3. Genetická informace a její exprese

Transkript

1 3. Genetická informace a její exprese 3.1 Nukleové kyseliny Primární struktura nukleových kyselin Nukleotid = je sloučenina nukleozidu s kyselinou fosforečnou Nukleozid = vzniká spojením purinové nebo pyrimidinové báze N-glykozidovou vazbou s ribozou nebo deoxyribozou Molekula nukleotidu se skládá z = päťuholníkový monosacharid (pentóza) 2-deoxy-β-D-riboza (anebo β-d-riboza) HO O OH HO O OH OH 2-deoxy-β-D-riboza Purinové báze NH 2 N N NH N Adenin OH OH β-d-riboza = kyselina trihydrogenfosforečná (H 3 PO 4 ) O O O HO P O P O P OH OH OH OH = purinova, pyrimidinova báze: O N NH NH N NH 2 Guanin Pyrimidinové báze: NH 2 N H 3 C O NH O NH NH O NH O NH O Cytozin Tymin Uracil

2 Funkce nukleotidů: Stavební jednotky nukleových kyselin Nuklezidpolyfosfáty jsou přenašeči energie v biologických systémech Aktivují meziprodukty v řade biosyntéz Adenozinové nukleotidy jsou součástí důležitých kofaktorů enzymů NAD(P) +, FAD, CoA Cyklické purinové nukleotidy jsou regulátory metabolismu a neuromodulátory Štruktúrne typy nukleových kyselín: 1. Lineárne molekuly, vyskytujú sa ako: Lineárne jednoreťazcové molekuly DNA (RNA) tj. molekuly s voľnými koncami Lineárne dvojreťazcové molekuly molekuly DNA (RNA) tj. molekuly pozostávajú z dvoch reťazcov v voľnými koncami 2. Kružnicové molekuly nukleových kyselín: Jednoreťazcové kružnicové DNA (RNA) tj. spojité jednoreťazcové, bez voľných koncov Dvojreťazcové kružnicové DNA tj. spojité dvojreťazcové molekuly bez voľných koncov 3. Troj- až štvorreťazcové molekuly DNA Jednoreťazcové molekuly sa označujú skratkou ss (z angl. single stranded) Dvojreťazcové molekuly sa označujú skratkou ds (z angl. double stranded) Konformacie nukleozidov = päťčlenný ribofuranozový kruh sa vyznačuje tzv. pseudorotací, tj. môže plynule prechádzať do rôznych konformácii. V kryštalickom stave sú významné konformácie endo a exo. Cukerná složka nukleozidů se v DNA vyskytuje v konformaci 3'endo nebo 2'endo. Konformace 3'endo znamená, že C3' je na téže straně roviny jako atom C5' a atom dusíku N připojující se bázi k ribóze. Konformace 2'endo znamená, že na stejné straně, jako je atom C5' a N je C2' U Obou konformací vybočuje buď atom C2', nebo atom C3' z roviny, která je tvořena atomy O, C1', a C4'. Konformace 3'endo nebo 2'endo jsou preferovány, jelikož nekovalentní interakce mezi substituenty ribofuranózového kruhu jsou v těchto konfirmacích nukleozidů minimální. Konformace glykozidové vazby = mezi bází a pentózou může být antiklinální (anti) nebo synklinální (syn). U nukleozidů je rotace báze kolem glykozidové vazby omezená stericky (sterická zábrana) vodíkovým atomem na uhlíku C2'. Jestliže atomové skupiny na pozicích 2 a 3 pyrimidnového kruhu nebo 1, 2, a 6 purinu leží MIMO ribofuranózový kruh je glykozidová vazba v konformaci antiklinální (anti). Jestliže tyto skupiny leží NAD ribofuranózovým kruhem je konfirmace glykozidové vazby synklinální (syn). 3'endo upřednostňuje antiklinální konformaci, kdežto 2'endo synklinální. Polynukleotidový řetězec V polynukleotidovém řetězci jsou nukleotidy navzájem spojeny 3',5' fosfodiesterovou vazbou, která se tvoří mezi C3'-deoxyribózy (nebo ribózy) jednoho nukleotidu a C5'- deoxyribózy (nebo ribózy) následujícího nukleotidu. Jeden konec řetězce je proto označován jako 3'-konec, je tvořen OH-skupinou (na C3'-uhlíku) a druhý označovaný jako 5'-konec, je tvořen fosfátovou skupinou (na C5'-uhlíku). Každé prodloužení polynukleotidu se děje kondenzační reakcí mezi C3' koncového nukleotidu a C5' nukleozidtrifosfátu. Strukturní osnovou polynukleotidového řetězce jsou zbytky pentózy, které jsou spojeny fosfodiesterovými vazbami (páteř polynukleotidu = pentózafosfátová kostra)

