HG-AAS with preconcentration and atomization in dielectric barrier plasma discharge D i p l o m o v á p r á c e Vedoucí diplomové práce: RNDr. Jan Kratzer, Ph. D. Praha 2015

2 Tato diplomová práce vznikla na Ústavu analytické chemie AV ČR, v. v. i., na jeho detašovaném pracovišti Oddělení stopové prvkové analýzy v Praze. Tato práce byla finančně podporována výzkumným záměrem Ústavu analytické chemie AV ČR, v. v. i. (projekt RVO: ), programem interní podpory projektů mezinárodní spolupráce AVČR (projekt M ) a Grantovou agenturou České republiky (projekt č. P206/ S). Konzultanty této práce byli prof. RNDr. Jiří Dědina, DSc. a RNDr. Václav Červený, Ph. D. Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto závěrečnou práci zpracoval samostatně a že jsem uvedl všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Jsem si vědom toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity. V Praze dne 21. srpna

3 Poděkovaní: Na tomto místě bych rád poděkoval svému školiteli RNDr. Janu Kratzerovi, Ph. D. za odborné vedení, pomoc, cenné rady a připomínky, které mi po celou dobu řešení mé práce poskytoval. Poděkování patří také RNDr. Václavu Červenému, Ph. D. a prof. RNDr. Jiřímu Dědinovi, DSc. za jejich věnovaný čas při konzultacích. 3

4 Abstrakt Náplní této diplomové práce bylo optimalizovat podmínky atomizace hydridu selenu v novém plazmovém atomizátoru s dielektrickou bariérou (DBD) s detekcí pomocí atomové absorpční spektrometrie. Pro tento atomizátor byly následně určeny základní analytické charakteristiky, které byly porovnány s běžně používaným externě vyhřívaným křemenným atomizátorem, který byl v této práci nahrazen multiatomizátorem (MMQTA). Detekční limit dosažený v DBD atomizátoru (0,24 ng ml 1 Se) je jen mírně horší než v MMQTA (0,15 ng ml 1 Se). Odolnost DBD atomizátoru vůči interferencím je naopak lepší než v případě MMQTA. Rovněž byla studována prekoncentrace hydridu selenu v plazmovém atomizátoru s dielektrickou bariérou a bylo dosaženo prekoncentrační účinnosti 75 ± 5%. Mez detekce při použití doby prekoncentrace 300 s činila 0,012 ng.m1 1 Se. Klíčová slova: atomová absorpční spektrometrie s generováním hydridů, dielektrický bariérový výboj, atomizace hydridu, prekoncentrace, selen 4

5 Abstract The aim of this thesis was to optimize atomization conditions for selenium hydride in a novel plasma atomizer based on dielectric barrier discharge (DBD) using atomic absorption spectrometry as a detector. Analytical characteristics have been subsequently determined and compared to those reached in a conventional externally heated quartz tube atomizer which was replaced by a sofisticated design of a multiatomizer (MMQTA) in this work. The limit of detection reached in DBD (0,24 ng ml 1 Se) is slightly worse to that observed in MMQTA (0,15 ng ml 1 Se). On the contrary, slightly better resistance towards interferences of Sb, Bi and As was observed in DBD atomizer in comparison with MMQTA. Possibility of selenium preconcentration in a DBD atomizer was studied reaching an overall preconcentration efficiency of 75 ± 5%. The detection limit in a preconcentration mode employing preconcentration period of 300 s has reached 0,012 ng ml 1 Se. Key words: hydride generation atomic absorption spectrometry, dielectric barrier discharge, hydride atomization, hydride trapping, selenium 5

6 Obsah Obsah... 6 Seznam zkratek a symbolů Úvod Cíle diplomové práce Teoretická část Atomová absorpční spektrometrie Generování a atomizace těkavých sloučenin Selen Prekoncentrace hydridotvorných prvků s AAS detekcí Experimentální část Instrumentace Atomový absorpční spektrometr Hydridový generátor Atomizátory Plazmový atomizátor s dielektrickým bariérovým výbojem (DBD) Multiatomizátor (MMQTA) Externě vyhřívaný planární křemenný atomizátor (EHPA) Použité chemikálie Pracovní postup Výsledky a diskuse Optimalizace pracovních podmínek v DBD atomizátoru Vliv plazmového plynu Vliv výkonu DBD zdroje Průtoková rychlost argonu Vliv modifikace povrchu DBD atomizátoru

7 4.1.5 Vliv sušicí trubice Optimalizace pracovních podmínek v MMQTA Průtoková rychlost nosného plynu argonu Průtoková rychlost vnějšího vzduchu Průtoková rychlost vzduchu přiváděného kapilárou Průtoková rychlost kyslíku přiváděného kapilárou Optimalizace pracovních podmínek v EHPA Průtoková rychlost nosného plynu argonu Průtoková rychlost vzduchu přiváděného kapilárou Průtoková rychlost kyslíku přiváděného kapilárou Souhrn optimálních podmínek atomizace v použitých atomizátorech Srovnání analytických charakteristik Kalibrační závislost Se +IV v různých atomizátorech Interference v MMQTA a DBD atomizátoru Prekoncentrace Vliv přídavku kyslíku na signál v režimu přímého přenosu Vliv doby prekoncentrace na prekoncentrační účinnost Porovnání prekoncentrační účinnosti v různých kusech DBD atomizátorů Kalibrační závislost v prekoncentračním režimu Porovnání signálu v prekoncentračním režimu a bez prekoncentrace Závěr Použitá literatura

8 Seznam zkratek a symbolů A Absorbance AAS Atomová absorpční spektrometrie c Se +IV CRM DBD DMDCS EHPA HG-AAS Koncentrace Se +IV Certifikovaný referenční materiál Plazmový atomizátor s dielektrickou bariérou Dimethyldichlorsilan Externě vyhřívaný planární křemenný atomizátor AAS s generováním těkavých sloučenin i. d. Vnitřní průměr LOD Mez detekce LOQ Mez stanovitelnosti MMQTA Externě vyhřívaný křemenný multiatomizátor o. d. Vnější průměr PEEK Polyetheretherketon PTFE Polytetrafluorethylen v Ar Průtoková rychlost nosného plynu (Ar) v O2 Průtoková rychlost kyslíku (O 2 ) 8

9 1. Úvod Tato diplomová práce vznikla v rámci rozsáhlejšího projektu řešeného na Ústavu analytické chemie AVČR, v. v. i., který je zaměřen na studium možností využití nového plazmového atomizátoru s dielektrickou bariérou (DBD) pro stanovení ultrastopových koncentrací hydridotvorných prvků s detekcí pomocí atomové absorpční spektrometrie (AAS). Projekt si klade za cíl nalézt optimální podmínky pro atomizaci vybraných hydridotvorných prvků v DBD atomizátoru a určit základní analytické charakteristiky DBD atomizátoru pro jednotlivé prvky včetně charakterizace interferencí. Dalším cílem je srovnání DBD atomizátoru s externě vyhřívaným křemenným atomizátorem jako nejběžnějším atomizátorem hydridů. Posledním cílem projektu je pochopení mechanismu dějů probíhajících v DBD atomizátoru při atomizaci hydridotvorných prvků. V této práci byl použit selen jako modelový analyt z důvodu významnosti tohoto prvku z toxikologického a biochemického hlediska. Selen je esenciálním prvkem, avšak ve vyšších koncentracích působí toxicky. Hranice mezi esencialitou a toxicitou je poměrně blízká, proto je stanovení selenu i na ultrastopových koncentračních úrovních žádoucí. Ačkoli byla atomizace selenovodíku v DBD atomizátoru s AAS detekcí již studována, publikované práce se omezily pouze na optimalizaci několika málo experimentálních parametrů a určení meze detekce. Nebylo dosud provedeno ani srovnání DBD atomizátoru s konvenčním externě vyhřívaným křemenným atomizátorem, ani studovány interferenční vlivy. Odolnost vůči interferencím je přitom jedním z důležitých kritérií při hodnocení použitelnosti analytické metody pro rutinní aplikace. 9

10 1.1 Cíle diplomové práce Předmětem této diplomové práce bylo nalézt optimální podmínky atomizace hydridu selenu v DBD atomizátoru a určit základní analytické charakteristiky tohoto atomizátoru (mez detekce, odolnost vůči interferencím). Analytické charakteristiky DBD atomizátoru byly porovnány s těmi dosaženými v nejběžnějším komerčně dostupném typu atomizátoru hydridů, externě vyhřívaném křemenném atomizátoru, reprezentovaném multiatomizátorem (MMQTA). Ačkoli oba atomizátory slouží ke stejnému účelu, tj. převedení hydridu analytu na volné atomy jejich pracovní podmínky jsou značně odlišné. MMQTA je vyhříván na teplotu kolem 900 C, zatímco teplota DBD atomizátoru se pohybuje jen kolem 50 C. Proto byly studovány i mechanismy atomizace selenovodíku v těchto atomizátorech. Pro jejich lepší pochopení byly některé experimenty provedeny v externě vyhřívaném planárním atomizátoru (EHPA), který má stejnou geometrii (tvar a délka optické osy, délka přívodního ramene) jako DBD atomizátor, avšak k atomizaci v něm nedochází vlivem plazmatu, ale působením vysoké teploty. Poslední část práce pak byla věnována studiu prekoncentrace selenovodíku v DBD atomizátoru před jeho následnou atomizací, neboť takto lze zvýšit citlivost dané metody a tímto dosáhnout nižších detekčních limitů. 10

11 2. Teoretická část 2.1 Atomová absorpční spektrometrie Atomová absorpční spektrometrie (AAS) patří mezi spektrometrické analytické metody, jejichž základem je interakce elektromagnetického záření se vzorkem. Jedná se o destruktivní metodu prvkové analýzy, kdy dochází k rozkladu sloučenin analytu až na volné atomy. Principem AAS je absorpce monochromatického záření ze spektrální lampy volnými atomy analytu v plynném stavu, kdy absorpcí záření dojde k jejich přechodu do vyššího energetického stavu (excitace atomů). Atomy různých prvků jsou schopné absorbovat elektromagnetické záření takových vlnových délek, které jsou pro ně specifické, přičemž platí pravidlo, že volné atomy v plynném stavu jsou schopny absorbovat záření o takové energii, které samy vyzařují při emisi 1. Měřenou veličinou je tzv. absorbance, jejíž vztah ke koncentraci analytu popisuje Lambert-Beerův zákon. Z tohoto zákona vyplývá, že absorbance je přímo úměrná koncentraci analytu, ovšem reálně platí tato závislost jen v určitém rozsahu koncentrací. Pro zředěné roztoky platí vztah (1): (1) kde A je absorbance, Φ intenzita záření prošlého atomizačním prostředím, Φ 0 intenzita vstupujícího záření, c koncentrace analytu, l délka atomizačního prostředí a κ atomový absorpční koeficient 2. Podle způsobu zavádění vzorku do atomizátoru se techniky AAS dělí na plamenovou AAS, AAS s elektrotermickou atomizací a techniku generování těkavých sloučenin. V technice AAS s atomizací v plameni je kapalný vzorek zmlžován do plamene, nejčastěji acetylen vzduch, kde dochází k převedení analytu na volné atomy. V technice elektrotermické atomizace je kapalný vzorek dávkován do odporově vyhřívané grafitové kyvety, kde opět dochází k jeho atomizaci. Technika generování těkavých sloučenin využívá převedení analytu z kapalné fáze do plynné a zavádění těkavé sloučeniny analytu do atomizátoru, kde je analyt převeden na volné 11

12 atomy. Nejběžnějším příkladem této techniky je generování těkavých hydridů s atomizací v externě vyhřívaném křemenném atomizátoru (kapitola 2.2) 3. Technika plamenové AAS je nejstarší, nejjednodušší a nejméně nákladná, avšak je s ní dosahováno také nejhorších detekčních limitů, neboť při ní dochází k naředění volných atomů analytu v plameni. S použitím AAS s elektrotermickou atomizací lze dosáhnout řádově lepších detekčních limitů než v plamenové AAS. Nevýhodami jsou vyšší pořizovací i provozní náklady instrumentace, delší doba analýzy, vyšší nároky na operátora a také interference. Techniku generování těkavých sloučenin lze použít jen pro takové prvky, které tvoří analyticky využitelné těkavé sloučeniny. V analytické praxi se tato technika používá pro cca 10 prvků periodické tabulky. Výhodou tohoto přístupu je dosažení nejnižších detekčních limitů ze všech technik AAS. 12

