Termíny zkoušek. ší šířenší

Transkript

1 Termíny zkoušek Termíny zápočtu: 3. dubna 6 h, A II (výsledky: 8.4.) 20. dubna 7 h, A II (výsledky: 22.4.) 27. dubna 7 h, A II (výsledky: 2.5. Poslední přednáška: 8. května 5-7 h, A II Termíny zkoušky: 25. května 5-7 h, A II (výsledky:.6.). června 5-7 h, A II (výsledky: 6.6.) 6. června 2-7 h, A0 (ústní zkouška) Opravný termín zkoušky: v týdnu od června individuálně v Zentivě

2 Hlavní chyby a závady v zápočtovém testu. bioekvivalenční studie pouze tři ji zmínili vztah k patentové ochraně 2. kauzální léčba; rychlejší vývoj problémy s biogeneriky zmíněno pouze 2x 3. více závadných než správných odpovědí (slepá a dvojslepá studie?) chyběly hlavní činnosti (např. srovnávací studie) 4. studium patologických procesů na mol. úrovni nikdo!! 5. téměř všichni uváděli jako příklad levodopu (gabapentin enakarbil, clopidogrel, roflumilast, fospropofol) 6. p jako počet parametrů! 7. často poloviční správná odpověď jedno lze z druhého odvodit 8. chybělo zdůvodnění in vitro a in vivo 9. neuváděny hydrofobní interakce, naopak uváděny elektrostatické interakce (patří do nich kovalentní a iontové vazby)

3 Doplňky z IX. lekce

4 Použití chromatografických veličin: a) ke stanov neznámých log P b) přímo jako parametrů lipofility V. případě nezbytný požadavek: lineární vztah mezi chromatografickou veličinou a log P prokázán na různých stacionárních fázích v TLC i HPLC statist.významnost stoupá se strukturní podobností serie látek (platí požadavky pro Colanderovu rovnici) Příklady: R TLC: stacionární fáze silikagel impregnovaný silikonovým olejem mobilní fáze pufr (ph 4.) / 50 % acetonu skořicové kyseliny: n r s F log P = R M aryloctové kyseliny: log P = 2.85 R M benzoové kyseliny: log P = 3.37 R M Celá série: n = 24, r =0.984, s = 0.099, F = 685 Y O OH

5 Speciální úpravy: vysoká přesnost stanov log P (neutrálních látek) a log D (bazických látek): Lombardo F. et al. J. Med. Chem. 2000, 43, 2922; 200, 44, stacionární fáze: bazicky deaktivovaný Supelcosil LC-ABZ - mobilní fáze: methanol/pufr % n-oktanolu - standardizována - srovnání s běžným ODS silikagelem Neutrální látky: log P =.089 ( 0.097) log k w ( 0.277) () log P =.0 ( 0.039) log k w ( 0.094) (2) Neutrální a bazické látky: log D =.27 ( 0.023) log k w ( 0.043) (3) Výhody proti exper.stanov log P: Nevýhody: - malé množství látky strukturní podobnost - rychlost stanov závislost na exp.podmínkách - nízká citlivost k nečistotám obtížná standardizace - velké rozmezí lipofility (cca 6 log P jednotek) - vysoká přesnost - velmi dobrá reprodukovatelnost - n nutná kvantitativní analytická metoda

6 2. Přímé použití chromatogr.veličin jako parametrů lipofility Řada monografií shrnuje výsledky využití chromatogr.veličin: Kaliszan R. Quantitative Structure-Chromatographic Retention Relationships, Wiley, New York 987. Kuchař M., Rejholec V. Využití kvantitativních vztahů mezi strukturou a biologickou aktivitou, Academia, Praha 987. Valko K. v: Separation Methods in Drug Synthesis and Purification (Valko K, ed.) Elsevier, Amsterdam 2000, str Příklady: Antiagregační účinnost aryloxoalkanových kyselin: X n r s F log (/C) = log P (log P) I L E S () log (/C) = R M -.25 R M I L E S (2) O Q O OH

7 Moderní chromatografické metody v hodnoc lipofility Chromatografie na imobilizovaných umělých membránách (IAM) Struktura membrány (mozaikový model): fosfolipidová dvojvrstva orientace fosfolipidů, uhlovodíkové řetězce dovnitř; nejrozšířenější: fosfatidylcholin (zwitterion N +, PO 4-3 ) + póry naplněné vodou - rozdíly proti n-oktanolu: membrány jsou anisotropní Důležité při průchodu ionizujících látek (prostorová orientace fosfolipidů) elektricky nabité (současná léčiva: 63 % ionizujících 4.5 % kyselin 67.6 % bazí 7.9 % amfolytů)

