Laboratorní diagnostika v klinické imunologii Indikace a interpretace testů

Transkript

1 Laboratorní diagnostika v klinické imunologii Indikace a interpretace testů

2 Použití laboratorních testů principy laboratorní diagnostiky Diagnóza: suspektní nemoc na podkladě klinického nálezu a/nebo anamnézy Screening: Neznámý stav nemoci bez klinického podezření Prognóza: Přítomnost nemoci je známa ale není znám rozsah Monitoring: Přítomnost nemoci známa, ale aktivita nemoci známa není

3 Principy interpretace laboratorních dat Referenční interval = normální rozmezí jak je referenční interval definován? 95 % interval spolehlivosti Průměr +- směrodatná odchylka percentily Jsou nezbytná specifická data pro věk/pohlaví/rasu? Porovnání dat získaných v různých laboratořích nebo použitím různých metod musí být velmi opatrné Rozdělení negativní-pozitivní je relativní rozhodnutí

4 Laboratorní metody Senzitivita metody - proporce nemocných s pozitivním výsledkem Specificita metody - nemocných s negativním výsledkem Kvantitativní analýzy Kvalitativní analýzy Kontrola kvality nejistota laboratorního měření

5 Metody detekce imunitních proteinů Elektroforéza: Separace použitím elektrického pole Aglutinace: síť Ag a Ab (např. Coombs test, RF latex aglutinace) Imunoprecipitace: Ouchterlony (kvalitativní), radiální imunodifuse (kvantitativní) Nefelometrie: Imunoprecipitace v roztoku způsobuje rozptyl světla na agregátech Imunoesej: V současnosti nejvíce rozšířené systémy s pevnou fází Molekulární a genová diagnostika

6 Serologické testy rozlišující Negativní- Pozitivní ANA pozitivní/negativní je určeno užitím zdravých dárců a stanovení titru, který vylučuje 95 % těchto osob. Toto je důvodem, proč některé laboratoře nazývají výsledek 1 : 40 pozitivní a jiní negativní Výsledek antivirových protilátek je označován jako séropozitivní nebo séronegativní. Základ tohoto rozdělení je na základě předpokladu, že séropozitivní výsledek je spojen s kontaktem a/nebo vysokou pravděpodobností ochrany

7 Serologické testy rozlišující Negativní-Pozitivní Mnoho testů má biologicky falešně pozitivní výsledky RRR test u autoimunitních chorob RF u infekčních chorob Některé testy pozitivní u normálních osob ve zvýšené míře spojené s věkem nebo pohlavím ANA+ roste s věkem, ženy > muži Monoklonální Ig více se stoupajícím věkem

8 Kvantitativní stanovení imunoglobulinů Hladina reprezentuje síť tvorby, užití, katabolismu a ztrát imunoglobulinu Musí být posuzovány v kontextu věkově specifického rozmezí (pohlaví/rasové rozdíly jsou méně důležité) Měří polyklonální produkci a nejsou ekvivalentní hodnocení odpovědi specifické pro antigen IgG podtřídy mají omezené užití, nejvíce v souvislosti s IgA deficiencí

9 Elektroforéza plazmatických proteinů

10 Nefelometrie Tvorba komplexů Ag Ab, větších než vlnová délka působícího světla

11 Kvantitativní změny sérových proteinů - patologické změny, diagnostický význam IgG zvýš.- jaterní onemocnění(cah, Ci), chronická infekce (osteomyelitis, subak.b.endokarditis, IM, toxo), IgG myelom, lymfom, systémové onem., chron.zánětlivé onem. (sarkoidoza, Crohn,col.ulc.) sníž.- Ig deficience, ztráty Ig IgA zvýš.- jaterní cirhosa, alkoholu, chron.infekce, IgA myelom sníž.- humorální ID, získaná IgM zvýš.- ak. hepatitis, infekce, IgM myelom, (PBC) sníž.- deficience Ig - získaná, hereditární IgE zvýš.- alergie, parazitární choroby, IgE myelom, hyper IgE syndrom, malig.tu, AIDS, Wiskot-Aldrich, Nezelof sy. sníž.- hereditární deficience, ataxia teleangiectasia