13 2.2 Generování a atomizace těkavých sloučenin Přestože lze techniku generování těkavých sloučenin využít pouze pro tzv. hydridotvorné prvky (As, Se, Te, Ge, Bi, Sn, Sb, Pb), studené páry rtuti 4 a asi desítku přechodných kovů 5, dostalo se jí během posledních let poměrně velké pozornosti. Výhodou tohoto přístupu je oddělení plynné fáze obsahující těkavou sloučeninu analytu od kapalné matrice, čímž je potlačen vliv možných interferencí. K atomizaci těkavé sloučeniny je zapotřebí méně energie než v technikách, ve kterých je do atomizátoru dávkován vzorek v kapalné formě. Teplota atomizátoru tak může být v případě těkavých sloučenin podstatně nižší. Dále lze vygenerované těkavé látky také v atomizátoru prekoncentrovat. Podle způsobu přeměny stanovované látky na těkavou sloučeninu, lze rozlišovat generování elektrochemické, fotochemické a chemické 6. Ve všech případech dochází k redukci analytu. V případě elektrochemického generování vzniká hydrid analytu v generační elektrochemické cele v prostředí velmi čistých minerálních kyselin redukcí elektrickým proudem 7. Při fotochemickém generování vzniká těkavá sloučenina analytu po ozáření ultrafialovým zářením v prostředí slabé organické kyseliny 8. Zdaleka nejběžnějším analytickým přístupem je chemické generování těkavých sloučenin, které je založeno na chemické reakci mezi kyselinou chlorovodíkovou a tetrahydroboritanem sodným (NaBH 4 ), při které vzniká vodík ve stavu zrodu, který redukuje analyt na těkavou sloučeninu, která je takto oddělena od kapalné matrice. Princip chemického generování vystihují chemické rovnice (2, 3) 3,9. BH 4 + H H 2 O B(OH) H (2) A +m + (m+n) H AH n + mh + (3) kde A je analyt, m a n jsou stechiometrické koeficienty V případě selenu jako analytu je Se +IV redukován na hydrid selenu, který po oddělení lze atomizovat a detekovat pomocí AAS. Princip reakce popisuje následující chemická rovnice (4). Se +IV + 6 H SeH 2 + 4H + (4) 13

14 Podle nejnovějších poznatků je redukce analytu pomocí NaBH 4 složitější než uvádí reakce 2) a 3), probíhá několikastupňovým mechanismem přes vícero reakčních meziproduktů, kterými jsou boranové komplexy analytu 10,11. V AAS se k atomizaci těkavých sloučenin využívají vyhřívané křemenné atomizátory, které jsou nejrozšířenější. Dále lze použít i atomizátory grafitové či atomizátory plamenové 12. U klasických křemenných atomizátorů dochází k atomizaci hydridu v oblaku vodíkových radikálů, který vzniká reakcí kyslíku s vodíkem ve vyhřátém prostoru atomizátoru. Vodík je zde přítomen jako produkt rozkladu NaBH 4, zdrojem kyslíku jsou pak jeho stopy ve vzorku či použitých činidlech, dále se také dostává do aparatury difúzí ze vzduchu skrz spoje v aparatuře a otevřenými konci atomizátoru. Mechanismus vzniku vodíkových radikálů reakcí vodíku a kyslíku za vysoké teploty popisují reakce (5-7), atomizaci selenovodíku jako modelového hydridu analytu vodíkovými radikály pak znázorňují rovnice (8-9) 3,14. H + O 2 OH + O (5) O + H 2 OH + H (6) OH + H 2 H 2 O + H (7) SeH 2 + H SeH + H 2 (8) SeH + H Se + H 2 (9) Vzhledem k výše uvedeným reakcím vedoucím ke vzniku vodíkových radikálů se mechanismus atomizace hydridů v křemenných atomizátorech označuje jako radikálový. Křemenné atomizátory jsou vyhřívané na atomizační teplotu (obvykle kolem 900 C) plamenem nebo odporově. Konvenční křemenné atomizátory mají tvar písmene T a skládají se z užšího přívodního ramene, kterým je přiváděn hydrid analytu spolu s nosným plynem a širšího optického ramene, které je vyhříváno na atomizační teplotu a je umístěno v ose atomového absorpčního spektrometru. Novým typem vyhřívaného křemenného atomizátoru je tzv. multiatomizátor (MMQTA) 15,16. Jeho konstrukce vychází z konvenčního křemenného atomizátoru (QTA) s tím rozdílem, že jeho vyhřívané optické rameno je dvouplášťové, tvořené dvěma koncentrickými trubicemi, přičemž vnitřní z nich je děrovaná. Do prostoru mezi tyto dvě trubice je přiváděno kontrolované množství kyslíku nebo vzduchu. Přiváděný kyslík či kyslík obsažený ve vzduchu prostupuje z mezikruží optického ramene MMQTA do jeho 14

15 vnitřní trubice skrz její otvory. V místě každého otvoru dochází při kontaktu vodíku a kyslíku ke vzniku vodíkových radikálů dle rovnic (5-7). V MMQTA se díky jeho konstrukci dosahuje homogennějšího vyplnění optického ramene vodíkovými radikály, což má za následek lepší linearitu kalibračních závislostí a vyšší odolnost vůči interferenčním vlivům v porovnání s konvenčním křemenným atomizátorem, kde oblak vodíkových radikálů vzniká pouze v jednom místě a to ve spoji přívodního a optického ramene. Vzhledem k tomu, že množství energie potřebné k atomizaci těkavých sloučenin je poměrně malé, lze jako atomizátory těkavých sloučenin využít i plazmata nízkého výkonu pracující za atmosférického tlaku. V posledních letech se objevila řada prací, jež využívají plazmového výboje s dielektrickou bariérou, označované jako DBD (dielectric barrier discharge), jako atomizátoru v technice HG-AAS 17,18,19. Toto plazma vzniká mezi dvěma planparalelními (případně cylindricky uspořádanými) kovovými elektrodami vzdálenými od sebe typicky několik mm, z nichž alespoň jedna je krytá dielektrickou vrstvou a mezi které je vloženo vysoké střídavé napětí 20. Výhodami těchto plazmových atomizátorů jsou jednoduchost, snadná miniaturizovatelnost, nízký výkon plazmového zdroje (jednotky až desítky W) a nízké provozní náklady. V nedávné době byla popsána vylepšená konstrukce plazmového DBD atomizátoru i jeho budícího zdroje 21. Ačkoli byla popsána možnost atomizace hydridotvorných prvků v DBD atomizátoru s následnou detekcí pomocí AAS, množství publikovaných informací není dostatečné k tomu, aby bylo možné plně zhodnotit výhody a nevýhody DBD atomizátoru v porovnání s konvenčním externě vyhřívaným křemenným atomizátorem či multiatomizátorem. Cílem této diplomové práce bylo provést takové srovnání s použitím Se jako analytu. 15

16 2.3 Selen Elementární selen byl objeven švédským chemikem J. J. Berzeliem v roce Po dlouhou dobu byl pokládán pouze za prvek jedovatý, kancerogenní, mutagenní a teratogenní 22, jeho prospěšná aktivita pro živočišný organismus byla zjištěna až v polovině 20. století, kdy byl pozorován pozitivní vliv přídavku selenu na zabránění rozvoji jaterní nekrózy u myší 23. Další studie ukázaly, že deficit selenu je základní příčinou několika doposud nevyléčitelných chorob hospodářských zvířat. Závislost na nedostatku selenu byla v 60. letech nalezena také u dvou endemicky rozšířených smrtelných onemocnění Keshanské nemoci (kardiopatie) a onemocnění Kashina a Beckové (osteoartropatie) 24. Obě onemocnění jsou rozšířena zejména v oblastech Číny chudých na selen. Použitím selenu jako doplňku stravy se podstatně omezil jejich výskyt, taktéž byla snížena i mortalita. V 80. letech 20. století byl selen objeven i v některých proteinech, což vedlo k dalšímu zájmu o studium jeho esenciality v živých organismech. Tento prvek ležící v VI. A skupině periodické soustavy prvků se svými chemickými vlastnostmi nejvíce podobá síře a teluru. Vyznačuje se afinitou k těžkým kovům, zejména kadmiu, zlatu a rtuti 24. Podobně jako síra se ve svých sloučeninách vyskytuje s oxidačními čísly II, IV a VI. Elementární selen se vyskytuje v několika známých alotropických modifikacích. Stálá modifikace je označována jako kovový selen (šedý kov). Mezi nekovové modifikace patří metastabilní amorfní, červená monoklinická (jednoklonná) a černá sklovitá forma selenu. V nekovových modifikacích jsou atomy selenu uspořádány podobně jako atomy síry v osmiatomových molekulách 22. Mezi významné anorganické sloučeniny selenu patří seleničitan sodný (Na 2 SeO 3 ) a selenan sodný (Na 2 SeO 4 ). Jediná sloučenina selenu s vodíkem je hydrid selenu (označován také jako selan či selenovodík). Tento bezbarvý plyn se vyznačuje vysokou toxicitou. Organické sloučeniny selenu mají klíčové postavení v biologických procesech. Selen má ve většině organických sloučenin oxidační číslo II a může nahrazovat aminokyseliny obsahující síru ve formě selenocysteinu a selenomethioninu. Selenocystein je jediná sloučenina selenu, která je součástí účinných selenoenzymů 27. Mezi další organické sloučeniny selenu patří selenoly, selenoethery a trialkylselenové ionty. Methylací selenovodíku vznikají methylselenidy, dimethylselenidy, 16

17 dimethyldiselenidy a trimethylseleniový ion (CH 3 ) 3 Se +. Tyto sloučeniny vznikají v rostlinných i živočišných organismech a jsou téměř netoxické, neboť se velmi snadno vylučují z organismů 24. Přírodní koloběh selenu v životním prostředí začíná v půdě. Sloučeniny selenu jsou obvykle ve stopovém množství obsaženy v půdě jako součást železito-sirných rud. Jeho množství v půdě se však liší v různých oblastech světa, v některých místech mohou být jeho hladiny velmi nízké (Skandinávie, Kanada, oblast Keshan v Číně), jinde dosahují jeho koncentrace hodnoty až 1200 mg.kg 1 (Čína). Nejvíce zastoupen je v sirných rudách (chalkopyritu, pyritu a bornitu) 25. Rostliny jej přijímají z půdy v anorganických formách, které pak přeměňují na organické formy. Živočišné organismy včetně člověka jej přijímají potravou. Relativně velké množství selenu, obsahují mořské řasy, mořské ryby, ořechy, vnitřnosti, celozrnné pečivo a mléko 22,24. Značnou část selenu rostliny i živočichové metabolizují na methylované selenidy, které jsou uvolňovány do ovzduší. Přírodní koloběh selenu je dokončen, když se selen z ovzduší vrací zpět do půdy dešťovými srážkami. Obsah selenu v přírodních vodách a ovzduší je ve srovnání s jeho obsahem v půdách zanedbatelný z důvodu neustálé distribuce v životním prostředí. Tato rovnováha je však narušována lidskou činností, především spalováním uhlí a dalších fosilních paliv 24. Při orálním podání u člověka se anorganické formy selenu (Na 2 SeO 4, Na 2 SeO 3 ) respektive organické formy selenomethionin a selenocystein vstřebávají z méně než 80 %, respektive 90 %. Elementární selen a selenidy jsou špatně rozpustné a vstřebávají se ještě hůře 25. Absorpce selenomethioninu a selenocysteinu probíhá cestou aktivního transportu a absorpce seleničitanu je pasivní difúzí (pouze ve směru koncentračního gradientu). V těle jsou dva důležité kompartmenty: selenomethioninový a selenocysteinový. Do selenomethioninového kompartmentu vstupuje selenomethionin přijatý potravou, který je začleněn do tělních proteinů (např. albuminu), případně je distribuován také do erytrocytů, jater, slinivky břišní, ledvin a žaludku. V selenocysteinovém kompartmentu dochází k postupné přeměně anorganických forem selenu a selenocysteinu na selan, který může být opětovně zapojen do syntézy selenoproteinů nebo je při svém nadbytku biotransformován na methylovanou formu a následně z těla vyloučen. 17