3 Párování bází dvouřetězcová DNA (duplex) mezi DNA-řetězci = spojení dvou bází vodíkovými vazbami, vzniká Watsonovo Crickovo párování bází = podle tohoto pravidla se prostřednictvím vodíkových vazem adenin (v aminoformě) páruje s tymiánem (v ketoformě) a guanin (v ketoformě) s cytozinem (v aminoformě). V RNA a při interakci RNA s DNA se adenin (v aminoformě) páruje s uracilem (ketoformě). Mezi adeninem a tyminem (uracilem) se tvoří dvě vodíkové vazby a mezi guanine a cytozinem tři. Nukleotidové sekvence, které se spojují Watsonovým Crickovým způsobem vodíkovými vazbami, se označují jako komplementární. Postavení bází, které umožňuje toto párování se označuje jako cis-konfigurace páru bází. Watsonovo Crickovo párování bází je základní, uplatňuje se obecně ve dvouřetězcových DNA, během transkripce, při tvorbě RNA na matricovém DNA-řetězci a v dvouřetězcových RNA. Obrácené Watsonovo Crickovo párování bází Dvouřetězcová DNA může sestávat z paralelních DNA-řetězců, které se vyznačují stejnou orientací fosfodiesterových vazeb. V takových DNA se uplatňuje obrácené Watsonovo Crickovo párování bází. = je charakteristické tím, že báze tvořící v dvoušroubovici pár jsou navzájem v postavení, které je opačné vzhledem k postavení cis a označuje se jako trans-konfigurace páru bází Obráceným Watsonovým Crickovým párováním bází se tvoří páry mezi: C-C; G-G; A-A; T-T. Při tvorbě trojřetězcových a čtyřřetězcových DNA je nutno uvažovat jiné možnosti párování bází Hoogsteenovo párování bází, vznikají triády tj. trojice bází spárovaných tak, že tatáž purinová báze, tvoří jednak Hoosteenův pár s pyrimidinovou bází na jedné straně a Watsonův-Crickův pár s pyrimidinovou bází na straně druhé Triáda typu YR*Y, kde Y = pyrimidinová báze, R = purinová báze, * = obecně znamená odchylku od Watsonova Crickova párování bází Triáda typu YR*R Hoogsteenovo párování bází Umožňuje tvorbu trojšroubovicových DNA Tetrády = párování mezi čtyřma bázemi, které se uskuteční mezi molekulami guaninu a cytozinu a mezi molekulami adeninu a tyminu

4 3.1.2 Sekundární struktura nukleových kyselin 1953 Crick a Watson popsali strukturu dvojitého helixu DNA Sekundární struktura DNA je dvoušroubovice Navzájem komplementární řetězce, které jsou antiparalelní (liší se směrem fosfodiesterové vazby na jedné straně: 3' 5' a na druhé: 5' 3') 1 závit = 10,5 bp = 3,4 nm vzdálenost mezi dvěma páry = 0,34 nm báze jsou orientovány dovnitř vnější číst tvoří opornou strukturu dvoušroubovice = páteř DNA menší žlábek obsahuje OC2 pyrimidinovou a N9 purinovou stranu páru bází je široký 0,6 nm větší žlábek tvoří se na opačné straně a obsahuje OC4 pyrimidinovou a OC6 purinovou stranu báze je široký 1,2 nm oba žlábky se přítomností atomů schopných vytvářet vodíkové vazby s proteiny dvoušroubovicové vinutí několikanásobné vzájemné otočení jednoho řetězce DNA kolem druhého (může být pravotočivé nebo levotočivé) Vzájemná poloha dvou sousedních párů bází určena lokálními osami dvoušroubovice zkrut v rovině výkrut z roviny svislý posun (Dz) příčný posun (Dx) podélný posun (Dy) DNA konformace Konformace A je krátká a široká pravotočivé vinutí os dvoušroubovice vede přes větší žlábek větší žlábek - velmi úzký (0,27 nm) a hluboký (1,35 nm) menší žlábek - velmi široký (1,1 nm) a mělký (0,28 nm) zvýšení na pár bází ~ 0,23 nm zvýšení na jeden závit (otáčku) ~ 2,5 nm počet párů bází na jeden závit ~ 11 konformace glykozidové vazby anti konformace deoxyribozy C3'-endo

