Spektrální metody NMR I. opakování

Transkript

1 Spektrální metody NMR I opakování

2 Využití NMR určování chemické struktury přírodní látky, organická syntéza konstituce, konformace, konfigurace ověření čistoty studium dynamických procesů reakční kinetika chemické a strukturní rovnováhy navrhování léčiv drug design Structure-Activity-Relationship určení prostorové struktury peptidy a proteiny oligonukleotidy a DNA, RNA komplexy polysacharidy lékařství zobrazování měkkých tkání anatomie, patologie funkční zobrazování in vivo spektroskopie metabolomika fyzika struktura materiálů potravinářství quality control spektroskopie, zobrazování falšované potraviny (alkohol, džusy, med,...)

3 Jádro hmotnost náboj Vlastnosti jader nukleonové (hmotové) číslo protonové (atomové) číslo magnetický moment spin sudé sudé liché sudé liché nulový 0 celočíselný 1, 2, 3,... poločíselný 1/2, 3/2, 5/2,... I = 0 I = 1 I = 3 I = 1 I = 1/2 I = 3/2 I = 5/2

4 Jaderný spin a magnetický moment jaderný moment hybnosti průmět do libovolné osy je kvantován magnetické kvantové číslo magnetický moment Energie magnetického momentu v magnetickém poli E I = 1/2 m = -1/2 m = +1/2 E I = 1 m = -1 m = 0 m = -1

5 Jádro v magnetickém poli magnetický moment spin (moment hybnosti) Klasický popis B 0 Larmorova precese smysl otáčení

6 Soubor neinteragujících jader Jádra v magnetickém poli Magnetizace = součet magnetických momentů B 0 = 0 B 0 Boltzmanovo rozdělení velikost magnetizace úměrná rozdílu obsazenosti hladin

7 Energie a obsazení hladin Boltzmanovo rozdělení Magnetizace - makroskopická veličina úměrná rozdílu obsazenosti hladin, udává intenzitu NMR signálu NMR je principiálně málo citlivá metoda

8 Základní experiment Pulsní NMR 90 B 0 excitace detekce B 1 radiofrekvenční puls rezonanční podmínka ω = γ RF B 0 Larmorova precese frekvence ovlivněna lokálním magnetickým polem signál volné precese - FID NMR spektrum Fourierova transformace

9 14.1 T NMR frekvence 15 N 2 13 C 31 P 19 F Chemický posun

10 Chemický posun lokální magnetické pole Stínění jádra elektrony Pozměněná rezonanční podmínka E ppm holé jádro jádro v molekule rezonanční frekvence parts per milion

11 NMR spektrum ppm, frekvence stínění elektrony high δ low field downfield paramagnetic shift deshielding low δ high field upfield diamagnetic shift shielding

12 1 chemické posuny Obecný princip: více elektronů kolem jádra = nižší δ

13 13 C chemické posuny Obecný princip: více elektronů kolem jádra = nižší δ

14 Chemický posun a elektronegativita vyšší elektronegativita = vyšší chem. posun (deshielding) C 4 C 3 I C 3 Br C 3 Cl C 3 F Elektronegativita [ppm] C [ppm] pozor na efekt těžkého atomu Obecný princip: více elektronů kolem jádra = nižší δ

15 Chemický posun a rezonanční efekt 7.28, O 6.92, 121 C 3 EDG, +M efekt 160 zvýšená e- hustota v ortho a para pozicích 6.88, , 129 upfield shift O C 3 EWG O C 3 EDG elektron-akceptorní elektron-donorní Obecný princip: více elektronů kolem jádra = nižší δ

16 Chemický posun a anizotropní efekt nesymetrické rozložení elektronů stínící efekt není všude stejný C C + + C C vyšší δ - nižší δ + - C C _ kruhový proud v aromatickém systému

17 Chemický posun a vliv okolních substituentů predikce dle empirických vztahů (Shooleryho pravidla a pod.) experiment (ppm) základ pro C2

18 J vazba Nepřímá spin-spinová interakce scalar coupling interakce zprostředkovaná vazebnými elektrony jádro cítí spinový stav okolních jader ν S ν I ν I ν S příspěvek k energii E J = h J m I m S ν S +J/2 ν I -J/2 ν I +J/2 ν S -J/2 I S I S J J ν S ν I ν S ν I

19 J vazba v 1 spektrech signály jsou štěpeny vodíky, které jsou různé O O stejné vodíky se navzájem neštěpí Štěpení jedním vodíkem dvěma vodíky třemi vodíky m = -1/2 m = +1/2 dublet triplet kvartet 1 : 1 1 : 2 : 1 1 : 3 : 3 : 1