18 Organismus se přebytečného množství selenu zbavuje vylučováním močí (50-80 %), stolicí (20-30 %) a dechem asi z 10 % 25. Vylučování močí je homeostaticky regulováno a snižuje se při sníženém přísunu selenu ve stravě. Hlavní formou selenu v moči je trimethylseleniový ion (CH 3 ) 3 Se + (cit. 25 ). Při příjmu vysokých dávek selenu se nadměrné množství vylučuje plícemi jako dimethylselenid. Dech se pak vyznačuje typickým česnekovým zápachem 27. Selen prochází transplacentární bariérou do plodu a vylučuje se i do mateřského mléka, kde se jeho koncentrace pohybují v rozmezí 0,013-0,053 μg ml 1 v závislosti na příjmu v potravě 28. Hlavními ukazateli zásobení organismu selenem jsou erytrocyty, krevní plazma či sérum, moč, vlasy a nehty. Množství selenu v moči a krevním séru odráží krátkodobý stav příjmu selenu potravou, ale hladina selenu ve vlasech, nehtech a játrech se změní až po delší době. Střednědobým ukazatelem je jeho množství v trombocytech a erytrocytech. V erytrocytech je selen z největší části vázán na hemoglobin a přibližně z 10 % je zabudován v glutathionperoxidáze. V organismu nedochází ke kumulaci selenu, takže po přerušení příjmu selenu se velmi rychle začnou rozvíjet onemocnění z nedostatku selenu. Koncentraci selenu v plazmě zvyšuje příjem selenomethioninu, oproti stejným dávkám anorganického selenu. Různé zátěže, kterým je organismus vystaven, se mohou rovněž projevovat v hodnotách selenu (např.: u sportovců se mohou lišit hodnoty selenu v krvi během tělesné zátěže a po ní, v závislosti na intenzitě výkonu). V České republice je vzhledem k nízkým koncentracím selenu v půdě (0,07-0,12 mg.kg 1 ) příjem tohoto prvku velmi nízký. Uvádí se, že v podmínkách České republiky je denní příjem v průměru 36 μg selenu na osobu 25. Podle některých zdrojů je třetina až polovina naší populace ve stavu mírného až vážného deficitu selenu. Tento nedostatek selenu se řeší třemi způsoby: dovozem potravin s vyšším obsahem selenu, obohacováním půd sloučeninami selenu a obohacováním krmiv pro užitková zvířata selenovými doplňky. Vliv selenu na nejrůznější biochemické pochody v organismu je připisován zejména redoxním vlastnostem jeho organických sloučenin. Pod pojmem selenoproteiny jsou označovány proteiny, do kterých je na základě genetické informace zabudován selenocystein. Bílkoviny s jinými formami selenu (např. se selenomethioninem 18

19 včleněným do proteinu nespecificky tyto bílkoviny nevykazují biologické účinky) jsou označovány souhrnně pouze jako proteiny obsahující selen. Funkčně můžeme rozlišit dvě odlišné rodiny enzymů. První rodina zahrnuje glutathion- peroxidázu a thioredoxin reduktázu, které zasahují do kontroly tkáňových koncentrací vysoce reaktivních kyslíkových metabolitů. Tyto kyslíkové metabolity jsou v malém množství esenciální pro udržování buněčné imunity, ale ve velkém množství jsou vysoce toxické 29. Do druhé rodiny patří jódthyronin dejodáza, která je důležitá pro tvorbu hormonů štítné žlázy. Z toxikologického hlediska jsou akutní otravy selenem vzácné. Většinou k nim dochází při náhodném požití chemických látek, nebo potravin obsahujících velmi vysoké dávky tohoto prvku. Symptomy akutní intoxikace jsou nevolnost a zvracení následované edémem plic, v nejhorších případech i okamžitým srdečním selháním. Při chronických otravách selenem trpí pacienti tzv. selenotoxikózou. Hlavní symptomy tohoto onemocnění se projevují ztrátou vlasů a nehtů, odbarvením zubů, bolestí hlavy, nervozitou, únavou, zažívacími potížemi, znecitlivěním a případně až ochrnutím části těla 22,24,25. Jelikož je hranice mezi doporučenou denní dávkou selenu ve stravě (55 μg) a jeho toxickou dávkou (>300μg) velmi úzká 26, je důležité mít velmi citlivou a přesnou analytickou metodu, která dokáže stanovit i stopové množství tohoto prvku v organismu. 19

20 2.4 Prekoncentrace hydridotvorných prvků s AAS detekcí Prekoncentrační techniky umožňují další snížení detekčního limitu metody HG-AAS. Vygenerovaný hydrid může být prekoncentrován ve zvláštním prekoncentračním zařízení umístěném mezi generátor a atomizátor nebo může být prekoncentrován přímo v atomizátoru. Každou prekoncentrační proceduru lze rozdělit na dva kroky: 1) záchyt vygenerovaného hydridu a 2) uvolnění zachyceného analytu s jeho následnou detekcí. Příkladem prekoncentrace ve zvláštním zařízení je prekoncentrace tlaková, v absorpčním médiu či kryogenní 30. Tlaková prekoncentrace využívá jímání vygenerovaného hydridu (spolu s generovaným vodíkem) v hermeticky uzavřené nádobě či balonu. Po skončení generování je natlakovaný obsah rezervoáru přepuštěn do atomizátoru. Při prekoncentraci v absorpčním médiu se k absorpci hydridu používají vhodné absorpční kapaliny nebo kolony. Analyt se následně stanovuje vhodnou detekční technikou. Prekoncentrace tlaková i v absorpčním médiu nejsou v současnosti prakticky využívány. Vysoké citlivosti stanovení lze dosáhnout použitím kryogenního záchytu, kdy je hydrid zachycen v U-trubici ponořené do kapalného dusíku, zatímco vodík a nosný plyn jí projdou. Po skončení redukce se U-trubice ohřeje a hydrid je proudem plynu veden do atomizátoru. Příkladem prekoncentrace přímo v atomizátoru je tzv. in-situ trapping v grafitovém atomizátoru. Jedná se v současné době o jeden z nejpoužívanějších přístupů k prekoncentraci díky jednoduchosti provedení. K tomuto účelu se využívají komerční atomové absorpční spektrometry vybavené elektrotermickými grafitovými atomizátory. Generovaný hydrid je v prvním kroku procedury zachycen v atomizátoru, který je vyhříván na C a jehož povrch bývá modifikován sloučeninami Pd, Rh či Ir. Ve druhém kroku prekoncentrační procedury, po skončení generování hydridu ze vzorku, je atomizátor zahřátý na teplotu kolem 2500 C, čímž je veškerý zachycený analyt atomizován a detegován. V případě Se jako analytu se nejlepší publikované detekční limity pro HG-AAS s prekoncentrací v grafitovém atomizátoru pohybovaly kolem 1 pg ml 1 (cit. 31 ). Nevýhodami prekoncentrace v grafitovém atomizátoru jsou vysoké pořizovací i provozní náklady grafitového atomizátoru. 20

21 V posledních letech byly testovány také různé variace prekoncentračních zařízení vyrobených z kovu, grafitu, safíru či křemenného skla. Konstrukce a použití těchto zařízení jsou shrnuty v přehledných článcích 32,33. Záchyt hydridů As a Se byl studován na povrchu a uvnitř (v dutině) trubičky z elektrografitu, atomizace byla prováděna v difúzním plamínku. Studován byl vliv modifikace povrchu (Ir, Pt a Rh). Účinnost prekoncentrace Se byla určena pomocí radioaktivního indikátoru 75 Se. Na nemodifikovaném povrchu k záchytu téměř nedocházelo, nejlepších výsledků bylo dosaženo s Ir jako permanentním modifikátorem. Účinnost záchytu na Ir modifikovaném povrchu činila 53 % na povrchu grafitové trubičky, resp. 70 % v její dutině 34. Záchyt arsanu a selanu byl studován ve wolframovém trubicovém atomizátoru. Lepších výsledků bylo dosaženo na modifikovaném povrchu (Pt, Pd, Ir, Re) 35. Wolframová spirálka modifikovaná Rh, tentokrát umístěná přímo ve skleněném optickém rameni atomizátoru (prekoncentrace in-situ), byla použita k prekoncentraci selanu 36. Prekoncentrační účinnost byla odhadem 80 %, detekční limit byl 50 pg ml 1. Stejné uspořádání s použitím Rh modifikované W spirálky bylo použito pro stanovení Se a As v biologických vzorcích 37. Zlatý drátek byl použit pro prekoncentraci selanu s detekcí pomocí AAS a AFS 38. Prekoncentrační účinnost činila 100 %, detekční limit 5 pg ml 1. Kromě zlata byly testovány i další kovové materiály Pd, Pt, Ag a Ni-Cr drátky a Ta folie i W pásek. Všechny testované materiály vykazovaly 100% účinnost záchytu selanu, avšak kromě Au a Ta z nich nebylo možné zachycený analyt uvolnit. Zlatem krytá wolframová spirálka vložená do přívodního ramene konvenčního křemenného atomizátoru byla použita k prekoncentraci selanu 39. Možnosti prekoncentrace hydridů As a Se, včetně interferencí, byly studovány na molybdenovém pásku s modifikovaným povrchem (Pt, Ir, Rh) i bez modifikace s detekcí pomocí AAS a atomizací v miniaturním difúzním plamínku 40. Pomocí 75 Se radioaktivního indikátoru byla nalezena účinnost záchytu asi 30%. Analyt po uvolnění částečně kondenzuje na chladnějších částech křemenného těla atomizátoru. Pokud jde o křemenné sklo, jednoduchý postup prekoncentrace byl hledán již v 80. letech minulého století pro snížení detekčních limitů AAS s atomizací v plameni. Tato technika atomizace byla tehdy dominantní, ke snížení detekčního limitu mnoha prvků, nejen hydridotvorných, ale i těch zmlžovaných do plamene z kapalných vzorků, 21

22 se používaly křemenné trubice různých typů, nejčastěji trubice s podélnou štěrbinou nebo vodou chlazené trubice. Bližší popis trubic lze nalézt v přehledu 41. S využitím techniky generování hydridů (HG), po převedení příslušných prvků na jejich těkavou formu, lze na různých typech prekoncentračních trubic vložených do plamene prekoncentrovat i hydridotvorné prvky. V literatuře byla popsána prekoncentrace analyticky významných prvků As a Se s detekčními limity na úrovni jednotek ng ml 1 (cit. 42 ). Prekoncentraci hydridotvorných prvků na křemenných površích je vhodné spojovat s křemennými atomizátory. Na bázi křemenného multiatomizátoru bylo zkonstruováno prekoncentrační a atomizační zařízení pro prekoncentraci hydridotvorných prvků 43. Přívodní rameno multiatomizátoru bylo modifikováno tak, že je možné jej odporově vyhřívat na požadovanou teplotu v rozsahu cca C. Zároveň je upraven přívod nosného plynu a hydridu analytu do přívodního ramene. Je použita křemenná kapilára pro přívod kyslíku, proud nosného plynu a hydridu analytu je realizován koncentrickou teflonovou trubičkou kolem této kapiláry. Pomocným kanálem je možné ke směsi nosného plynu přidávat vodík. K záchytu analytu dochází dávkováním stechiometrického nadbytku kyslíku do kapiláry vůči množství vodíku obsaženému v nosném plynu (vodík je vedlejším produktem při chemickém generování hydridu). Za těchto podmínek dojde ve vyhřátém atomizátoru ke vzplanutí směsi vodíku a kyslíku a kyslíko-vodíkový plamínek hoří vždy, tj. nezávisle na teplotě přívodního ramene, na špičce křemenné kapiláry sloužící pro přívod kyslíku. Hydrid analytu je v plamínku rozložen (předpokládá se převedení na příslušný oxid) a zachycen na křemenném povrchu přívodního ramene. Po skončení kroku záchytu je uzavřen přívod kyslíku, zvýšena teplota přívodního ramene a dávkován vodík pomocným kanálem. Za těchto podmínek dochází k uvolnění zachyceného analytu, jeho transportu do optického ramene atomizátoru, atomizaci a detekci pomocí AAS 44. V tomto zařízení byly nalezeny experimentální podmínky, při kterých dochází k prekoncentraci hydridů Sb, Bi, Pb a Sn s účinností 100 % 45,46,47. V případě Se jako analytu se kvantitativní prekoncentrace nepodařilo dosáhnout, účinnost prekoncentrace činila pouze 70 % 43. Společnými nevýhodami těchto prekoncentračních zařízení je komplikovanost jejich konstrukce i pracovní procedury a hlavně ztráty analytů během prekoncentrační procedury, ke kterým v řadě případů dochází. Je-li prekoncentrační účinnost výrazně 22