5 Konformace B je dlouhá a tenká pravotočivé vinutí os dvoušroubovice vede přes páry bází větší žlábek - široký (1,17 nm) a hluboký (0,88 nm) menší žlábek - úzký (0,57 nm) a hluboký (0,75 nm) zvýšení na pár bází ~ 0,34 nm zvýšení na jeden závit (otáčku) ~ 3,4 nm počet párů bází na jeden závit ~ 10,5 konformace glykozidové vazby anti konformace deoxyribozy C2'-endo Konformace Z je podlouhlá a tenká levotočivé vinutí os dvoušroubovice vede přes menší žlábek větší žlábek - zploštěný na povrchu šířka (0,88 nm) a hloubka (0,37 nm) menší žlábek - velmi úzký (0,2 nm) a hluboký (1,38 nm) zvýšení na pár bází ~ 0,38 nm zvýšení na jeden závit (otáčku) ~ 4,6 nm počet párů bází na jeden závit ~ 12 konformace glykozidové vazby anti u C a syn u G konformace deoxyribozy C2'-endo u dc a C3'-endo u dg Denaturace DNA přechod dvoušroubovicové struktury v samostatné polynukleotidové řetězce. Při zvýšené teplotě se přerušují vodíkové vazby, kterými jsou k sobě poutány komplementární DNA řetězce. K denaturaci dochází i působením jiných vlivů. Čím více CG-párů, tím vyšší teplota denaturace Denaturaci provází hyperchromní efekt dochází ke zvýšení absorbce ultrafialového světla. Je způsoben rozpadem dvouřetězcové molekuly DNA na jednořetězcové, které absorbují UV - záření silněji Teplota tání (T m ) = teplota při níž zdenaturovalo 50 % dvoušroubovicových molekul DNA, odpovídá inflexnímu bodu denaturační křivky. Teplota tání je lineárně závislá na procentuálním obsahu G a C dvouřetězcové DNA Renaturace DNA opačný pochod = obnovení původní dvoušroubovicové struktury z řetězců uvolněných denaturací (provádí se pozvolným snižováním teploty roztoku) Dochází ke spojování sekvenčně příbuzných polynukleotidových řetězců = hybridizace molekul Sekvenční homologie

6 3.1.3 Terciární štruktúra nukleových kyselín Nadšroubovice (superhelix) vzniká zavedením dalšího vinutí do dvoušroubovice DNA, může se vytvořit s lineární nebo kružnicové dsdna Relaxovaná DNA nemá nadšroubovicové vinutí Kovalentně uzavřená kružnice dsdna, která nemá volné konce ani zlom (tj. přerušení fosfodiesterové vazby) v řetězcích, může se vyskytovat v relaxované nebo nadšroubovicové formě Otevřená kružnice relaxovaná dvoušroubovicová kružnicová DNA se zlomem alespoňv jednom řetězci 1. Záporné nadšroubovicové vinutí (závity) uskuteční se odvíjením řetězců spojených vodíkovými vazbami a vede ke snížením počtu dvoušroubovicových závitů, odvíjením se počet vodíkových vazeb mezi řetězci sníží. Odvíjení vyvolá v nadšroubovici pnutím které se uvolní vytvořením nadšroubovicových závitů. 2. Kladné nadšroubovicové vinutí (závity) - uskuteční se svinovaním řetězců spojených vodíkovými vazbami a vede ke zvýšení počtu dvoušroubovicových závitů. TOPOLOGICKÉ PARAMETRY NADŠROUBOVICE: L = T + W a) L - celkové číslo vinutí = celkový počet závitů či překřížení jednoho řetězce druhým v nadšroubovici b) T dvoušroubovicové číslo = počet závitů či překřížení jednoho řetězce druhým v dvoušroubovici c) W nadšroubovicové vinutí = počet nadšroubovicových závit i překřížení dvoušroubovice v nadšroubovici Topoizomerázy katalyzují změny v celkovém čísle vinutí dsdna, mohou relaxovat kladnou i zápornou nadšroubovici. 1) Topoizomerázy I přemísťují jeden neporušený řetězec přes zlom protilehlého řetězce v dvoušroubovici 2) Topoizomerázy II přemísťují neporušenou dsdna přes zlomy obou řetězců protilehlého dvoušroubovice Vedou ke tvorbě uzlů a katenanů Uzel = tj. struktura, která vznikla provlečením naštěpených konců jednořetězcové kružnicové dsdna pochod = zauzlení, vzniká vlivem topoizomerázy I Katenan = vzniká vzájemným provlečením dvou nebo více dvouřetězcových kružnicových molekul DNA katalyzovaným topoizomerázou II pochod = katenace Nukleotidové sekvence DNA jsou buď jedinečné nebo repetitivní. Jedinečná DNA-sekvence, se v haploidním genomu příslušného druhu organizmu vyskytuje pouze jedenkrát (struktúrni geny) Repetitvní sekvence (repetice), DNA-sekvence, které se v haploidním genomu mnohonásobně opakuje. Jednotka repetice = opakovaná sekvence, její délka = počet nukleotidů, které ji tvoří Četnost repetice = počet jednotek dané repetice v haploidnem genomu buňky.