8 IAM stacionární fáze: silikagel s vázaným n-propylaminem, na němž je přes řetězec dikarboxylové kyseliny vázán glycerofosfatidylcholin (PC) O O O O O O P O O N + k povrchu silikagelu endcapping NH 2 skupin a) HO-propinovou kyselinou - IAMPC-MG b) C 3 a C 0 kyselinou - IAMPC-DD2 a) IAMPC.MG endcapping volných aminoskupin HO-propionovou kyselinou b) IAMPC.DD2 - endcapping C3 a C0 kyselinou c) IAMPC.DD - bez glycerin.můstku, endcapping C 3 a C 0 kyselinou - mobilní fáze: voda, popř. jako modifikátor acetonitril, methanol nevhodný (methanolýza) obvykle extrapolace na nulovou koncentraci log k w

9 Vztahy mezi IAM kolonami: MG (přes HO-propionovou kyselinu) nejméně lipofilní, DD (C 0 dikarboxylová kys.) nejlipofilnější Mezi MG a DD2 (obě s glycerinovým můstkem) velmi dobrá korelace Příklad: log k (DD2) = ( 0.063) log k (MG) ( 0.069) Mezi MG a DD (chybí glycerin.můstek) pouze pro nepolární látky b-adrenolytika: Vztahy k log P, log D, resp. log k z HPLC: log D = ( 0.206) log k IAMw.560 ( 0.23) () log k C8 =.869 ( 0.287) log k IAMw.27 ( 0.79) (2)

10 Speciální stacionární fáze - bazicky deaktivované, vhodné pro organické báze nevyžadují přídavek maskovacích aminů (Supelcosil ABZ +, Zorbax Extend C 8 ) - viz Lombardo et al. - vysoká korelace s log P (standardizována) možnost zvýšit ph až na.5 - mobilní fáze: voda + acetonitril, methanol Stella C. et al. J. Sep. Sci 2002, 25, 35 - monolitické kolony (silikagel, polystyren, polymetakryláty) porézní vhodné pro separaci peptidů log k = f (log P, log VdW) k predikci retenčních časů peptidů - mobilní fáze: voda + acetonitril + 0. % kys.trifluoroctové Baczak T. et al. J. Proteome Res. 2005, 4, micelární kapalinová chromatografie (MLC) speciální typ konvenční RP HPLC, - mobilní fáze: roztok povrchově aktivní látky (anion, kation, neutrální) nad její CMC Na taurocholát, Na-deoxycholát, Na-dodecylsulfát - mechanismus separace: dvě rozdělovací rovnováhy vodná fáze vs. micely a vodná fáze vs. C 8 stacionární fáze Fuquet E et al. J. Chromatogr. A 2002, 942, 237.

11 Shrnutí - log k z imobilizovaných umělý membrán mohou často lépe vystihovat rozdělovací rovnováhu v přirozeném biologickém systému než log k z HPLC či R M hodnoty z TLC - vhodnost log P (log D) ve srovnání s log k z IAM zřejmě závisí na charakteru biologického systému - lineární vztahy k log P jsou obvykle statisticky významné - vývoj nových chromatografických systémů využitelných pro hodnoc lipofility stále pokračuje

12 LEKCE 0 stérické parametry: empirické z velikosti molekul z prostorových obrysů topologie molekul: konektivita, indexy konektivity výpočty indexů konektivity indexy konektivity a rozvětv, substituce na aromatickém jádře vztahy k fyz.chem. veličinám (k lipofilitě) v biologických korelacích index flexibility

13 Stérické parametry a) Empirické: Taft: E S = log (k X /k H ) () k X, k H rychlostní konstanty kyselé hydrolýzy esterů RCOOR (R je proměnné) definičně: E S (CH 3 ) = 0 popř..24 E S (H) =.24 (nejvyšší) 0 při stérické zábraně pozitivní závislost na E S (Součást širšího řeš stérických a polárních konstant v alifat.sloučeninách) Korigované hodnoty E S : (kyselá hydrolýza n ovlivněna jen stérickým efektem) Hancock korekce na hyperkonjugační efekt: E Sc = E S (n - 3) (2) n. počet atomů H na a-c atomu (pro ethyl: E S ) Pal m rozšířený hyperkonjugační efekt: E So = E Sc n C (3) n C.. počet C atomů na a-c atomu (pro ethyl: E S ) Unger korekce na induktivní a mesomerní efekt u CH 2 X: E So = E Sc +.07 F X +.05 R X (4) F X, R X.Swain-Luptonovy konstanty (pro ethyl: E S )

