Experimentální data pro určení struktury proteinu

Transkript

1 Experimentální data pro určení struktury proteinu přiřazení co největšího počtu rezonancí intenzita NOESY krospíků chemické posuvy J-vazby vodíkové můstky zbytková dipolární interakce... omezení vzdáleností indikace sekundární struktury omezení dihedrálních úhlů omezení dihedrálních úhlů omezení vzdáleností, vazebných úhlů vzájemná orientace částí molekuly

2 2D NOESY

3 15 N editované NOESY 15N-NOESY-HSQC H (t 1 ) H N(t 2 ) H N (t 3 )

4 13 C editované NOESY 13C-HMQC-NOESY H C(t 1 ) H(t 2 ) H(t 3 )

5 Interpretace NOESY objem krospíku vzdálenost průměrování rychlými pohyby vibrace ovlivnění pomalejšími pohyby rotace molekuly a lokální flexibilita H H r < 5 Å platí jen pro počáteční nárůst nízká intenzita píku delší směšovací časy spinová difuze ovlivnění konformačními a chemickými výměnami různé NOE v různých konformacích, průměrování pouze semi-kvantitativní vyhodnocení všechny efekty zmenšují NOE

6 strong: 1.8 Å r 2.8 Å Interpretace NOESY medium: 1.8 Å r 3.5 Å Dolní mez: 1.8 Å součet van der Waalsovských poloměrů atomů vodíku weak: 1.8 Å r 5.0 Å Horní mez: podle intenzity krospíku zařazení do 3 5 kategorií

7 Využití chemických posuvů Predikce sekundární struktury chemical shift index statistické srovnání chemických posuvů s random coil hodnotami -1 0 δ(hα) +1 β-sheet random coil α-helix vyhodnocováno pro Hα, Cα, Cβ a C oblast shodných indexů struktura

8 Využití chemických posuvů Predikce dihedrálních úhlů program TALOS statistické srovnání chemických posuvů s databází známých struktur Hα, Cα, Cβ, C a N hodnoty pro 3 rezidua vyhledání homologií předpověď úhlů φ a ψ pro neznámý protein (uprostřed trojice) kalibrace chemických posuvů

9 J-vazba a dihedrální úhel Karplusova rovnice parametrizace srovnáním známých struktur φ [ ] více řešení, kombinace různých 3 J průměrování lokálním pohybem analogické závislosti pro další torzní úhly

10 Výpočet struktury informace o kovalentních vazbách omezení vzdáleností, dihedrálních úhlů,... primární struktura, S-S můstky,... Molekulární dynamika experimentální data zavedena pomocí pseudopotenciálů minimalizace celkové energie simulované žíhání

11 Metodika výpočtu teplota překonávání E bariér kovalentní struktura experimentální omezení volba potenciálů Molekulární dynamika snaha o co nejpřesnější popis pohybu molekul trajektorie E NOE dolní mez horní mez NMR struktury snaha o co nejrychlejší přechod do E minima soubor struktur r kartézské souřadnice prostor dihedrálních úhlů

12 Ukázka postupujícího výpočtu Xplor-NIH: nmr.cit.nih.gov/xplor-nih/ CNS: cns-online.org/v1.3

13 Prezentace struktur soubor průměrná struktura

14 Validace struktury 1. Shoda vypočtených struktur s experimentálními daty velikost počet a velikost porušení experimentálních omezení výskyt sterických kolizí neshody s informacemi o kovalentních vazbách validace proti nepoužitým experimentálním datům 2. Rozptyl struktur v souboru všechny atomy jen rigidní struktury 3. Porovnání strukturních parametrů s již známými proteiny Ramachandranův diagram,...

15 Validace struktury psvs-1_4-dev.nesg.org web-server spojující dostupné testy

16 Zveřejnění výsledků BioMagResBank Protein Data Bank

17 Vodíkové vazby Měření H-D výměna série 15 N, 1 H korelací po přenesení proteinu do D 2 O i i+4 přenos saturace ze signálu vody teplotní závislost signálů pomalá výměna zapojení ve vodíkové vazbě sterická ochrana před solventem info pouze o donorech, nikoli akceptorech lze použít pro zpřesnění struktury a mapování povrchu proteinu (komplexu) J-interakce přes vodíkovou vazbu 0-1 Hz, jasně definovaný donor i akceptor

18 Zbytková dipolární interakce omezení izotropního pohybu molekul Residual Dipolar Coupling DD interakce nezprůměrována k nule H N stejná forma jako J-vazba alignment tensor S Využití zpřesnění struktur nebo jejich validace odhad struktury páteře bez NOE (homologie bez AA) vzájemná orientace domén skládání struktury po částech informace o lokální/segmentální dynamice