7 Tandemové repetice určitá jednotka se opakuje v tandemu tj. bezprostředně za sebou Obrácené repetice nukleotidová sekvence opakovaná na stejném DNA řetězci ve své komplementární podobě a na komplementárním DNA řetězci v protisměru: 5'...ATGC...GCAT...3' 3'...TACG...CGTA...5' Palindrom jsou obrácené repetice přilehlé, tj. bezprostředně spolu sousedí: 5'...ATGC GCAT...3' 3'...TACG CGTA...5' Výskyt obrácených repetic vede k tvorbě vlásenek a křížových struktur. Vlásenka = je dvoušroubovicová struktura vzniklá párováním komplementárních nukleotidových sekvencí na témže DNA (RNA) řetězci Vlásenková smyčka = tvoří se jestliže obě komplementární sekvence na témže řetězci spolu nesousedí Křížová struktura = vzniká spárováním obrácených repeticí na obou komplementárních řetězcích dsdna Přímá repetice sekvence opakovaná ve stejném směru na témže DNA řetězci: 5'...ATGC...ATGC...3' 3'...TACG...TACG...5' Dlouhá koncová repetice (LTR-sekvence) dlouhá přímá repetice na obou stranách téhož DNA řetězce, přičemž konce každé sekvence LTR jsou navzájem ve vztahu obrácených repeticí: 5'-ATGC...GCAT...ATGC...GCAT-3' 3'-TACG...CGTA...TACG...CGTA-5' Rozptýlené repetice DNA sekvence jejichž jednotlivé kopie se vyskytují v různých místech haploidnho genomu, všechny mají vlastnosti transpozonů a) Krátké rozptýlené repetice jsou dlouhé 300bp b) Dlouhé rozptýlené repetice jejichž délka je větší než 300bp Izolace a purifikace nukleových kyselin Určování primární struktury (gelova elektroforéza, chemická degradační metoda (Maxam-Gilbert), sekvenování DNA enzymovou syntézou) viď otázka č.10

8 3.2 Chromozomy Chromozomy je možno seřadit podle velikosti a tvaru do souboru - karyotypu. V normálním lidském jádře je 23 párů chromozomů (každý člen páru od jednoho rodiče) označených podle velikosti a rozložení pruhů čísly 1 až 22. Poslední 23 pár tvoří chromozomy pohlavní. Chromozómová mutace, resp. chromozómová aberace je mutace, která zasahuje do chromozomů a mění jejich tvar a strukturu heterozygótní aberace = změny uvnitř jednoho chromozómu z páru. homozygotní aberace = stejné změny u obou chromozómů homologního páru. Obvykle vznikají vzácně, častější je jejich vznik splynutím dvou gamet se shodnou vadou. intrachromozomální aberace = přestavby uvnitř jednoho chromozomálního páru (delece, duplikace, inverze, kruhový chromozóm, izochromozóm atd.). interchromozomální aberace = přestavby mezi chromozómy více homologických párů (zpravidla dvěma). Jedná se hlavně o translokace a chromozomální fúze. Geny, z nichž sestává genom eukaryotických organizmů, jsou rozděleny do dvou nebo tří buněčných organel: Živočišná buňka jádro a mitochondrie Rostlinná buňka jádro, mitochodrie a chloroplasty Většina genů je soustředěná v jádře na chromozomu Každý chromosom obsahuje jednu molekulu dsdna (působí ve funkci genoforu) = chromosomová DNA (jaderná DNA) Chromozómové aberace nemusí mít pro buňku, ve které vzniknou, okamžitý význam. 0bvykle se projeví až při buněčném dělení, neboť většina těchto aberací více či méně stěžuje či úplně znemožňuje rovnoměrné rozdělení genetické informace do dceřiných buněk. To může mít za následek vznik nádorového onemocnění, nebo (v důsledku odumírání buněk) urychleného stárnutí tkání a orgánů a rozvoje degenerativních procesů v organismu. U gametických buněk obou pohlaví jsou příčinou snížené plodnosti svých nositelů (rodičů), spontánních abortů nebo vrozených vad potomků.