23 nižší než 100 %, dochází ke zhoršené opakovatelnosti výsledků. Ačkoli s křemenným atomizačním a prekoncentračním zařízením na bázi multiatomizátoru lze v řadě případů dosáhnout velmi dobrých výsledků, v případě Se se nepodařilo dosáhnout 100% prekoncentrační účinnosti a proto je nutné hledat stále další alternativní přístupy k prekoncentraci Se použitelné v kombinaci s technikou HG-AAS. V nedávné době byla popsána úplně nová možnost prekoncentrace hydridotvorných prvků přímo v plazmovém DBD atomizátoru. Jediným dosud takto prekoncentrovaným analytem byl Bi, účinnost prekoncentrace se pohybovala kolem 60 %, podrobná optimalizace podmínek prekoncentrace však nebyla prováděna 19. Popsaná prekoncentrační procedura je velmi jednoduchá, proces záchytu a uvolnění analytu je kontrolován pouze složením plynné fáze v DBD atomizátoru, tj. přídavkem malého množství kyslíku do DBD dochází k záchytu analytu, uzavřením tohoto přívodu dochází k jeho uvolnění. Možnost prekoncentrace Se v DBD atomizátoru s využitím tohoto přístupu byla proto testována v rámci této diplomové práce. 23

24 3. Experimentální část 3.1 Instrumentace Atomový absorpční spektrometr Byl použit atomový absorpční spektrometr SavantAA (GBC, Austrálie). Zdrojem primárního záření byla selenová výbojka s vysokou září tzv. superlampa (Photron Ltd., Austrálie, vlnová délka: 196,0 nm, šířka spektrálního intervalu: 1,0 nm, napájecí proud: 18 ma, pomocný proud: 23 ma). Měření byla provedena bez korekce pozadí. Pouze některá měření v prekoncentračním režimu byla provedena s deuteriovou korekcí pozadí. Signál analytu byl integrován po dobu 90 s, v případě měření v režimu s prekoncentrací byl signál integrován jen po dobu 45 s. Vyhodnocovány byly jak plochy píků, tak i jejich výšky. Výsledky byly zpracovány programem MS Excel. Chybové úsečky v jednotlivých grafech reprezentují směrodatnou odchylku, uváděné výsledky jsou aritmetické průměry z nejméně 5 měření Hydridový generátor Byl použit průtokový generátor se separátorem fází s nuceným odtahem (Obr. 1), na bázi křemenné trubice (s vnitřním objemem 3 ml). Přívod směsného roztoku z reakční cívky i odtah kapalné fáze byl realizován skrz PTFE hadičky pomocí peristaltické pumpy (Ismatec, Švýcarsko). Průtoky jednotlivých činidel jsou uvedeny v Tab. 1. Tab. 1: Optimální podmínky hydridového generování Použité činidlo Průtok činidla (ml min 1 ) 1,0 mol l 1 HCl 3,8 0,5% NaBH 4 v 0,4% KOH 1,2 24

25 Obr. 1: Schéma aparatury pro HG-AAS Byly použity čerpací hadičky z materiálu Tygon o různých vnitřních průměrech, jako vedení kapalné a plynné fáze sloužily PTFE hadičky, k jejich spojování byly použity T-spojky z materiálu PEEK. Plynná fáze z generátoru hydridů obsahující Ar jako nosný plyn, hydrid analytu a vodík (z rozkladu NaBH 4 ) byla transportována do jednoho z atomizátorů použitých v této práci, který byl nastaven v optické ose atomového absorpčního spektrometru. Průtok Ar jako nosného plynu byl regulován pomocí regulátoru hmotnostního průtoku (Omega, USA) Atomizátory Plazmový atomizátor s dielektrickým bariérovým výbojem (DBD) Konstrukce tohoto atomizátoru vychází z publikace 18. Byl použit DBD atomizátor s křemennou výbojovou komůrkou s optickým ramenem obdélníkového průřezu s délkou 75 mm, výškou 15 mm a šířkou 3 mm s elektrodami výbojové komůrky o délce 50 mm, šířce 12 mm a tloušťce 0,15 mm, krytými z vnějšku vrstvou epoxidové pryskyřice pro potlačení parazitních výbojů na vnější straně výbojové komůrky. K optickému rameni bylo přitaveno přívodní rameno tvořené trubičkou z křemenného skla o délce 2 cm, vnitřním průměru 2 mm a vnějším průměru 4 mm. Atomizátor byl vyroben sklářem z komponent z křemenného skla zakoupených od UQG Optics, UK. 25

26 DBD atomizátor byl upevněn v nosném rámečku (z PVC), který jej chránil před mechanickým poškozením a také usnadňoval nastavení DBD do optické osy spektrometru. Ke spodní části rámečku byl připojen malý ventilátor ochlazující DBD atomizátor pomocí vzdušného proudění. Schéma DBD atomizátoru je zobrazeno na Obr. 2 A. Výboj byl v DBD atomizátoru buzen pomocí zdroje zkonstruovaného firmou Lifetech, s r. o. sestávajícího z generátoru budícího napětí a vysokonapěťového transformátoru. Generátor budicího napětí umožňuje regulaci výkonu a kmitočtu budícího napětí vysokonapěťového transformátoru. Napájení obou elektrod DBD atomizátoru z vysokonapěťového transformátoru je realizováno střídavým napětím s polaritou napětí na elektrodách vzájemně posunutou o polovinu periody. Elektrody DBD atomizátoru jsou tedy buzeny napětím se vzájemně opačnou polaritou. Tím se dosáhne přibližně dvojnásobné intenzity elektrického pole ve výbojové komůrce ve srovnání se systémem s jednou uzemněnou elektrodou. Tato konstrukce napájecího zdroje i DBD atomizátoru je chráněna užitným vzorem 21. Teplota vnějšího povrchu DBD atomizátoru byla během měření monitorována infračerveným teploměrem (model IR 260-8S, VOLTCRAFT). DBD atomizátor byl vyčištěn v případě poklesu citlivosti a po každé provedené sérii měření v přítomnosti interferentu. K čištění vnitřního povrchu DBD byla použita zředěná HNO 3 (1:2), kterou byl celý atomizátor naplněn na dobu 10 minut. Poté byl atomizátor propláchnut deionizovanou vodou a sušen na vzduchu. Modifikace vnitřního povrchu DBD atomizátoru za účelem jeho pasivace, prováděná jen v jedné sérii experimentů, byla provedena silanizačním činidlem (5% dimethyldichlorsilan v toluenu). DBD atomizátor byl vyčištěn zředěnou HNO 3 (viz výše) a usušen, poté byl naplněn silanizačním činidlem (5% roztok dimethyldichlorsilanu v toluenu) po dobu 2 min, vypláchnut třikrát toluenem a následně třikrát methanolem a poté usušen. 26

27 Obr. 2: Použité atomizátory: A) DBD atomizátor, B) MMQTA a C) EHPA Multiatomizátor (MMQTA) V současnosti jsou nejběžněji komerčně dostupné externě vyhřívané křemenné atomizátory ve tvaru písmene T. V této práci byl jako model vyhřívaného křemenného atomizátoru použit křemenný multiatomizátor 15,16, jehož analytické charakteristiky jsou v některých parametrech (linearita kalibrace a hlavně odolnost vůči interferenčním vlivům) lepší než u běžných křemenných atomizátorů. Jedná se o křemennou trubici ve tvaru písmene T, která je složena z přívodního ramene a optického ramene. Délka přívodního ramene MMQTA byla 100 mm, vnitřní průměr 2 mm, a vnější průměr 4 mm. Optické rameno (dlouhé 150 mm) bylo složeno ze dvou soustředných trubic vnější a vnitřní. Ve vnitřní trubici (i. d. 6 mm) jsou rovnoměrně rozmístěny otvory (celkem 14). Díky tomuto proniká vzduch přiváděný do vnější trubice (dále označovaný 27

28 jako vnější vzduch) skrz tyto otvory i do vnitřní trubice atomizátoru, kde přispívá ke zlepšení průběhu atomizace (viz kapitola Optimalizace pracovních podmínek MMQTA). MMQTA je schematicky znázorněn na Obr. 2 B. Pro ohřev MMQTA na teplotu 900 C byla použita odporová pícka AEHT-01 se zpětnou vazbou vyrobená firmou RMI (Lázně Bohdaneč, ČR). V některých experimentech byla do přívodního ramene atomizátoru vložena křemenná kapilára (Supelco, Německo, i. d. 0,53 mm), jejíž konec ústil do T-spojení přívodního a optického ramene MMQTA. Kapilárou mohl být přiváděn buď vzduch, nebo kyslík. Pokud kapilárou proudil kyslík, nebyl součastně zapojen přívod vnějšího vzduchu. Ostatní plyny ze separátoru fází (hydrid selenu, argon jako nosný plyn a H 2 jako produkt rozkladu NaBH 4 ) byly přiváděny skrz jeho přívodní rameno pomocí hadičky z PTFE koncentricky kolem kapiláry přivádějící vzduch nebo kyslík. (Obr. 2 B). Po každé provedené sérii interferenčních měření nebo při výraznějším poklesu citlivosti byl MMQTA čištěn směsí koncentrované HNO 3 a HF v poměru 7:3. Atomizátor byl naplněn touto směsí na dobu 10 minut, poté několikrát propláchnut deionizovanou vodou a následně sušen na vzduchu Externě vyhřívaný planární křemenný atomizátor (EHPA) Za účelem porovnání dějů probíhajících při atomizaci a k odhadu atomizační účinnosti v DBD atomizátoru byl rovněž použit externě vyhřívaný planární křemenný atomizátor, v textu dále označovaný jako EHPA (Obr. 2 C). Tento atomizátor je naprosto identický s částí DBD atomizátoru vyrobenou z křemenného skla. Na rozdíl od DBD atomizátoru nemá tento atomizátor žádné elektrody a nehoří v něm plazma, ale je vyhříván pomocí odporového drátu z kanthalu (4,17 Ω m 1, i. d. 0,65 mm). Odporové vyhřívání bylo realizováno spirálou z kanthalu rovnoměrně navinutou kolem optického ramene EHPA připojenou k laboratornímu napájecímu zdroji (PS B, EA, Elektro-Automatik GmbH, Viersen, Německo). Optické rameno EHPA včetně vyhřívací spirály bylo obaleno křemennou vatou Rescor (Cotronics Corp., USA) a převrstveno hliníkovou fólií k zamezení tepelných ztrát. Podobně jako u MMQTA byla do přívodního ramene EHPA vsunuta křemenná kapilára (i. d mm, Supelco) zajišťující přívod kyslíku nebo vzduchu (Obr. 2 C). 28