12 Testy komplementu C1 C4 C2 C3 C5 C6 C7 C8 C9 B D P test C3, C4 je nejužitečnější snížení hladiny C je významnější než zvýšení - složky C působí jako reaktanty akutní fáze sériové monitorování C3, C4 je užitečné při monitorování chorob (SLE, GN, vaskulitidy) Funkční test - CH50, AH50 jsou vhodné pro testy vrozených defektů

13 Interpretace změn komplementu C3 sníž. aktivace klasické cesty - SLE, vaskulitis klasická+alt. - G- bakteriemie, někdy SLE alternativní - C3 NeF faktor C4 sníž. -aktivace klasické cesty - SLE, vaskulitis klasická+alt. - G- bakteriemie, někdy SLE poškoz. jaterního parenchymu klasická - jen C4, C2 - deficience C1 Inakt. Zvýšení C3, C4 - akutní a chronický zánět

14 Mechanizmy vzniku Hereditárního angioedému Deficit C2 Inaktivátoru C1 esterase inhibitor prevents autoactivation of complement component C1, thus keeping the classic complement pathway quiescent. MAC indicates membrane attack complex. C1 esterase inhibitor inactivates factors XIIa and XIIf, plasmin, and kallikrein, thus preventing bradykinin production.

15 Autoprotilátky Substrát + sérum Nepřímá fluorescence (IFA) ELISA, RIA imunodifuse western blott CIE

16 Typ fluorescence na Hep-2 buňkách, jednotlivé protilátky a asociované onemocnění Typ ANA Onemocnění Homogenní anti-histon SLE, RA, DI-SLE, JCA anti-dsdna SLE Periferní anti-dsdna SLE anti-laminin SLE Zrnitý anti-u1 RNP MCTD, SLE anti-sm SLE anti-la SS, SLE, vzácně RA anti -Ro SS, SLE, neonatální lupus, řídce RA anti-pcna/cyklin SLE anti-ku SLE, PSS/DM anti-scl-70 PSS

17 Anti-dsDNA vyšetření protilátek proti NATIVNÍ DVOUVLÁKNOVÉ DNA nepřímá imunofluorescence na substrátu obsahující čistou, natívní dsdna

18 ANCA Anti Neutrophil Cytoplasma Antibodies Nepřímá imunofluorescence Protilátky proti cytoplazmě neutrofilů: p-anca (fluorescence perinukleární) c-anca (fluorescence cytoplazmatická) atypická vyšetření se indikuje při podezření na vaskulitidu

19 ANCA cytoplazmatický typ c-anca

20 ANCA perinukleární typ p-anca

21 Klinický význam dalších autoprotilátek Protilátka Autoantigen Choroba Thyreoidní mikrozomální Ab T. peroxidáza AI thyreoiditis Mitochondriální (M2) Ab Komplex pyruvát dehyd. M2 PBC Bazální membrána glomerulů - Ab Kolagen IV, C term Goodpasture s GN - anti GBM Ab - cytoplazma neutrofilů c ANCA Proteináza 3 Wegenerova gran. p ANCA Myeloperoxidáza Mikroskop polyarteritis, vaskulitidy Ab - dvojšrobovice DNA ds DNA Aktivní SLE Antifosfolipidové protilátky Kardiolipin APLA, SLE

22 Charakterizace imunitních buněk Stanovení buněčných populací a subpopulací pomocí průkazu membránových znaků Funkční testování tradičně představuje testy proliferace buněk, buňkami zprostředované cytotoxicity a tvorbu solubilních produktů Interpretace in vitro studií imunitních buněk je obtížná Studie jsou nejužitečnější, pokud jsou provedeny společně s řadou testů s různými stimuly Relativní citlivost proliferačních testů k dysfunkci je : mitogen<alloantigen<specifický antigen Význam testů NK buněk je stále nejasný