9 Metacentrický chromozom = centromera je umístěna zhruba uprostřed chromozómu a dělí chromatidy na dvě zhruba stejně dlouhá ramena. Chromozóm má tvar blížící se písmenu X. Submetacentrický chromozom = centromera je výrazněji posunuta směrem ke konci jedněch ramen. Akrocentrický chromozom =centromera dělí chromatidy na jedno rameno velké a jedno malé uzlovité. Telocentrický chromozom = centromera je umístěna u oblasti telomer a chromozóm se tak opticky jeví jako jednoramenný a připomíná písmeno V. Tento typ chromozómu se v karyotypu člověka na rozdíl od ostatních nevyskytuje Chromatin Je to hmota, která se vyskytuje výlučně v jádře eukaryotické buňky a je složena s dsdna, histonů a proteinů nehistonové povahy 2 fyzikálně odlišné stavy chromatinu 1. euchromatin je v dekondenzovaném stavu (aktivní stav) 2. heterochromatin kondenzovaný stav (transkripčně neaktivní), může být: a) konstitutivní heterochromatin nachází se trvale v heterochromatinovém stavu po celý buněčný cyklus ve všech buňkách a vývojových stádii organizmu. Vyskytuje se v centromerách a telomerách chromozomu b) fakultativní heterochromatin přechází v závislosti na ontogenetickém vývoji organizmu do euchromatinového stavu a naopak 3 základné úrovně kondenzace chromatinu: a) 10nm-chromatínové vlákna (nukleozomové řetězce) b) 30nm-chromatínové vlákna c) mitotické chromozomy nejvyšší forma kondenzace chromatinu, transkripčně inaktivní CHEMICKÉ SLOŽKY CHROMATINU: HISTONY- mají globulární střed, konce jsou flexibilní, vláknité. 5 druhů histonů: a) histon H1 b) histon H2A + histon H2B = stabilní dimer c) histon H3 + histon H4 = stabilní tetramer NEHISTONOVÉ PROTEINY patří sem RNA-polymerázy a další proteiny transkripčního aparátu HGM proteiny = proteiny skupiny vysoké pohyblivosti

10 NUKLEOZOMY = základní jednotky chromatinu Každý nukleozom obsahuje: Oktamer histonů (H2A, H2B, H3, H4) 2 vnitřní část nukleozomu Jednu molekulu histonu H1 (není součástí histonového oktameru) Úsek DNA (~200bp), tvořící 2 otáčky (2 závity) kolem histonového oktameru Základem eukaryotického chromozomu je 10nm-chromatínové vlákno (nukleozomový řetězec) 30nm-chromatínove vlákno další stupeň kondenzace, vzniká za účasti histonu H1, který nukleozomový řetězec spiralizuje do solenoidové struktury 1 závit (otáčka) solenoidu je tvořen 6ti nukleozomy váže se k tzv. proteinovému lešení = vláknitá struktura složená z proteinů nehistonové povahy váže se ve formě smyček = chromatinové domény připojovací oblast pro proteinové lešení (SAR)