29 3.2 Použité chemikálie Na přípravu všech roztoků byly použity chemikálie o čistotě p. a. nebo vyšší. K přípravě roztoků byla používána deionizovaná voda (< 0.1 S.cm 1, Ultrapure, Watrex, USA). Pracovní roztoky Se +IV byly připravovány čerstvé ze zásobního roztoku 1 mg.ml 1 roztoku Se +IV (Fluka, ČR) naředěním na požadovanou koncentraci 1 mol l 1 HCl (Merck, Německo). Jako redukční činidlo byl využit 0,5 % (m/v) roztok NaBH 4 (Sigma Aldrich, Německo) v 0,4% (m/v) KOH (Merck, Německo). Po přefiltrování (nylonový filtr, 0,45 μm, Whatman, UK) byl roztok zmražen a rozmražen až v den použití. K ověření správnosti a přesnosti výsledků byly použity certifikované referenční materiály s certifikovanou hodnotou Se Grumo-K (Eurofins, Dánsko) a CRM 1643e (NIST, USA). V interferenční studii byly použity zásobní roztoky standardů As +III, Sb +III a Bi +III koncentrací 1000 mg.l 1 (Fluka, ČR), z nichž byly připraveny pracovní roztoky v 1 mol l 1 HCl obsahující konstantní koncentraci selenu a proměnnou koncentraci interferentu (5; 50 a 500 ng ml 1 ). Kyselina fluorovodíková (38% (m/v), p. a., Spolchemie, Ústí nad Labem, ČR) a kyselina dusičná (65%, p. a., Lach-Ner, ČR) byly použity při čištění křemenných atomizátorů. Vnitřní povrch DBD atomizátoru byl v některých experimentech modifikován (pasivován) 5% roztokem dimethyldichlorsilanu (DMDCS) v toluenu (Sylon CT od firmy Supelco). Při pasivaci povrchu byly použity rovněž methanol o čistotě 99,99 % (Sigma Aldrich, Německo) a toluen p. a. (Lachema a.s., Neratovice, ČR). Tlakové lahve s následujícími plyny: Ar (99,996 %), He (99,998 %), N 2 (99,99 %), H 2 (99,95%) a O 2 (99,5 %) byly dodány od firmy SIAD, s r. o. Jako zdroj stlačeného vzduchu sloužil kompresor v laboratoři. 29

30 3.3 Pracovní postup Většina měření byla provedena v režimu přímého přenosu, tj. generovaný hydrid byl ihned zaváděn z generátoru do příslušného atomizátoru. V některých měřeních byl využit i režim prekoncentrace, kdy byl vygenerovaný hydrid nejprve zachycen v DBD atomizátoru a následně byl uvolněn a atomizován. Postup generování hydridu byl ve všech měřeních stejný. Pomocí trojcestného ventilu (Obr. 1) bylo provedeno přepnutí mezi čerpáním slepého pokusu nebo standardního roztoku pomocí peristaltického čerpadla. Během jednoho replikátu byl vždy nejprve čerpán roztok standardu po dobu 30 s a následně byl čerpán slepý pokus po dobu 30 s tak, aby došlo k propláchnutí přívodní hadičky a separátoru fází. Dále byl peristaltickým čerpadlem vždy přiváděn NaBH 4 do reakční směsi. Experimentálně bylo zjištěno, že rozkladem tohoto redukčního činidla dochází v generátoru ke vzniku přibližně 15 ml min 1 vodíku. Průtokové rychlosti činidel byly převzaty z předchozí studie 43 zabývající se optimálními podmínkami generování hydridů a jsou shrnuty v Tab. 1. Měření v prekoncentračním režimu byla provedena s křemennou kapilárou, jejíž konec ústil do T-spojení přívodního a optického ramene DBD atomizátoru. Ostatní plyny byly přiváděny skrz jeho přívodní rameno pomocí hadičky z PTFE umístěné koncentricky kolem kapiláry do DBD atomizátoru. Schéma zapojení kapiláry v DBD atomizátoru je shodné s jejím zapojením v EHPA (Obr. 2 C). K zachycení analytu na křemenném skle vnitřního povrchu DBD atomizátoru docházelo při regulovaném průtoku kyslíku přidávaného kapilárou do DBD atomizátoru. K okamžitému uvolnění analytu postačilo přívod kyslíku vypnout. Pomocí trojcestného ventilu umístěného za regulátor průtoku kyslíku bylo realizováno přepnutí mezi zaváděním kyslíku nebo jeho vypnutím. 30

31 4. Výsledky a diskuse 4.1 Optimalizace pracovních podmínek v DBD atomizátoru V DBD atomizátoru bylo nutné nejprve nalézt optimální podmínky pro atomizaci hydridu selenu. Ačkoliv již obdobné studie byly pro atomizaci hydridotvorných prvků prováděny včetně selenu 18, nebyly dostatečně podrobné a navíc nebylo provedeno srovnání s jinými typy hydridových atomizátorů. Před vlastním srovnáním analytických charakteristik byla provedena optimalizace podmínek atomizace v testovaných atomizátorech, DBD nevyjímaje. Takovouto optimalizaci je třeba předem vždy provést, neboť experimentální podmínky z literatury nelze přejímat kvůli konstrukčním a experimentálním odlišnostem. Podmínky generování selenovodíku nebyly v této práci optimalizovány a byly použity podmínky na pracovišti dlouhodobě používané (Tab. 1) 43. Účinnost generování selenovodíku za těchto podmínek se blíží 100 % Vliv plazmového plynu Plazmový výboj v DBD lze provozovat v různých plynech a jejich směsích. Celkem bylo testováno pět plynů (argon, helium, vodík, dusík a vzduch). Experimentální podmínky (průtoky plynu, výkon DBD plazmatu) nebyly vždy stejné, protože zažehnout plazmový výboj v DBD atomizátoru a dosáhnout jeho stabilního hoření lze v různých plynech za různých podmínek. Ačkoli nebyly tyto podmínky shodné, nelišily se od sebe nijak významně. Průtoky plynů činily 75 ml min 1 pro Ar a He, zatímco pro dusík a vodík byl použit průtok 100 ml min 1. V případě Ar a He byl použitý výkon přiváděný do DBD plazmatu 14 W, pro dusík a vodík musel být zvýšen až na 24 W. Z provedených experimentů bylo zjištěno, že nejvyšší intenzity signálu bylo dosaženo v argonu. Signály v dusíku, heliu a vodíku byly vzájemně srovnatelné a v porovnání s Ar cca poloviční. Při použití vzduchu jako plazmového plynu nebyl pozorován žádný signál. Po znovu zapojení Ar jako plazmového plynu byl v DBD pozorován transientní signál analytu i při čerpání slepého pokusu, tj. při zavedení vodíku z hydridového generátoru do systému. Toto pozorování nasvědčuje tomu, že s použitím vzduchu jako plazmového plynu dochází k záchytu analytu v DBD 31

32 Citlivost (s ng -1 ) atomizátoru. Pokud by s použitím vzduchu analyt prošel DBD atomizátorem a opustil ho, aniž by byl atomizován, pak by nebyl pozorován signál analytu po znovuzavedení Ar a vodíku z generátoru do DBD atomizátoru. Podobné chování při zavádění vzduchu do DBD atomizátoru bylo nedávno zaznamenáno i u hydridu bizmutu 19. Toto zjištění naznačuje možnost prekoncentrace Se v DBD atomizátoru, která byla v rámci této práce dále testována (kapitola 4.6). Argon byl používán ve všech následujících experimentech jako plazmový plyn, neboť citlivost stanovení selenu v něm byla nejvyšší (viz Obr. 3). 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Argon Helium Dusík Vodík Použitý plazmový plyn Obr. 3: Vliv použitého plazmového plynu na citlivost stanovení Se v DBD atomizátoru Průtok plazmového plynu = 75 ml min 1 (Ar, He), respektive 100 ml min 1 (N2, H2), výkon DBD zdroje: 14 W (Ar, He), respektive 24 W (N2, H2), standard: 10 ng ml 1 Se +IV 32

33 Plocha píku (s) Vliv výkonu DBD zdroje Při průtoku 75 ml min 1 argonu byla studována závislost plochy píku na výkonu DBD zdroje. Lze konstatovat, že při výkonu pod 5 W nedochází v DBD atomizátoru ke vzniku stabilního plazmatu a tudíž není pozorovatelný žádný signál. S vyššími výkony již je plazma stejnoměrně rozmístěno a vzniká po celé délce měděných elektrod. V rozmezí od 5 do 17 W je signál selenu konstantní (viz graf na Obr. 4). Hodnota výkonu 14 W byla zvolena jako optimální. Zajímavým zjištěním bylo, že s dalším zvyšováním výkonu nedocházelo ke zlepšení signálu, ba naopak při výkonu 24 W dosahuje signál pouze 85% naměřeného signálu v maximu. Zjištěné poznatky jsou v rozporu s již dříve zmiňovaným článkem 18, kde bylo dosaženo maximum při 30 W. Ve zmiňované studii ovšem byly použity jiné podmínky pro hydridové generování, především pak v koncentracích použitých činidel, následkem čehož v generátoru vznikalo i jiné (vyšší) množství vodíku. 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4, Výkon DBD zdroje (W) Obr. 4a: Graf závislosti plochy píku na výkonu DBD zdroje Standard: 10 ppb Se +IV, v Ar = 75 ml min 1 33

34 Výška píku (-) 0,21 0,18 0,15 0, Výkon DBD zdroje (W) Obr. 4b: Graf závislosti výšky píku na výkonu DBD zdroje Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min Průtoková rychlost argonu Dalším z optimalizovaných parametrů byl průtok argonu jako plazmového plynu. Argon v DBD atomizátoru neslouží pouze jako nosný plyn, který přivádí plynnou směs ze separátoru fází do atomizátoru, ale slouží zároveň i jako výbojový plyn podporující hoření plazmatu. S rostoucím průtokem argonu proto signál nejprve stoupá, protože dochází k relativnímu poklesu frakce vodíku v nosném plynu a vodík má negativní vliv na citlivost (kapitola 4.1.1). Maximálního signálu je dosaženo při průtoku argonu ml min 1. Při vyšších průtocích dochází k poklesu signálu, při průtoku 175 ml min 1 činí pokles signálu 25 % z maximálního signálu. I při vyšších průtocích samozřejmě relativně klesá frakce vodíku v DBD atomizátoru, což má na signál pozitivní vliv, zároveň jsou však volné atomy ředěny vysokým průtokem argonu a jejich doba setrvání v optické ose spektrometru je tak nižší, což vede ke snížení signálu (viz Obr. 5). Jako optimální byl zvolen průtok 75 ml min 1 Ar. 34

35 Výška píku (-) Plocha píku (s) 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3, v Ar (ml min-1 ) Obr. 5a: Graf závislosti plochy píku na průtokové rychlosti argonu Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, výkon DBD zdroje: 14 W 0,13 0,12 0,11 0, v Ar (ml min-1 ) Obr. 5b: Graf závislosti výšky píku na průtokové rychlosti argonu Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, výkon DBD zdroje: 14 W 35