20 J vazba a systém štěpení Štěpení n ekvivalentními vodíky n singlet s 1 1 dublet d triplet t kvartet q pentet p Pascalův trojúhelník J 1 = J 2 J 1 > J 2 J 1 >> J 2 J 1 J 1 J 2 t dd dd

21 J vazba - dosah Geminální 2 J X C Y 5 20 z 0 2 z R C C R Vicinální R R R C C R 3 J 6 8 z bez konformační preference trans cis R R z 7 12 z R R long range přes více vazeb

22 Karplusova křivka závislost 3 J na dihedrálním úhlu

23 Analýza štěpení C 4 7 Cl Určete strukturu a konformaci, zapište spektrum C 3 C 2 Cl 1.58 (d, J=7.5z, 3) 4.00 (d, J=8.5z, 2) 5.45 (dq, J=10.1, 7.5z, 1) 6.29 (dt, J=10.1, 8.5z, 1)

24 Řád spektra ν >> J AX spektrum 1. řádu AB AA pseudo-první řád spektrum vyššího řádu ν = 0 A 2 stříškový efekt

25 I O O Vliv magnetického pole rozdíl chem. posuvů 0.11 ppm J vazba 7 z 600 Mz 300 Mz 120 Mz Mz 30 Mz J vazba velikost štěpení nezávisí na B rozdíl chemických posunů roste s B 0

26 J interakce s jinými jádry 1-19 F R F 2 J F = z 3 J F = 3-25 z F 3 J F = 6-10 z 4 J F = 5-6 z orto meta 4 J F = 0-4 z 5 J F 2 z para 1-31 P 1-13 C 1 J P CCl J P 2 J P 208 z

27 Spinový systém úplná množina NMR aktivních jader, ve které jsou členové provázáni J-interakcemi C 2 C 2 C 3 3 C O C2 O 2 C C 3 N C N C 3 O

28 Chemická ekvivalence Jádra jsou chemicky ekvivalentní, pokud existuje operace symetrie, která je na sebe převádí C 3 vodíky jsou ekvivalentní díky rychlé rotaci Chemicky ekvivalentní jádra mají stejný chemický posun D D Ph Ph Ph Ph Ph Ph vodíky jsou homotopické

29 Chemická ekvivalence Ph C 3 D Ph C 3 D Ph C 3 vodíky jsou enantiotopické jsou chemicky ekvivalentní Ph 2 N O O D Ph 2 N O O Ph 2 N D O O vodíky jsou diastereotopické nejsou chemicky ekvivalentní různé chemické posuny

30 Magnetická ekvivalence Jádra jsou magneticky ekvivalentní, pokud a zároveň jsou chemicky ekvivalentní mají stejné geometrické postavení k ostatním NMR aktivním jádrům (mají s nimi stejnou J vazbu) Cl Cl Cl C 3 C 3 mezi magneticky ekvivalentními jádry se ve spektru neprojevuje J vazba spektra chemicky ekvivalentních a magneticky neekvivalentních jader nelze analyzovat dle pravidel 1. řádu

31 Informace v 1 spektrech Počet signálů Chemický posun Intenzita signálů Systém štěpení O 3 C O C

32 13 C spektrum a dekapling C O O 13 C: excitace detekce C 3 O 1 : CW nebo WALTZ saturace nukleární Overhauserův efekt rychlé přeskoky efektivně nulový spin Počet signálů Chemický posun NE kvantitativní kvůli NOE a obvykle nedostatečné relaxaci kvartérních uhlíků

33 Multiplicita uhlíkových signálů = rozlišení uhlíků podle úpočtu navázaných vodíků Spektrum bez 1 dekaplingu (nebo off-resonance) 3 C O O C, C 2 C 3 O APT experiment C, C 3!!! C, C 3 DEPT experiment C 2

34 NMR spektrometr supravodivý magnet konzole s rf elektronikou řídící počítač

35 NMR spektrometr schema RF syntetizátor brána zesilovač duplexer sonda programátor pulsní sekvence zesilovač přijímač/ mixer ADC kvadraturní detekce rozlišení znaménka precese (komplexní FID) počítač

36 Digitální detekce a spektrum Nyquistovo kritérium Spektrální rozlišení spektrální šířka Počet bodů Akviziční doba spektrální šířka offset pulsu reálná část imaginární část Lorentzova křivka disperzní signál absorpční signál Fázová korekce optimalizace tvaru spektra do absorpčního signálu