11 3.3 Genetický kód každá aminokyselina (zkr. AMK) v polypeptidovém řetězci je vyjádřena (kódována) trojicí nukleotidů = triplet genetické kódování = určování primární struktury polypeptidu nukleotidovou sekvencí podle pravidel genetického kódu, které se uskutečňuje translací kodon = základní jednotka genetického kódu = pořadí tří nukleotidů kódujících v polypeptidu určitou AMK nebo signalizují začátek nebo konec jeho syntézy na ribozomu genetický kód = systém pravidel, podle kterých jednotlivé kodony určují zařazení standardních AMK do polypeptidu čtení genetického kódu - na ribozomu je to proces, který je součástí translace = jednosměrné rozeznávaní kodonů v mrna antikodony trna antikodon = specifický triplet, jehož prostřednictvím se trna přechodně váže ke komplementárnímu kodonu na mrna čtecí rámec = jedna ze tří možností způsobu čtení tripletů v nukleotidové sekvenci založená na pevně stanoveném počátku a) otevřený čtecí rámec vymezený iniciačním a terminačním kodonem tak, že může kódovat souvislý a dostatečně dlouhý polypeptidový řetězec b) uzavřený čtecí rámec čtecí rámec přerušovaný terminačními kodony tak, že nemůže kódovat souvislý a dostatečně dlouhý polypeptidový řetězec ZÁKLADNÍ VLASTNOSTI GENETICKÉHO KÓDU: je tripletový (třípísmenový) každá AMK je kódována trojicí nukleotidů v nukleové kyselině je sestaven ze 64 kodonů je degenerovaný = kódování jednotlivých AMK několika různými kodony smysl kodonu = schopnost kodonu kódovat určitou AMK - pouze 61 kodonů smysluplných - nesmyslné (nekódují AMK) UAA(ochre); UAG (amber) = terminační kodony signalizují zakončení syntézy - UGA (opal) bifunkční buď terminační nebo kóduje AMK (selenocysteín) - AUG bifunkční kóduje AMK (metionin) nebo signalizuje začátek syntézy = iniciační kodon synonymní kodony = odlišné kodony stejný smysl univerzalita genetického kódu = u všech živých soustav stejný smysl standardní = používán v plném znění většinou organizmů pravidla kolísavého párování bází Gen = jednotka genetické informace nebo základní funkční jednotka Strukturní gen = úsek DNA řetězce nebo RNA-řetězce, jehož informace se vyjadřuje v primární struktuře polypeptidu (proteinu) jako translačního produktu Translační produkt = molekula polypeptidu vytvořená na ribozomu translací mrnasekvence vymezené iniciačním a terminačním kodonem

12 složené strukturní geny = geny přerušované introny skladá se z intronů a exonů; primární transkript podléhá posttranskripční úpravě sestřihem (sestřih) jednoduché strukturní geny = geny nepřerušené introny konstitutivní sestřih = výsledkem sestřihu primárního transkriptu je molekula mrna, vždy o stejné primární struktuře konstitutivní exon = DNA sekvence složeného strukturního genu působící při všech posttranskripčních úpravách sestřihem jako exon alternativní sestřih = výsledkem je více molekul mrna, které se navzájem liší v primární struktuře alternativní exon = DNA sekvence složeného strukturního genu působící při některých posttranskripčních úpravách jako exon, v jiných jako introny TRANSKRIPČNÍ JEDNOTKA každá je vymezena tzv. startovacím nukleotidem a posledním nukleotidem v terminátoru startovací nukleotid = je nukleotid na DNA sekvenci, od kterého se začíná přepisovaní transkripční jednotky a označuje se jako +1 transkripce probíhá od startovacího nukleotidu doprava až po terminátor včetně, což je regulační oblast, na níž končí přepisovaní transkripční jednotky promotor = je regulační oblast, na kterou se váže RNA polymeráza (i jiné proteiny) podmiňující zahájení transkripce negativní DNA řetězec (antikódující) = matrice (templát) pro syntézu RNA přepisuje se 3' 5' pozitivní DNA řetězec (kódující) = druhý řetězec dvoušroubovicové DNA, který má stejnou sekvenci nukleotidů jako RNA syntetizovaná na negativním řetězci přepisuje se 5' 3' primární transkript z dvouřetězcové DNA odvíjí 5'-koncem Ústřední dogma molekulární biologie Je možný přenos genetické informace z nukleové kyseliny do nukleové kyseliny nebo z nukleové kyseliny do proteinu, ale její zpětný přenos z proteinu do nukleové kyseliny možný není.