36 4.1.4 Vliv modifikace povrchu DBD atomizátoru Dle již citovaného článku 19 je možné zvýšit citlivost stanovení bismutu technikou HG-AAS s atomizací v DBD atomizátoru pomocí úpravy jeho vnitřního povrchu dimethyldichlorsilanem (DMDCS) použitým jako pasivační (silanizační) činidlo. Podobný experiment byl vyzkoušen také v této práci. Pro vlastní měření byl používán standardní roztok o koncentraci 10 ng ml 1 Se. Ve stejný den byl naměřen signál Se nejprve v nemodifikovaném DBD atomizátoru [5,71 ± 0,26 s, (n = 5)] a následně ve stejném kusu DBD atomizátoru tentokrát modifikovaném pomocí DMDCS [5,46 ± 0,19 s, (n = 5)]. Po vyhodnocení výsledků bylo usouzeno, že tato modifikace nemá na signál selenu na rozdíl od stanovení bismutu signifikantní vliv. Pasivace vnitřního povrchu DBD atomizátoru nebyla dále používána Vliv sušicí trubice Při stanovení některých analytů pomocí HG-AAS, zejména arsenu ve spojení s technikou kryogenního záchytu se mezi separátor fází a atomizátor zapojuje sušicí patrona plněná hydroxidem sodným 48,49. Tato slouží k odstranění spreje, jenž se mění při teplotě kapalného dusíku v led, který způsobuje zablokování chlazené U-trubice. Při stanovení As technikou HG-AAS s atomizací v DBD atomizátoru bylo zjištěno, že odstranění spreje z plynné fáze vede ke snížení šumu signálu a zlepšení citlivosti o cca 20 % 50, v případě MMQTA nemělo zařazení sušicí patrony na signál žádný vliv. Zařazení sušicí patrony s náplní NaOH proto bylo testováno i v rámci této práce, avšak s negativním výsledkem. Se zařazenou sušicí patronou došlo k úplnému vymizení signálu v DBD, stejný výsledek byl pozorován i při použití MMQTA jako atomizátoru. Pravděpodobně dochází ke kvantitativnímu zachycení vygenerovaného selenovodíku v sušicí patroně. Selenovodík má výrazně kyselejší charakter než arsenovodík 51, proto se zdá být jeho reakce s NaOH v náplni sušicí trubice logickým vysvětlením. Odstranění spreje nebylo v této práci dále prováděno. 36

37 Plocha píku (s) 4.2 Optimalizace pracovních podmínek v MMQTA V multiatomizátoru byly optimalizovány následující parametry: průtok nosného plynu, přídavek vnějšího vzduchu a přídavek buď vzduchu, nebo kyslíku kapilárou (Obr. 2 B) Průtoková rychlost nosného plynu- argonu Byla studována závislost odezvy analytu na průtoku nosného plynu. Graf na Obr. 6. zobrazuje sestupný trend této závislosti. Při nejnižším studovaném průtoku 25 ml min 1 je dosahováno nejvyššího signálu, avšak opakovatelnost měření je špatná. S ohledem jak na předchozí experimenty prováděné na zdejším pracovišti, tak i pro pozdější porovnání s DBD atomizátorem, byl pro další měření zvolen průtoku 75 ml min 1 Ar v Ar (ml min -1 ) Obr. 6a: Graf závislosti plochy píku na průtokové rychlosti argonu do MMQTA Standard: 5 ng ml 1 Se +IV 37

38 Výška píku (-) 0,25 0,20 0,15 0, v Ar (ml min -1 ) Obr. 6b: Graf závislosti výšky píku na průtokové rychlosti argonu do MMQTA Standard: 5 ng ml 1 Se +IV Průtoková rychlost vnějšího vzduchu Z literatury je známo, že přívod kyslíku nebo vzduchu má pozitivní vliv na atomizaci selenovodíku v MMQTA, což se projevuje dosažením vyšší citlivosti a větší odolnosti vůči interferencím 15,16. Vliv přívodu vzduchu jako vnějšího plynu na signál je znázorněn v grafu na Obr. 7. Z něho je patrné, že signál s rostoucím přídavkem vzduchu nejprve strmě vzrůstá, v rozmezí ml min 1 vzduchu dosahuje téměř konstantní hodnoty a s vyššími průtoky dochází opět k výraznému poklesu signálu analytu. Pokles signálu při vyšších průtocích vzduchu je způsoben částečným záchytem analytu v MMQTA, jak vyplývá z výsledků uvedených ve studii 43. Optimální hodnota průtokové rychlosti vnějšího vzduchu byla zvolena jako 20 ml min 1. Z experimentu bylo také zjištěno, že atomizace probíhá i bez přívodu vzduchu, kdy je signál analytu snížen přibližně na 50% jeho maximální odezvy v optimu. 38

39 Výška píku (-) Plocha píku (s) Průtoková rychlost vnějšího vzduchu (ml min -1 ) Obr. 7a: Graf závislosti plochy píku na přídavku vnějšího vzduchu do MMQTA Standard: 5 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min 1 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0, Průtoková rychlost vnějšího vzduchu (ml min -1 ) Obr. 7b: Graf závislosti výšky píku na přídavku vnějšího vzduchu do MMQTA Standard: 5 ng ml 1 Se +IV,v Ar = 75 ml min 1 39

40 4.2.3 Průtoková rychlost vzduchu přiváděného kapilárou V další sérii experimentů byl vzduch do MMQTA přiváděn skrz kapiláru vloženou do přívodního ramene MMQTA. Tato měření byla provedena kvůli možnosti srovnání výsledků dosažených v MMQTA a EHPA atomizátorech, neboť EHPA atomizátor kvůli své konstrukci optického ramene, které je jednoplášťové, neumožňuje na rozdíl od MMQTA přívod vnějšího plynu. Byl použit pracovní standard o koncentraci 10 ng ml 1 Se a proto jsou signály v grafu na Obr. 8 cca dvojnásobné v porovnání s výsledky uvedenými v grafu na Obr. 7. Z grafu na Obr. 8 vyplývá, že je dosaženo plato při průtoku 5-15 ml min 1 vzduchu přidávaného kapilárou. Můžeme si všimnout, že při průtoku vzduchu 20 ml min 1 a vyšším dochází ke strmému poklesu velikosti odezvy analytu, až k jeho úplnému potlačení. Důvody pro pokles signálu při vyšších průtocích vzduchu jsou stejné jako v případě diskutovaném v kapitole Optimální hodnota průtokové rychlosti vzduchu byla zvolena 10 ml min 1. Závislost uvedená v grafu na Obr. 8 má stejný průběh jako ta v grafu na Obr. 7, pouze s tím rozdílem, že maximum je posunuté k nižším hodnotám průtoku vzduchu v případě jeho dávkování skrz kapiláru v porovnání s dávkováním skrz kanál pro vnější plyn. Toto pozorování má logické vysvětlení. V případě dávkování vzduchu skrz kapiláru do středu vyhřáté zóny MMQTA zreaguje veškerý kyslík obsažený v zaváděném vzduchu s vodíkem za vzniku vodíkových radikálů. Pokud je vzduch zaváděn jako vnější plyn, pak jeho určitá frakce proniká do MMQTA v okrajových zónách optického ramene atomizátoru, které mají nízkou teplotu. V těchto oblastech nedojde k reakci mezi kyslíkem ze vzduchu a vodíkem a nevzniknou vodíkové radikály. Jinými slovy je při stejném průtoku vzduchu dosaženo vyšší koncentrace kyslíku ve středové zóně MMQTA vyhřáté na atomizační teplotu v případě zavádění vzduchu kapilárou než v případě zavádění vzduchu jako vnějšího plynu. 40

41 Výška píku Plocha píku (s) Průtoková rychlost vzduchu do MMQTA (ml min -1 ) Obr. 8a: Graf závislosti plochy píku na přídavku vzduchu kapilárou do MMQTA Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min 1 0,30 0,20 0,10 0, Průtoková rychlost vzduchu do MMQTA (ml min -1 ) Obr. 8b: Graf závislosti výšky píku na přídavku vzduchu kapilárou do MMQTA Standard: 10 ng ml 1,v Ar = 75 ml min 1 41

42 Plocha píku (s) Průtoková rychlost kyslíku přiváděného kapilárou Stejnou kapilárou jakou byl do multiatomizátoru přiváděn vzduch, byl přiváděn i čistý kyslík. Závislost signálu na průtoku kyslíku kapilárou je uvedena v grafu na Obr. 9, její průběh je velice podobný závislosti signálu na přiváděném vzduchu skrz kapiláru (Obr. 8). Maximálního signálu je dosaženo pro hodnoty průtokové rychlosti kyslíku 1-3 ml min 1. Vezmeme-li v úvahu zastoupení kyslíku ve vzduchu, pak jsou tyto výsledky v dobré shodě s těmi pozorovanými v kapitole při dávkování vzduchu do MMQTA skrz kapiláru, kdy byl maximální signál pozorován pro průtokovou rychlost vzduchu v rozmezí 5-15 ml min 1. Optimální průtoková rychlost kyslíku používaná v dalších experimentech činila 2,5 ml min 1 O Průtoková rychlost kyslíku do MMQTA (ml min -1 ) Obr. 9a: Graf závislosti plochy píku na přídavku kyslíku kapilárou do MMQTA Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min 1 42

43 Výška píku (-) 0,3 0,2 0,1 0, Průtoková rychlost kyslíku do MMQTA (ml min -1 ) Obr. 9b: Graf závislosti výšky píku na přídavku kyslíku kapilárou do MMQTA Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min Optimalizace pracovních podmínek v EHPA Průtoková rychlost nosného plynu- argonu Pro optimalizaci tohoto parametru byl použit pracovní roztok 20 ng ml 1 Se +IV. S postupným zvyšováním průtoku nosného plynu dochází ke snížení signálu selenu, jak je patrné z grafu na Obr. 10. Toto chování je analogické jako v MMQTA. Jelikož bylo při průtokových rychlostech 25 a 50 ml min 1 Ar dosahováno špatné opakovatelnosti měření, byla jako optimální hodnota průtoku nosného plynu zvolena hodnota 75 ml min 1 Ar. Všechny tři atomizátory studované v této práci byly provozovány za stejného průtoku Ar. 43

44 Výška píku (-) Plocha píku (s) v Ar (ml min -1 ) Obr. 10a Graf závislosti plochy píku na průtokové rychlosti argonu do EHPA Standard: 20 ng ml 1 Se +IV 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0, v Ar (ml min -1 ) Obr. 10b: Graf závislosti výšky píku na průtokové rychlosti argonu do EHPA Standard: 20 ng ml 1 Se +IV 44

45 Plocha píku (s) Průtoková rychlost vzduchu přiváděného kapilárou Analogické měření jako v MMQTA s přídavkem vzduchu kapilárou bylo provedeno i v EHPA. Graf této závislosti (Obr. 11) má také podobný trend. Maximálního signálu bylo dosaženo při průtoku 7,5 ml min 1. Tato hodnota je srovnatelná s optimální hodnotou průtoku vzduchu do MMQTA, která se pohybovala v intervalu 5 až 15 ml min 1, avšak na rozdíl od MMQTA není v EHPA dosaženo širšího plata. Jedním z možných vysvětlení je menší vnitřní objem optického ramene EHPA a výraznější vliv naředění volných atomů analytu vyššími průtoky vzduchu Průtoková rychlost vzduchu do EHPA (ml min -1 ) Obr. 11a: Graf závislosti plochy píku na přídavku vzduchu kapilárou do EHPA Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min 1 45

46 Výška píku (-) 0,12 0,10 0,08 0,06 0, Průtoková rychlost vzduchu do EHPA (ml min -1 ) Obr. 11b Graf závislosti výšky píku na přídavku vzduchu kapilárou do EHPA Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min Průtoková rychlost kyslíku přiváděného kapilárou Tento pokus byl podobný předchozí optimalizaci průtoku vzduchu přiváděného kapilárou diskutované v kapitole Přiváděným plynem kapilárou byl tentokrát kyslík. Jak je vidět na Obr. 12, bylo dosaženo maxima při průtokové rychlosti kyslíku 2,5 ml min 1. S vyššími průtoky dochází opět k poklesu signálu analytu. Optimální hodnota průtoku kyslíku do EHPA je 5-krát menší než potřebná hodnota průtoku vzduchu přiváděného kapilárou pro dosažení maximálního signálu, což odpovídá zastoupení kyslíku ve vzduchu a potvrzuje konzistenci naměřených dat. Hodnoty průtoku kyslíku potřebné pro dosažení maximálního signálu jsou srovnatelné pro MMQTA (1-3 ml min 1 ) a EHPA (2,5 ml min 1 ). V případě MMQTA je pozorováno výraznější plato, zatímco pro EHPA je oblast maxima poměrně úzká a to jak pro měření prováděná s kyslíkem, tak i se vzduchem. 46

47 Výška píku (-) Plocha píku (s) Průtoková rychlost kyslíku do EHPA (ml min -1 ) Obr. 12a: Graf závislosti plochy píku na přídavku kyslíku kapilárou do EHPA Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min 1 0,15 0,10 0,05 0, Průtoková rychlost kyslíku do EHPA (ml min -1 ) Obr. 12b: Graf závislosti výšky píku na přídavku kyslíku kapilárou do EHPA Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min 1 47