23 Prinicip průtokové cytometrie velikost FS Mo Gr Fluidní část Optická část Elektronická část Ly granularita SS

24 Průtoková cytometrie Mnohoparametrový soubor dat o individuálních buňkách získávaný rychlostí buněk / sec Exprese membránových znaků - imunofenotypizace Měření intracelulárních charakteristik - oxidativní vzplanutí, fosforylace proteinů, cytoplazmatická produkce cytokinů, buněčného cyklu

25 Aplikace FC v diagnostické imunologii Nepřítomnost specifického typu buněk: SCID, XLA Nepřítomnost specifického membránového proteinu - X váz. Hyper IgM, LAD Snížení buněčného typu: CD4 u HIV Zvýšení specifického typu: dvojitě negativní T lymfo (ALPS) Přítomnost specifického buněčného proteinu: CD34 na kmenových buňkách

26 Funkční testy lymfocytů Stimulus Způsob aktivace Předchozí exp. Antigen(PPD) TcR Specifické ano Lektin (PHA, ConA) Nespecifická ne Monoklonální TCR/CD3 Nespecifická ne protilátka (a-cd3) PMA Aktivační cesta Ca ionofor za TCR/CD3 Nespecif. ne

27 Testy neutrofilů a monocytů Funkce Test Pozn. Adheze Exprese CD11b/CD18 LAD Migrace Chemotaxe Agarozové metody Časté sekundární poruchy (inf., popáleniny) Fagocytóza Candida alb. Sachar.c. Detekce sér. defektů opsonizace Metabolické NBT, INT vzplanutí Chemiluminiscence CGD Baktericidní testy sekundární p.

28 HIV virus

29 HIV infekce a AIDS

30 Cíle diagnostiky alergického onemocnění Detekce rizikových jedinců IgE pupečník Detekce genů atopie Prognóza alergie Anti IgE Th1/Th2 lymfo Anti IgE podtřídy Detekce senzibilizovaných IgE celk, specifické Kožní testy Užití rekombinantních jedinců alergenů HRT, slt alergenových fragmentů Test expozice alergenů Test hladiny alergenů v prostředí Detekce alergenů v biologickém materiálu, v IK s IgE,IgG Test závažnosti choroby Eosinofilie Histamin, ECP, MBP, EPO, Určení buněk aktivovaných cytokiny, další mediátory slt, tryptáza v tělesných tekutinách Monitorování efektu terapie Kožní testy(omezeně) Přepnutí Th1/Th2 Specifické IgG Produkce cytokinů HRT, slt RNA pro cytokiny Aktivace bazofilů

31 Současné možnosti diagnostiky atopie IgE specifické pro alergen - průkaz cirkulující protilátky Kožní test alergenem - kožní pupen způsobený uvolněnými mediátory senzibilizovaných mastocytů Vzájemně se doplňující metody Plné zdraví Senzibilizace Alergická choroba

32 Stanovení celkového IgE Význam hodnot v pupečníkové krvi zpochybněn Screening alergických onemocnění, predikce choroby Sledování pacientů s ABPA Vrozené imunodeficience HIV, IgE myelom, GVH, poléková intesticiální nefritis,

33 Stanovení IgE specifického pro alergen Neměří opravdovou biologickou odpověď Vysoké celkové IgE může způsobit falešně pozitivní výsledek Odlišné testovací systémy mohou být jen obtížně porovnávány Ne všechny laboratoře poskytují ekvivalentní data

34 Další testy alergické reakce Test uvolnění histaminu - vliv nízkomolekulárních látek (RANTES, MIP-1 alfa, MIP-1 beta) Tryptáza - znak degranulace mastocytů, přínosný v diferenciální diagnóze anafylaxe Delší poločas než histamin (maximum za 1 hodinu, zvýšeno několik hodin). Komerčně dostupné vyšetření Eosinofilní kationický protein Nutné separovat sérum do 2 hodin, zpdracovat či zamrazit!!