13 Replikace DNA Princip mechanizmu replikace DNA: dihelix mateřské DNA se přerušením vodíkových vaze rozplete, každý z uvolněných polynukleotidových řetězců slouží jako matrice podle níž se vytvoří nedativní (komplementární) otisk vniknou tak dvě dceřiné buňky, zcela identické kopie, v nichž jedno vlákno pochází z originálu a druhé je vyrobeno = semikonzervativní replikace Hlavní replikační enzymy: DNA-polymerazy transferazy, katalyzují přenos aktivovaných nukleotidů na polynukleotidový řetězec, na který je připojují fosfodiesterovou vazbou 2+ Mg (DNA) n zbytků + dntp (DNA) n+1 zbytků + PP i (reakce = nukleofilní atak) růst polynukleotidového řetězce probíhá ve směru 5' 3' dokáže připojovat další nukleotid pouze na už existující polynukleotidový řetězec proto se na mateřském vláknu musí vytvořit očko (primer), poskytující akceptorovou skupinu 3'-OH pro zahájení růstu řetězce za katalýzy DNA-polymerazou III DNA-polymeráza I má hydrolytickou aktivitu, což jí umožňuje odstraňovat nesprávné zařazené zbytky rostoucího řetězce DNA - má současně 5' 3' nukleazovou aktivitu a) exonukleázy hydrolyzují fosfodiesterové vazby na koncích polynukleotidových řetězců b) endonukleázy štěpí fosfodiesterové vazby uvnitř polynukleotidového řetězce DNA-polymeráza II DNA-polymeráza III jednotlivé monomery: α-monomer + ε-monomer + θ-monomer = katalytické jádro polymerázy; γ-monomer; δ-monomer; δ'-monomer; χ-monomer; ψ-monomer; DNA ligaza Jedno z dceřiných vláken DNA vzniká po malých fragmentech ( nukleotidových zbytků) = Okazakiho fragmenty; jedno z nově tvořených vláken DNA se tedy netvoří kontinuálně podél celé délky mateřského vlákna, ale kus za kusem enzym, který katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi dvěma úseky řetězce DNA vyžaduje volnou hydroxylovou skupinu na 3'-konci jednoho fragmentu polydeoxyribonukleotidového řetězce a fosforylovou skupinu na 5'-konci druhého fragmentu dovede spojovat pouze polydeoxyribonukleotidové úseky, které jsou součástí dvouvláknové DNA DNA primáza katalyzuje ve spojení s primozomem (komplex primázy s helikázou, schopný kooperace s dalšími proteiny katalyzovat syntézu RNA-primeru na DNA řetězci, který slouží jako matricový pro syntéze opožďujícího se řetězce)syntézu RNA-primeru tj. oligonukleotidu, od jehož 3'-konce se syntetizuje Okazakiho fragment DNA - helikázy katalyzují odvíjení komplementárních polynukleotidových řetězců tvořících dvouřetězcovou DNA (ruší vodíkové vazby)

14 DNA gyráza (je topoizomeráza II) během semikozervativní replikace se před replikační vidlicí vytvoří kladné nadšroubovicové závity. Gyráza je převádí na záporné Mechanizmus replikace Replikace začíná ve specifických místech chromosomu = počáteční body replikace (iniciační body) Vzhledem k rychlosti replikace a rozsahu kopírovaných DNA musí replikace vycházet mnoha iniciačních bodů. Úseky, které jsou replikovány s jednoho bodu replikace = replikony v místech iniciačních bodů, se dihelix DNA rozpletením rozevře tvar vidlice do vidlice nasedne (do obou mateřských vláken) RNA-polymeraza a vytvoří na každém z nich krátký RNA-primer, na něm pak dochází k vlastní replikaci (napojování jednotlivých nukleotidů) mateřská vlákna jsou vzájemně antiparalelní, musí se opačně orientovaná dceřiná vlákna replikovat v opačných směrech obousměrná replikace dceřiné vlákno, které roste od iniciačního bodu směrem k vidlici, se syntetizuje kontinuálne = vedoucí (přebíhající) vlákno vlákno vyráběné v opačném směru s 5'-konci orientovanými směrem k místu rozplétání se musí syntetizovat po částech = zpožďované vlákno (Okazakiho fragmenty) další krok odstranění úseků RNA Okazakiho fragmenty a úseky vytvořené činností DNA-polymerazy I jsou pak spojeny v souvislý řetězec pomocí DNA-ligázy opravné (reparační) mechanizmy