19 Zbytková dipolární interakce Metody částečného orientování molekul Stlačený gel ~ 6% polyakrylamidový gel (zesíťovaný) protein diffunduje do suchého gelu natáhnutí gelu do kyvety Bicely, virové částice omezení pohybu většími částicemi Kapalný krystal Anizotropie susceptibility samovolná orientace paramagnetických molekul ve vysokém magnetickém poli

20 Metody měření Zbytková dipolární interakce coupled HSQC izotropní 4.5% bicely 8% bicely IPAP HSQC spin state selective transfer detekuje se nebo

21 Zbytková dipolární interakce Structure of natural products

22 Studium dynamických procesů NMR metody procesy časová škála

23 Blochovy rovnice chování vektoru magnetizace v magnetickém poli (včetně rf pole) precese relaxace B 0 B 0 podélná (spin-mřížková) příčná (spin-spinová) T 1 T 2 obnovení z-ové složky změna energie vymizení x,y složek ztráta koherence

24 interakce s okolím Příčina relaxace fluktuující lokální magnetické pole B loc = B + B přeskoky mezi E hladinami různé Larmorovy frekvence přímá dipól-dipólová interakce anizotropie chemického stínění

25 Pohyb molekuly a relaxace τ c korelační čas spektrální hustota Dipól-dipólová relaxace rychlé malé vysoké pohyby molekuly teploty pomalé velké nízké

26 Inversion recovery Měření T t detekce α-pinene

27 Spinové echo 90 Měření T t/2 t/2 detekce očistí pokles signálu od vlivu nehomogenit statického magnetického pole různé B 0 různé frekvence 180

28 Carr-Purcell x x Měření T x Carr-Purcell-Meiboom-Gill y τ 2 τ 2 τ 2 τ 2 N t = N τ Potlačení vlivu difuze 2N t = 2N τ Potlačení vlivu chyb 180 -pulsů

29 Tvar signálu a T 2 M x (t) = M o * cos( ω eff t ) * e - t / T 2 dlouhá T 2 úzký pík krátká T 2 široký pík

30 Nukleární Overhauserův efekt Relaxace vícejaderných systémů je většinou složitě provázaná krosrelaxace NOE dipól-dipólová I " S interakce 2 autorelaxace (obdoba 1/ ) 6 6 Solomonovy rovnice! " # #! 10 rozdíl obsazení hladin = intenzita signálu # # #! "! I S

31 Nukleární Overhauserův efekt I S I S I S saturace spinů S (vyrovnání populací) pozitivní NOE záleží, který efekt převažuje negativní NOE

32 Řešení Solomonových rovnic! " # #! # # #! "! $ % 2$ $ $ % 2$ $ " $ $ % Identické spiny # 2 $ $ # S relaxuje mnohem rychleji (elektron) # #!!

33 Řešení Solomonových rovnic! " # #! # # #! "! $ % 2$ $ $ % 2$ $ " $ $ % S je saturován RF ozařováním # 0! " S ' ()! 1 * + *, -,+., #!! NOE = nuclear Overhauser enhancement

34 Nukleární Overhauserův efekt Heteronukleární NOE navýšení intenzity signálu uhlíků saturací vodíků až o 199% ovlivnění intenzity signálu dusíků saturací vodíků až o -494% malé molekuly Homonukleární NOE základ řešení prostorové struktury velké molekuly efekt ovlivněn pohybem a relaxačními vlastnostmi příjemce obtížné přesně kvantifikovat

35 1 1 NOESY H - H korelace vyjadřující prostorovou blízkost vytvoření měřitelných koherencí všech spinů koherence na spinu I uložení do osy z (nerovnovážný stav) autorelaxace a krosrelaxace (přenos polarizace DD interakcí) dynamika intenzity krospíku velké molekuly malé molekuly

36 DPFGSE-NOE selektivní excitace přímo viditelné NOE velmi čistá spektra

37 ROESY Rotating-frame NOE z y x gramicidin

38 Selektivní ROE CHES β-cd

39 Využití relaxačních vlastností T 1, heteronukleární NOE, T 2 piko- až nano-sekundová dynamika model-free analýza (Lipari-Szabó) lokální pohyb [ps] H Relaxační mechanismy přímá dipól-dipólová interakce anizotropie chemického posuvu korelační funkce 1 1 hustá síť interací H - H relativně izolované 13C - 1H, 15N - 1H karbonyl C, N v peptidické vazbě spektrální hustota N globální pohyb [ns] relaxační rychlost je lineární kombinací spektrálních hustot při různých frekvencích

40 Využití relaxačních vlastností Dynamika flexibilita proteinové páteře AKeco relaxace páteřních 15 N sada HSQC experimentů vyhodnocování intenzit optimálně měřit ve více magnetických polích calbindin D 9k flexibilní část (neuspořádanost je proteinu vlastní) vazebné místo pro Ca 2+ (stane se rigidní při vazbě vápníku)