14 b) Stérické parametry odvozené z velikosti molekuly: E S lze stanovit jen pro některé substituenty hledány jiné možnosti Pro 6 symetrických substituentů: r v.. van der Waalsův poloměr Charton (97): r vh van der Waalsův poloměr vodíku Problémy: - různé stanov různé hodnoty - polyatomické substituenty Příklad použití: E S = r v () n = r vx - r vh = r vx.20 (2) Antibakteriální účinnost substituovaných salicylaldehydů log (/C) = (n 3 + n 6 ) Ss (3)

15 Molekulární refrakce jako stérický parametr: MR = [(n 2 ) / (n 2 + 2)]. MH/d Příklad: Antibakteriální účinnost sulfonamidopyridazinů H 2 N O S O N H log (/MIC) = ( 0.047) MR o ( 0.034) MR m ( 0.037) MR p ( 0.36) n = 6, r = 0.937, s = 0.24, F = 29. () Gasco A., Koch A., Seydel J.K. v: QSAR Rational Design of Bioactive Compounds (Silipo, Vittorio, Eds.), str. 335, Elsevier 99. Použití MR podobně jako parachoru, molárního objemu, indexů konektivity nemusí obecně odpovídat stérické zábraně (viz lipofilita, sestupná část nelineární závislosti) N N X

16 c) Stérické parametry odvozené z molekulových obrysů: - odpovídají komplexní interakci aktivní substance (resp. substituentu) s biomakromolekulou charakterizují substituent několika parametry v různých směrech Verloop a spol. (976): 5 substituentových konstant L, B B 4 L délka substituentu ve směru vazby substituentu se základní strukturou B B 4.. šířky substituentu od středu ve čtyřech směrech ve dvou na sebe kolmých osách L, B +B 4 a B 2 +B 3. strany obalového kvádru Výpočet program STERIMOL (vazebné úhly, délky, VdW poloměry, optimalizované konformace); tabelovány Statistická nevýhoda pro jeden substituent pět parametrů nepoužívány všechny najednou

17 Verloopovy stérické parametry STERIMOL

18 Příklady: mikrosomální hydroxylace subst. anilinů X log A = 0.27 log P E S () po zahrnutí m-methoxy derivátu: log A = 0.45 log P E S (2) použití Sterimol konstant: log A = 0.44 log P 0.33 L (3) log A = 0.3 log P 0.54 B (4) Závěr: nevhodná hodnota E S pro m-meo Verloop A. et al. V: Drug Design (Ariens E.J., ed.), str. 65, Academic Press, N.Y NH 2

19 potenciace tryptaminu u myší aminoethyloximy subst. 9-fluorenonů N O log (/ED 50 ) = p E S () log (/ED 50 ) = p B (2) NH 2

20 Topologie molekul Topologie molekuly: uvažuje pouze vazby mezi atomy a jejich vzájemné uspořádání bez ohledu na stérické poměry v molekule Poskytuje číselné vyjádř struktury rozliš některých strukturních změn: rozvětv, násobné vazby, přítomnost kruhu Založena na teorii grafů struktura jako graf: atomy body (vertices) vazby. hrany (edges) vyjádřeny formou topologické matice speciálním algoritmem transformace do číselného parametru Wienerův index výpočet dle Altenburgova polynomu: w = S n i.d i () n i.. počet kombinací atomů oddělených d i vazbami Příklad: w = 6x + 7x2 + 5x3 + 2x4 = 43 (2) rozlišovací schopnost: mezi isomérními látkami

21 t.v. uhlovodíků C 2 až C 7 : t.v. =.523 w () Pokrok v rozlišovacích schopnostech: Randič index konektivity (975) - jako kriterium rozvětv Výpočet indexu konektivity. řádu (atomy na jedné vazbě): a) vytvořit graf (strukturní vzorec) bez vodíkových atomů b) každý atom charakterizovat atomovou konektivitou d i (tj. počet vazeb vycházejících z atomu) c) každou vazbu popsat vazebnou konektivitou c k (výpočty indexů různého řádu se v tomto bodě liší) převrácená odmocnina součinu atom.konektivit d) index konektivity jako součet vazebných konektivit c k = (d i.d j ) -/2 (2) χ = S c k = S (d i.d j ) -/2 (3)

22 Příklad výpočtu (2,3-dimethylpentan): - ve vazebné konektivitě uvažujeme jednu vazbu. řád redukovaný graf Výpočet vazebných konektivit a indexu konektivity: atomové konektivity vazebné konektivity c k = (d i. d j ) -/2 např.: c k = (3x2) -/2 = /2.449 = () χ = 3x = 3.80 (2)