37 Stabilita a homogenita magnetického pole Field-frequency lock stabilita v čase sledování nezávislého jádra - deuterium Shim homogenita přes vzorek NMR vzorek Rozpouštědlo - deuterované Standardy chemického posunu TMS, DSS Koherentní středování

38 NMR relaxace B 0 B 0 T T 1 podélná (spin-mřížková) 2 obnovení z-ové složky změna energie prodleva mezi měřeními T 1 T 2 příčná (spin-spinová) vymizení x,y složek ztráta koherence šířka čáry inversion recovery: 180-t-90-acq spinové echo: 90-t/2-180-t/2-acq Příčina - interakce s okolím fluktuující lokální magnetické pole B loc = B + B přímá dipól-dipólová interakce anizotropie chemického stínění přeskoky mezi E hladinami různé Larmorovy frekvence

39 Interpretace NMR relaxací přímá dipól-dipólová interakce anizotropie chemického stínění pohyb molekul + = nebo jejich částí fluktuující lokální magnetické pole a relaxace model-free analýza (Lipari-Szabó) lokální pohyb [ps] C rychlé malé vysoké pohyby molekuly teploty pomalé velké nízké globální pohyb [ns]

40 Dynamické procesy Chemická reakce sledování in situ, změny spektra v čase jak reakce probíhá Chemická výměna jakýkoli proces při kterém dané jádro mění svůj stav / okolí a NMR charakteristiky k 1 k -1 chemický posun J vazba relaxační čas translační difuze + k 1 k -1 K eq K assoc Intramolekulární (konformační) výměna Intermolekulární výměna Translační difuze pomocí NMR lze stanovit difuzní koeficient a tak i efektivní velikost molekul experiment DOSY rozdělení spekter směsi podle velikosti molekul

41 Chemická výměna dimethylformamide k << ν pomalá k π ν = 2 koalescence k >> ν rychlá vážený průměr chemických posunů analýza tvaru spektra titrační experiment

42 2D příprava 2D NMR spektroskopie vývoj detekce směšování 2D FT contour plot Korelace homonukleární COSY, NOESY heteronukleární SQC, MQC, MBC po chemických vazbách COSY, SQC, MQC, MBC přes prostor NOESY

43 COSY 2D NMR spektroskopie homonukleární 1-1 korelace přes obvykle 3 chem. vazby SQC a MQC korelační pík se objeví pokud existuje J-interakce mezi danými vodíky přiřazení vodíkových signálů heteronukleární 1-13 C korelace přes jednu chem. vazbu založeno na 1 J C okolo 140 z přiřazení uhlíků nesoucích vodík MBC heteronukleární 1-13 C korelace přes 2 a více vazeb založeno na 2,3 J C okolo 8 z přiřazení kvartetních uhlíků, spojení fragmentů NOESY homonukleární 1-1 korelace přes prostor korelační pík pro vodíky vzdálené do 5 Å založeno na přímé dipól-dipólové interakci NOE určení prostorové struktury

44 Řešení NMR spektra Postup identifikovat signály, jejich počet, pozici a intenzitu rozdělit vodíky do skupin analyzovat jemné štěpení, identifikovat jaké skupiny budou vedle sebe dokončit identifikaci funkčních skupin s přihlédnutím k chem. posunům a dalším informacím ( 13 C spektrum, APT/DEPT) spojit funkční skupiny do molekuly znovu ověřit, zda molekula odpovídá spektru

45 C 3 6 O 2 dublet (1 navázaný vodík) C -C=O O posun typický pro karboxyl (zřejmě NE aldehyd, ten bývá okolo 190ppm) triplet (2 navázané vodíky) C 2 O posun typický pro uhlík s kyslíkem kvartet (3 navázané vodíky) C 3 kvartet dubletů (štěpení od 3 vodíků + 1 další) triplet (štěpení od 2 vodíků) 3 C O O zřejmě C malé J přes 4 vazby C 2 O C 3 1 zřejmě J vazba 2 J vazba = sousední skupiny 3 typický posun methylu posun typický pro vodík vedle kyslíku

46 Písemná zkouška 2x řešení spektra 2 x 15 bodů 4 otázky 4 x 5 bodů Celkem 50 bodů odnocení spekter analýza integrace 1 bod analýza štěpení 5 bodů identifikace funkčních skupin 5 bodů konečné řešení a jeho vysvětlení 4 body Celkem 15 Celkové hodnocení X < 30