Naše NMR spektrometry

Transkript

1 Naše NMR spektrometry Varian NMR System 300 MHz Varian INOVA 400 MHz Bruker Avance III 600 MHz

2 NMR spektrometr magnet průřez supravodičem

3 NMR spektrometr sonda

4 Tvar spektra reálná část imaginární část Lorentzova křivka disperzní signál absorpční signál Fázová korekce matematická operace pro separaci absorpčního signálu Chemical Shift (ppm)

5 Tvar spektra reálná část imaginární část Lorentzova křivka disperzní signál absorpční signál Fázová korekce matematická operace pro separaci absorpčního signálu sfázované spektrum Chemical Shift (ppm)

6 Koherentní středování Signál/šum

7 Stabilita a homogenita magnetického pole Field-frequency lock Shim stabilita v čase homogenita přes vzorek sledování nezávislého jádra - deuterium

8 NMR vzorek Rozpouštědlo - deuterované 1 H 13 C CDCl 3 7,27 77,0 DMSO-d 6 2,50 39,5 D 2 O ~4,8 90% H 2 O + 10% D 2 O ~4,8 MeOD 3,31 49,0 C 6 D 6 7,16 128,0 Množství látky 1-5 mg mg Standardy chemického posunu interní TMS, DSS, dioxan, (CH 3 ) 3 COH externí v kapiláře

9 Heteronukleární J interakce Nepřímá spin-spinová interakce scalar coupling interakce zprostředkovaná vazebnými elektrony jádro cítí spinový stav okolních NMR aktivních jader 13 C H 13 C H 2 13 C H 3 m = -1/2 m = +1/2 dublet triplet kvartet 1 : 1 1 : 2 : 1 1 : 3 : 3 : 1

10 J interakce 13 C 1 H ( 2 H) 13 C spektrum 13 C spektrum CCl 4 rozpouštědlo deuterium má spin 1 CHCl 3 CDCl 3 CH 2 Cl 2 CD 2 Cl 2 CH 3 Cl CD 3 OD

11 Dekapling a 13 C spektrum excitace 90 y detekce 13 C: t D1 1 H: CW nebo WALTZ16 saturace vyrovnání obsazenosti hladin nukleární Overhauserův efekt NOE navýšení (až o 199%) rychlé přeskoky efektivně spin 0 zrušení J interakce závisí na relaxaci - lokální pohyblivosti

12 H 3 C Dekapling a 13 C spektrum O O CH 3 OH

13 APT attached proton test Využití J vazby 90 y 180 x 13 C: t D1 τ τ 1 H: J-vazba aktivní Modulace amplitudy C CH /2J 1/J CH CH 3.5 3

14 APT experiment C, CH H 3 C O O CH, CH 3 CH 3 OH

15 DEPT experiment DEPT distorsionless enhancement by polarization transfer Θ 1 H: t D1 1/2J dec přenos polarizace 13 C: 1/2J 1/2J navýšení signálu uhlíků Intenzita signálů uhlíků ve spektru CH CH 2 CH 3 editace multiplicity dle posledního pulsu

16 DEPT experiment CH a CH 3 kladné CH 2 záporné DEPT nezobrazuje kvartérní uhlíky pouze CH všechny protonované uhlíky

17 DEPT experiment DEPT spektra lze rozdělit podle multiplicity

18 57 C 5 H 9 BrO 2

19 1D příprava Princip 2D experimetů detekce FT 2D příprava vývoj směšování detekce I S I 2D FT contour plot

20 Základní 2D experimenty Homonukleární COSY, NOESY Heteronukleární HSQC, HMQC, HMBC Informace o spojení chemickými vazbami COSY, HSQC, HMQC, HMBC J interakce Informace o blízkosti v prostoru NOESY přímá dipól-dipólová interakce

21 Experiment COSY homonukleární 1 H- 1 H korelace přes obvykle 3 chem. vazby vicinální (geminální, další) symetrické kolem diagonály krospík diagonální pík krospík = existuje J vazba mezi danými vodíky, vidíme jen přímé sousedy

22 Experiment COSY homonukleární 1 H- 1 H korelace přes obvykle 3 chem. vazby 6 5 vicinální (geminální, další) krospík = existuje J vazba mezi danými vodíky, vidíme jen přímé sousedy

23 Experimenty HSQC a HMQC heteronukleární 1 H- 13 C korelace přes jednu chem. vazbu spojení vodík - uhlík 1 1

24 Experimenty HSQC a HMQC heteronukleární 1 H- 13 C korelace přes jednu chem. vazbu přenesení přiřazení z 1 H na 13 C 6

25 Experiment HMBC heteronukleární 1 H- 13 C korelace přes 2 a více chem. vazeb H C C C H H C O C H H O 7 C C C H vodík vidí sousední uhlíky, 1 3 vidí skrz hetero-atomy přiřazení kvarterních 13 C ověření propojení

26 Experiment HMBC heteronukleární 1 H- 13 C korelace přes 2 a více chem. vazeb menthol

27 Experiment NOESY homonukleární 1 H- 1 H korelace přes prostor krospík - - dané vodíky jsou si blízké v prostoru (do cca 5 Angströmů) 13 vidí 12 a 14, nevidí 8 určení prostorového uspořádání

28 NOESY Nukleární Overhauserův efekt Selektivní NOE CHES β-cd dynamika intenzity krospíku velké molekuly malé molekuly základ řešení prostorové struktury

29 Chemická výměna jakýkoli proces při kterém dané jádro mění svůj stav / okolí a NMR charakteristiky k 1 k -1 chemický posun J vazba relaxační čas translační difuze + k 1 k -1 K eq K assoc Intramolekulární (konformační) výměna Intermolekulární výměna tautomerizace konformační rovnováha pohyb postranních řetězců proteinu sbalování proteinů struktura nukleových kyselin vazba ligandu protonace/deprotonace výměna labilních vodíků enzymaticky katalyzované reakce

30 Chemická výměna dimethylformamide k << ν pomalá k π ν = 2 koalescence k >> ν rychlá

31 Chemická výměna Cone inverted cone transformace kalixarenu analýza tvaru spektra inversion rate ~ 1 s -1 at 30 C G ~ 63 kj.mol -1

32 Chemická výměna - titrace Změna chem. posunu s ph rychlá výměna průměrný posun určení pk a Změna chem. posunu s koncentrací β-cd CHES určení disociační konstanty K d

33 Translační difuze DOSY rozdělení směsi podle velikosti molekul

34 Translační difuze komplexy host-hostitel β-cyklodextrin adamantankarboxylová kyselina Difuze v režimu rychlé výměny 1:1 komplex obs ( p) DF pdb D = 1 + Disociační konstanta ( 1 p)( [H] p[g ) [ H][G] = [HG] p 0 ] 0 K d = K d =0.7 mm

35 Dynamické procesy a NMR 1ps 1ns 1µs 1ms 1s 1000s librational dynamics fast rotational diffusion local movement slow ligand binging local folding chemical kinetics global auto- and cross-correlated spin relaxation relaxation dispersion spectral shape residual dipolar couplings translational diffusion signal/saturation transfer real time spectroscopy