48 4.4 Souhrn optimálních podmínek atomizace v použitých atomizátorech Ze závislostí naměřených v kapitolách 4.1 až 4.3 byly určeny optimální podmínky atomizace selenovodíku pro každý z atomizátorů a tyto jsou přehledně shrnuty v Tab. 2. Z této tabulky je patrné, že množství vzduchu resp. kyslíku potřebné pro atomizaci v EHPA a MMQTA je srovnatelné, což naznačuje, že atomizační procesy v těchto dvou atomizátorech budou podobné. EHPA lze použít jako vhodný model vyhřívaného křemenného atomizátoru pro srovnání s DBD atomizátorem. Porovnáním signálů za optimálních podmínek pro MMQTA (Obr. 13) lze konstatovat, že citlivost v EHPA dosahuje asi 40 % citlivosti v MMQTA, což je v uspokojivé shodě s očekáváním, jelikož poměr délky optických drah v MMQTA a EHPA je 2:1. Tab. 2: Přehled optimálních hodnot parametrů pro stanovení Se +IV metodou HG-AAS Optimální podmínky atomizace MMQTA EHPA DBD Teplota atomizace ( C) Průtoková rychlost vnějšího vzduchu (ml min 1 ) Průtoková rychlost vzduchu přiváděného kapilárou (ml min 1 ) 10 7,5 - Průtoková rychlost kyslíku přiváděného kapilárou (ml min 1 ) 2,5 2,5 - Výkon DBD zdroje (W) 14 48

49 Plochapíku (s) DBD atomizátor EHPA MMQTA Typ použitého atomizátoru Obr. 13: Srovnání ploch píku v MMQTA, EHPA a DBD atomizátoru Pro všechny atomizátory: standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min 1, navíc pro MMQTA a EHPA: v O 2 = 2,5ml min 1 a pro DBD atomizátor: výkon DBD zdroje: 14 W 49

50 4.5 Srovnání analytických charakteristik Kalibrační závislost v různých atomizátorech Při optimálních podmínkách generování (viz Tab. 1) a atomizace hydridu selenu (viz Tab. 2) byly naměřeny kalibrační závislosti v MMQTA, EHPA a DBD atomizátoru. Měření byla provedena při stejných podmínkách generování se shodným hydridovým generátorem, proto jsou výsledky plně srovnatelné. Z porovnání směrnic kalibračních přímek na Obr. 14 vyplývá, že nejvyšší citlivosti je dosaženo v MMQTA, citlivost v EHPA je cca 40% v porovnání s MMQTA, zatímco v DBD atomizátoru činí cca 60 % hodnoty dosažené v MMQTA. Poměr citlivostí v MMQTA a EHPA odpovídá poměru délek optických drah těchto dvou atomizátorů, přičemž se předpokládá totožný mechanismus atomizačních dějů, jak již bylo diskutováno v kapitole 4.4. Srovnání MMQTA a DBD atomizátoru je komplikované z důvodu rozdílné geometrie obou atomizátorů a hlavně kvůli předpokládaným odlišnostem v mechanismech atomizačních procesů v těchto dvou atomizátorech. EHPA a DBD atomizátory mají stejnou geometrii optického ramene, při jejich srovnání je však třeba brát v potaz, že EHPA je modelem vyhřívaného atomizátoru s atomizační teplotou 900 C, zatímco DBD je plazmový atomizátor, ve kterém se řádově liší teplota elektronů od teploty iontů a neutrálních částic. V této práci byla pro DBD měřena jen teplota povrchu atomizátoru v jeho střední části, jež dosahovala cca 40 C. Citlivost EHPA dosahuje asi 60 % citlivosti v DBD. Určení účinnosti atomizace v DBD je tak poměrně komplikované a přesahuje rámec této diplomové práce. V režimu přímého přenosu byly mezi sebou porovnány dva identické DBD atomizátory, které byly předtím vyčištěny pomocí HNO 3. V prvním kuse byla s použitím standardu o koncentraci 10 ng ml 1 Se naměřena hodnota plochy píku [5,71 ± 0,26 s, (n=5)]. V druhém kuse činila tato hodnota [5,39 ± 0,17 s, (n=5)]. Z porovnání signálů naměřených ve stejný den za optimálních podmínek generování (Tab. 1) a atomizace (viz Tab. 2) se lze domnívat, že oba DBD atomizátory vykazují srovnatelnou citlivost. 50

51 Obr. 14: Graf kalibračních závislosti z plochy píku na koncentraci Se +IV v různých typech atomizátorů, MMQTA ( ), EHPA( ) a DBD atomizátor ( ) Pro všechny atomizátory: standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min 1, navíc pro MMQTA a EHPA: v O 2 =2,5ml min 1 a pro DBD atomizátor: výkon DBD zdroje: 14 W Základní analytické charakteristiky všech atomizátorů testovaných v této práci jsou shrnuty v Tab. 3, ve které jsou rovněž uvedeny výsledky stanovení Se ve dvou certifikovaných referenčních materiálech s použitím MMQTA atomizátoru a DBD atomizátoru. MMQTA byl vybrán jako zástupce běžně používaných externě vyhřívaných křemenných atomizátorů, DBD je nově testovaným atomizátorem, pro který nebylo dosud provedeno detailní porovnání přesnosti a správnosti měření. Stanovení CRM v EHPA nebylo prováděno. V případě CRM Grumo-K se od sebe výsledky dosažené v DBD a MMQTA statisticky významně neliší a díky velké nejistotě certifikované hodnoty CRM Grumo-K se neliší ani od této hodnoty. V případě CRM 1643e byly hodnoty stanovené v DBD i MMQTA vyšší než certifikovaná hodnota, shoda výsledků není plně uspokojivá. Ve stejném kusu DBD atomizátoru byl po dobu čtyř měsíců měřen standardní roztok Se o koncentraci 10 ng ml 1. Během tohoto časového intervalu, který zahrnuje celkem 22 měřících dnů, byla průměrná citlivost [0,33 ± 0,02 s ng 1, (n = 22)], což svědčí o dobré dlouhodobé opakovatelnosti výsledků v DBD atomizátoru. 51

52 Tab. 3: Srovnání vybraných analytických charakteristik v MMQTA, EHPA a DBD atomizátoru DBD EHPA MMQTA LOD (ng ml 1 ) 0,24 0,32 0,15 LOQ (ng ml 1 ) 0,80 1,07 0,50 m 0 (pg) 14,1 22,4 9,1 Citlivost (s ng 1 ) 0,32 ± 0,01 0,21 ± 0,03 0,53 ± 0,04 CRM Grumo-K 0,98 ± 0,04-0,91 ± 0,07 (ng ml 1 ) certifikovaná hodnota 0,77 ± 0,4 CRM 1643e 13,55 ± 0,33-15,04 ± 0,31 (ng ml 1 ) certifikovaná hodnota 11,97 ± 0,14 52

53 4.5.2 Interference v MMQTA a DBD atomizátoru V interferenční studii byl studován vliv As +III, Bi +III a Sb +III na stanovení Se metodou HG-AAS v MMQTA a DBD atomizátoru. V Tab. 4 jsou shrnuty dosažené výsledky. Koncentrace standardu selenu bez interferentu byla použita v MMQTA respektive v DBD atomizátoru 5 ng ml 1 respektive 10 ng ml 1 z důvodu odlišných citlivostí obou atomizátorů. Koncentrace interferujících iontů byla vždy 5; 50 a 500 ng ml 1. Vliv jednotlivých interferentů je relativně srovnatelný v obou použitých atomizátorech. Při koncentracích 500 ng ml 1 každého z interferentu je relativně lepšího výsledku dosaženo v DBD atomizátoru než v MMQTA. V obou atomizátorech byla provedena i měření standardu bez přídavku interferentu, k těmto měřením byla vztahována měření v přítomnosti interferentu. Ačkoli experimentální uspořádání použité v této interferenční studii neumožňuje rozlišit mezi interferencemi vzniklými během generování a interferencemi atomizačními, na základě literárních údajů lze očekávat, že interference v kapalné fázi by se neměly u studovaných interferentů a na daných koncentračních úrovních objevit 51. Dále je nutné zdůraznit, že i v případě výskytu interference v kapalné fázi by tato ovlivnila stejně výsledky v MMQTA i DBD, jelikož byl použit stejný hydridový generátor. Pokud se od sebe odezva v MMQTA a DBD při použití stejného modelového standardu obsahujícího Se a interferent liší, jednoznačně to znamená atomizační interferenci. Definujme si tzv. toleranční limit, což je v literatuře často používaný přístup, který stanovuje, že hodnota změny signálu do 10 % od referenční hodnoty ještě neznamená interferenci, neboť tato změna může být způsobena náhodnými vlivy 53. S použitím této konvence lze konstatovat, že při koncentraci interferentu 50 ng ml 1 se interference neprojevuje u žádného ze studovaných interferentů ani v jednom ze studovaných atomizátorů. Při nejvyšší studované koncentraci 500 ng ml 1 se interference projevuje u všech studovaných prvků v obou atomizátorech, s výjimkou Sb jako interferentu při atomizaci v DBD, kde interference nebyla pozorována. V ostatních případech činí potlačení signálu %. Z Tab. 4 je patrné, že odolnost DBD atomizátoru vůči interferencím je srovnatelná nebo lepší než v MMQTA. 53

54 Tab. 4: Vliv dalších hydridotvorných prvků jako interferentů na signál Se v MMQTA a DBD Relativní signál (%) v přítomnosti interferentu Interferent Atomizátor (koncentrace interferentu, ng ml 1 ) MMQTA 100 ± 2,0 103 ± 1,5 92 ± 0,6 73 ± 2,6 As DBD 100 ± 1,1 104 ± 0,9 94 ± 1,2 89 ± 2,6 Sb Bi MMQTA 100 ± 0,5 96 ± 0,3 95 ± 0,7 64 ± 1,8 DBD 100 ± 2,1 102 ± 2,7 106 ± 1,2 102 ± 3,4 MMQTA 100 ± 1,3 106 ± 0,7 104 ± 0,6 46 ± 4,2 DBD 100 ± 1,5 95 ± 1,4 93 ± 1,4 72 ± 0,9 4.6 Prekoncentrace v DBD Jak již bylo podrobně uvedeno v teoretické části (kapitola 2.4) využívá se technika prekoncentrace ke snížení detekčního limitu. V této kapitole byla testována možnost prekoncentrace selenu v DBD atomizátoru. Výsledky diskutované v kapitole 4.1.1, kdy s použitím vzduchu jako plazmového plynu nebyl pozorován žádný signál, zatímco transientní signál analytu byl pozorován při záměně vzduchu za argon jako plazmový plyn, vedou k domněnce, že za přítomnosti kyslíku v plazmovém plynu dochází k záchytu analytu, zatímco v jeho nepřítomnosti za současné přítomnosti vodíku lze prekoncentrovaný analyt uvolnit a atomizovat. Pravdivost této domněnky byla ověřena experimenty diskutovanými v této kapitole. Byl testován vliv přídavku kyslíku na prekoncentrační účinnost, dále i vliv doby prekoncentrace a modifikace vnitřního povrchu na účinnost prekoncentrace. Kyslík byl do DBD atomizátoru přiváděn skrz kapiláru a prekoncentrační procedura byla prováděna podle postupu, který je popsán v kapitole