23 nejnižší řád: nulový - 0 χ.. uvažovány pouze atomy 0 χ = S d i -/2 () Příklad: 4 x / + 2 x / 3 + / 2 = = (2) Odvozeny další indexy: podle počtu uvažovaných vazeb (ve vaebné konektivitě) řád indexu podle charakteru spoj (lineární, rozvětvené) typ indexu - lineární: P (path) - rozvětvený: C (cluster) - lineární a rozvětvený: PC 3 3 2

24 Typy indexů konektivity (a odpovídajících subgrafů):,rád 2.rád 3.rád 4.rád 5.rád P P P P P (označ: 4. řád PC (path and cluster): 4 χ PC ) C C PC PC PC

25 Valenční hodnoty (atomové konektivity) d v pro heteroatomy: d v = Zv h Z v počet valenčních elektronů h počet vázaných atomů H Po případě empirické hodnoty heteroatom d v heteroatom d v NH 2 3 OH 5 NH (včetně imino) 4 O (ether, keton) 6 N (včetně subst,imino S (ether, oxid) b a nitrilu) 5 S (sulfonyl) 3.58 b N + (rovněž v nitro) 6 a Cl 0.69 a Br a I a a,b empirické hodnoty z mol. refrakcí ověřeny v korelaci b.v. alkylhalogenidů a

26 Příklad: indexy konektivity 2,2-dimethylpropanolu: 4 0 χ v = 3x / + / 2 + / 4 + / 5 = = χ v P = 3x / x/ / = = χ v P = 3x / = χ v P.. n přítomen 4 χ v C = / = = 3x / = χ v PC (Úloha: dopočítat χ v ) 2 5 OH

27 Indexy konektivity nenasycených sloučenin Příklad 2-methyl-,3-butadien: dvě možnosti: a) vazebný příspěvek dvojné vazby uvažován jednou b) uvažován jako dvě hrany grafu Převládl model a) jednodušší a b) nezlepšuje korelace s fyz.chem. veličinami χ = / /.4 + / / 3.2 = =.550 2

28 Cl Indexy konektivity aromatických sloučenin: možnost rozliš polohových isomérů O O OH Substituent 0 χ v χ v 2 χ v 3 χ v 4-Cl Cl Cl CH 3 O CH 3 O CH 3 O O 4 5 OH

29 Indexy konektivity a fyzikálně chemické vlastnosti - vysoká korelace především v seriích strukturně podobných látek Vlastnost Typ látek Index konektivity n r s mol.povrch alkany a alkoholy χ v parametry E S alkyly χ χ, 3 χ, 4 χ body varu alkany χ χ, χ PC MR alkoholy χ v MR různé alifat.sloučeniny χ, χ v rozpustnost alkoholy χ ve vodě

30 Vlastnost Typ látek Index konektivity n r s log P alkany χ alkoholy alkoholy, ethery,estery, χ ketony, aminy RP HPLC N-alkylbenzamidy 5 χ v P, 6 χ v P GLC alkeny, alkiny χ alkoholy χ v χ, χ v

31 Indexy konektivity a biologické účinnosti obvykle v korelacích nespecifických vztahů struktury a účinnosti (narkotická, neurotoxická, fungicidní, baktericidní úč.) obvykle simuluje lineární nebo nelineární závislost na lipofilitě Účinnost Typ látek Index konektivity n r s lokálně anest. halogen.uhlovodíky χ v χ v, Q H a lokálně anest. alifatické ethery χ v, ( χ v ) narkotická estery, alkoholy,ketony, χ v aminy antifungální alkoholy, estery χ v antimikrobiální alkylbromfenoly χ v toxicita arylfosfáty s, χ v

32 Výhoda postačí papír a tužka komerčně dostupné výpočetní programy Nevýhody nedostatečná fyzikálně chemická interpretace (atomové konektivity d mají vztah k objemu atomových fragmentů i k elektronegativitě atomů v různých valenčních stavech) - vysoká interkorelace mezi χ různého řádu Příklad: antimikrobiální účinnost arylakanových kyselin log (/C) = log P (log P) () log P opt = 3.90 log (/C) = χ Pv χ Pv (2)

33 Index flexibility F - kvantifikuje schopnost existence v různých konformacích uvažuje následující vlivy na flexibilitu molekuly: a) klesající počet atomů b) přítomnost cyklů c) přítomnost rozvětv d) přítomnost atomů o menším poloměru než sp 3 C atom

34 Příklad F pro C6 uhlovodíky Uhlovodík F 5,