55 Plocha píku (s) Vliv přídavku kyslíku na signál v režimu přímého přenosu Na Obr. 15 je znázorněn vliv přídavku kyslíku do argonu jako plazmového plynu na signál Se v DBD atomizátoru v režimu přímého přenosu. Z grafu na Obr. 15 je dobře patrný sestupný trend této závislosti. Lze konstatovat, že velikost pozorovaného signálu Se při generování a atomizaci v přímém přenosu klesá s vyššími průtoky kyslíku zaváděného kapilárou do DBD atomizátoru Průtoková rychlost kyslíku do DBD atomizátoru (ml min -1 ) Obr.15: Graf závislosti plochy píku na průtokové rychlosti kyslíku přiváděného kapilárou do DBD atomizátoru Standard: 10 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min 1,výkon DBD zdroje: 14 W Vliv přídavku kyslíku na prekoncentrační účinnost V tomto experimentu byl opět studován vliv průtoku kyslíku zaváděného kapilárou do DBD atomizátoru tentokrát na signál v prekoncentračním režimu. Porovnáním signálu naměřeného v kroku uvolnění prekoncentrační procedury se signálem v režimu bez prekoncentrace lze kvantifikovat prekoncentrační účinnosti. Z grafu na Obr. 16 je zřejmé, že prekoncentrační účinnost roste s rostoucím průtokem kyslíku do DBD atomizátoru v kroku záchytu. Toto pozorování koreluje s faktem, že velikost signálu v režimu bez prekoncentrace naopak s rostoucím průtokem kyslíku 55

56 klesá (Obr. 15). Při průtoku kyslíku 3,5 ml min 1 signál selenu v režimu přímého přenosu vymizí, zatímco signál v prekoncentračním režimu dosáhne maximální hodnoty, která se už s dalším zvýšením průtoku kyslíku nemění. Průtoková rychlost kyslíku 3,5 ml min 1 byla určena jako optimální hodnota, která byla používána i v dalších experimentech. Pro toto měření a další experimenty byl použit jiný kus DBD atomizátoru (označený jako č. 7), zatímco pro experimenty v režimu přímého přenosu diskutované v kapitole 4.1 byly naměřeny v kusu DBD označeném jako č. 4. Referenční měření v režimu bez prekoncentrace prováděná za účelem kvantifikace prekoncentrační účinnosti byla prováděna ve stejném kusu DBD jako vlastní měření v režimu prekoncentrace, tj. v kuse DBD s označením č. 7. Dosažená účinnost prekoncentrace se pohybovala kolem 75 %, jak je patrné z grafu na Obr. 16. Obr.16: Graf závislosti prekoncentrační účinnosti na průtokové rychlosti kyslíku přiváděného kapilárou Standard: 1 ng ml 1 Se +IV, v Ar = 75 ml min Vliv doby prekoncentrace na prekoncentrační účinnost Výhodou prekoncentrace je fakt, že lze analyt generovat z velkého objemu vzorku po delší dobu, až je prekoncentrované množství analytu dostatečné, aby poskytlo dobře měřitelný signál. Při vývoji metodiky prekoncentrace je třeba ověřit, že při prodloužení 56

57 doby prekoncentrace se nemění prekoncentrační účinnost, tj. nedochází k nežádoucím ztrátám analytu. Byla provedena série experimentů se standardy Se různých koncentrací a s různou délkou doby prekoncentrace. Podmínky byly zvoleny tak, aby ve všech experimentech bylo absolutní množství vygenerovaného Se stejné (2 ng). Byly použity standardy o koncentraci 0,1; 0,25 a 1 ng ml 1 Se, jež byly prekoncentrovány po dobu 300; 120 a 30 s. Výsledky byly srovnány s režimem bez prekoncentrace s použitím doby čerpání standardu 1 ng ml 1 Se po dobu 30 s, absolutní množství vygenerovaného Se tak opět činilo 2 ng. Výsledky jsou shrnuty v Tab. 5. Je patrné, že prekoncentrační účinnost s rostoucí dobou prekoncentrace Se klesá a to z hodnoty 80 % při době prekoncentrace 30 s na 60 % s použitím prekoncentrační doby 300 s. Z výsledků je zřejmé, že během prekoncentrace dochází k nežádoucím ztrátám analytu. Tab. 5: Srovnání prekoncentračních účinností na době prekoncetrace c Se +IV (ng ml 1 ) Čas prekoncentrace (s) Plocha píku (s) Prekoncentrační účinnost (%) 1 0 0,966 ± 0, ,769 ± 0,015 79,7 ± 1,5 0, ,674 ± 0,012 69,8 ± 1,0 0, ,582 ± 0,032 60,3 ± 3, Porovnání prekoncentrační účinnosti v různých kusech DBD atomizátorů Během studia prekoncentrace byly vyzkoušeny také jiné kusy DBD atomizátorů s použitím stejných podmínek generování, prekoncentrace i následné atomizace prekoncentrovaného Se jako v DBD číslo 7. Cílem těchto experimentů bylo porovnat opakovatelnost měření v různých kusech DBD. Zároveň byl testován i vliv modifikace vnitřního povrchu DBD atomizátoru pomocí DMDCS na prekoncentrační účinnost. Modifikace byla provedena stejným postupem jako při měřeních prováděných v režimu přímého přenosu (kapitola a 4.1.4). Výsledky jsou přehledně shrnuty v Tab. 6. Z této tabulky je patrné, že v původně používaném kuse DBD atomizátoru, ve kterém 57

58 byla prováděna celá studie v režimu přímého přenosu (č. 4), dochází k výraznému kolísání hodnoty prekoncentrační účinnosti den ode dne. Zatímco minimální hodnota prekoncentrační účinnosti činila pouze 31 %, maximální dosažená hodnota byla více než dvojnásobná a činila téměř 73 %. Takto velký rozptyl ve výsledcích pozorovaný v intervalu jednoho měsíce vedl k rozhodnutí vyzkoušet prekoncentraci selenu i v dalších kusech DBD atomizátorů (č. 3, 6 a 7). Rozdíly v prekoncentrační účinnosti zjištěné v různých dnech i v různých atomizátorech nebyla zdaleka tak velké jako v případě kusu DBD č. 4, prekoncentrační účinnost fluktuovala v intervalu % (Tab. 6). Modifikace vnitřního povrchu pomocí DMDCS (kus č. 7) neměla na hodnotu prekoncentrační účinnosti žádný vliv. Další měření byla prováděna v kuse DBD č. 7 a bez modifikace. Tab. 6: Prekoncentrační účinnosti v různých kusech DBD atomizátorů Datum (2015) DBD -4- DBD -6- DBD -7- DBD ,5 ± 3, ,9 ± 2, ,8 ± 1, ,1 ± 6,8 61,5 ± 3,6 70,6 ± 2,2* ,4 ± 2,3 81,9 ± 1, ,0 ± 2,8 84,6 ± 3, ,7 ± 1, ,4 ± 1, ,4 ± 2,6 Podmínky měření: přídavek kyslíku- 3,5 ml/min, výkon DBD zdroje- 14 W, průtoková rychlost argonu- 75 ml/min * Modifikace povrchu (5% roztok dimethyldichlor silanu) Kalibrační závislost v prekoncentračním režimu Pro kalibrační měření v prekoncentračním režimu byl zvolen DBD atomizátor č. 7. Byly proměřeny celkem 2 kalibrační závislosti (viz Obr. 17a). První při prekoncentrační době 30 s se standardy 0,25; 0,5; 1 a 2 ng ml 1 Se. Druhá byla naměřena při době prekoncentrace 300 s se standardy 25; 50; 100 a 200 pg ml 1 Se. V obou kalibracích v prekoncentračním režimu byl změřen také certifikovaný referenční materiál Grumo-K. Zjištěné analytické charakteristiky i výsledky stanovení v CRM jsou uvedeny v Tab. 7. Pro DBD atomizátor č. 7 byla také provedena kalibrace v režimu přímého přenosu (viz Obr. 17b). Z porovnání směrnic kalibrační závislosti 58

59 v prekoncentračním režimu (30 s) a bez prekoncentrace ve stejném DBD atomizátoru byla odhadnuta prekoncentrační účinnost na 70 %. Toto je ve shodě s předchozími pozorováními (Tab. 5). Při prodloužení doby prekoncentrace na 300 s dochází kvůli ztrátám k poklesu prekoncentrační účinnosti na 56 %, což opět koreluje s výsledky pozorovanými v kapitole (Tab. 5). Bylo zjištěno, že směrnice kalibrační přímky v DBD atomizátoru č. 4 (Obr. 14) je odlišná od směrnice kalibrační přímky v DBD č. 7 (Obr. 17b). Citlivost DBD atomizátoru č. 4 je přibližně 60 % citlivosti DBD atomizátoru č. 7. Zjištěné rozdíly v citlivosti DBD atomizátorů č. 4 a 7 jsou výrazně větší než mezi DBD atomizátory č. 4 a 5, u kterých nebyl pozorován výraznější rozdíl v citlivosti, jak bylo diskutováno v kapitole Ačkoliv byly v režimu přímého přenosu porovnány pouze tři kusy DBD atomizátorů, lze konstatovat, že rozdíly v citlivosti u těchto plazmových atomizátorů budou srovnatelné s těmi pozorovanými u vyhřívaných křemenných atomizátorů. U nich dosahují tyto rozdíly běžně desítek procent 3. Obr. 17a: Graf kalibračních závislosti z plochy píku na koncentraci Se +IV v DBD atomizátoru č. 7 Doba prekoncentrace 30s ( ), doba prekoncentrace 300s ( ), výkon DBD zdroje: 14W, v Ar = 75ml min 1, přídavek kyslíku kapilárou pro prekoncentraci: 3,5 ml min 1 59

60 Obr. 17b: Graf kalibrační závislosti z plochy píku na koncentraci Se +IV v DBD atomizátoru č. 7 v režimu přímého přenosu Výkon DBD zdroje: 14W, v Ar = 75ml min 1 Tab. 7: Analytické charakteristiky DBD atomizátoru č. 7 v prekoncentračním režimu s dobou prekoncentrace 30 a 300 s a režimu přímého přenosu Přímý přenos Prekoncentrace Doba generování (s) LOD (ng ml 1 ) 0,09 0,17 0,012 LOQ (ng ml 1 ) 0,29 0,57 0,040 Citlivost (s ng 1 ) 0,58 ± 0,07 0,37 ± 0,03 0,32 ± 0,03 m 0 (pg) 8,1 11,9 1,5 CRM Grumo-K - 0,74 ± 0,01 0,57 ± 0,14 (ng ml 1 ) certifikovaná hodnota 0,77±0, Porovnání signálu v prekoncentračním režimu a bez prekoncentrace V závěrečném pokusu byl porovnán signál standardu selenu o koncentraci 1 ng ml 1 v režimu přímého přenosu a v prekoncentračním režimu. Záznamy obou 60

61 signálu jsou znázorněny na Obr. 18. Z něho je patrné, že signál v režimu bez prekoncentrace je již velmi nízký a vykazuje špatný odstup od šumu. Naopak v režimu s prekoncentrací je dosaženo úzkého vysokého signálu, který lze snadno vyhodnotit. Ze záznamu na Obr. 18 je rovněž patrné, že hodnota slepého stanovení v režimu s prekoncentrací je zanedbatelná. Obr. 18: Porovnání signálu Se generovaného v prekoncentračním režimu a bez prekoncentrace Generování v režimu přímého přenosu (1), generování v režimu 30s prekoncentrace (2), generování slepého pokusu v režimu 30s prekoncentrace (černě), standard: 1 ng ml 1 Se +IV, výkon DBD zdroje: 14W, v Ar = 75ml min 1, přídavek kyslíku kapilárou pro prekoncentraci: 3,5 ml min 1 V některých případech dochází k signifikantnímu zvýšení hodnot slepých stanovení při použití prekoncentračních technik, neboť se zde již výrazně projevuje kontaminace použitých chemikálií stanovovaným analytem. Vliv na signál analytu může mít také přidávaný kyslík, zejména změna jeho koncentrace mezi krokem záchytu a krokem uvolnění. Bylo prokázáno, že v oblasti pod 200 nm leží absorpční pásy molekulárního kyslíku, které při stanovení selenu na čáře 196,0 nm způsobují interferenci díky nespecifické absorpci 54. Tato interference byla popsána při studiu prekoncentrace selenu v prekoncentračním a atomizačním zařízení na bázi křemenného atomizátoru 43,54. Nespecifická absorpce kyslíku je výrazně závislá na teplotě, kdy 61