15 Transkripce genů: biosynteza RNA Při ní se přepisují, na principu komplementarity bází, do jednovláknových molekul RNA s vysokou předností všechny úseky DNA mající charakter genů; tj. strukturní geny, nesoucí kód pro výrobu polypeptidových řetězců se specifickým pořadím AMK zbytků, geny pro trna a geny ribozomálních RNA RNA polymerazy Enzymy katalyzující biosyntézu RNA se nazývají DNA-řízené (dependentní) RNApolymerazy, nebo transkriptazy. Rozeznává promotory všech transkripčních jednotek katalyzují postupnou polymeraci ribonukleotidů = katalyzuje při transkripci na matricovém DNA-řetězci syntézu dlouhých primárních transkriptů a váže se na promotor má podjednotky: 2α; β; β'; σ preferovaným templátem je dvouvláknová DNA nukleotidy musí být v aktivované formě ribonukleozidtrifosfátů potřebuje ke své funkci přítomnost iontů Mg 2+ biosynteza RNA polyribonukleotidový řetězec roste ve směru 5' 3', nepotřebuje primer nntp 2 + templátdna Mg ; RNA + npp i Transkripční jednotka bakteriálního genomu jsou dvojího typu: a) operony (obsahuje operátor) b) neoperonové transkripční jednotky (obsahuje operátor) liší se od sebe v tom, že mezi jejich promotorem a startovacím nukleotidem se nachází regulační oblast = operátor základní funkční elementy jsou: promotor startovací nukleotid přepisované geny terminátor operon = transkripční jednotka, která je řízena promotore a operátorem operátor = je regulační oblast na DNA, na kterou se váže protein represor po vazbě aktivního represoru na operátor se transkripce v transkripční jednotce zastaví bakteriální promotor, obsahuje tyto hlavní sekvence: 1) sekvenci soustředěnou kolem nukleotidu -35: 5' TTGACAT 3' = konvenční sekvence 2) sekvence, která se nachází kolem nukleotidu -10: 5' TATAAT 3' = Pribnowův box Terminátory transkripce 1) terminátory nezávislé na ró-faktoru, tj. končí transkripce bez účasti rófaktoru 2) terminátory závislé na ró-faktoru, tj. terminátory, na nichž transkripce může skončit jen za přítomnosti ró-faktoru Ró-faktor je protein, který na terminátorech na něm závislých katalyzuje uvolnění dokončeného RNA-řetězce z matricového (negativního) DNA-řetězce a zakončuje transkripci terminátor se celý přepíše do RNA, která se pak z něho uvolní σ-faktor = podjednotka bakteriální RNA-polymerázy podmiňující specifickou vazbu tohoto enzymu k sekvenci kolem -35 promotoru

16 Mechanizmus transkripce 1) vazba enzymu RNA-polymerazy na templát DNA. K vazbě dochází na určeném místě (tzv. poznávacím místě) v oblasti promotoru (vazební místo DNA-polymerazy) a jeho rozpoznání obstará σ- podjednotka enzymu na dvoušroubovici, která se začíná lokálně rozplétat (denaturovat) 2) iniciace syntezy RNA K vlastní výrobě RNA činností RNA-polymerázy nedochází v centru pro vazbu enzymu, ale 6-7 nukleotidových zbytků dále. Začíná připojením ATP na matrici DNA, umístněním druhého nukleotidu podle DNA. Start syntezy RNA je kontrolován různými mechanizmy, založeným většinou na ovládání vazby RNA-polymeraza na promotor. 3) elongace polyribonukleotidového řetězci Probíhá ve směru 5' 3' pohybem enzymu podél DNA, při tom se molekula DNA postupně rozvinuje. Na této operaci participuje několik bílkovinových faktorů. Po zahájení elongace a napojení asi 10 nukleotidů se σ-podjednotka odpojí z oligomeru RNA-polymerázy a může se připojit k jiné molekule enzymu 4) terminace Biosynteza RNA končí, když RNA-polymeráza dospěje k nepřepisovanému specifickému segmentu DNA (terminátoru, terminačnímu místu) 5) uvolnění vyrobené RNA a enzymu v matrice DNA Zhrnutí: V procesu transkripce je u eukaryot informace komplementárně přepsána do hetrogenní jaderné RNA (hnrna), která se stává po posttranskripčních úpravách - sestřihu (vystřižení intronů), syntézy čepičky na 5 konci RNA a poly(a) ocasu na 3 konci), funkční mediátorovou mrna a přechází do cytoplasmy aby se spojila s buněčnými ribozomy, kde probíhá translace, resp. proteosyntéza. Posttranskripční modifikace V řade případů nejsou RNA vyrobené transkripcí (tzv. primární transkripty) identické s funkčními formami, ale jsou jejich prekurzory. K jejich převedení do konečné aktivní podoby (zralé formy), dříve než opustí jádro a přejdou do cytoplazmy, slouží různé úpravy. Translace genetické informace: proteosyteza Proteosynteza je translací (překladem) strukturních genů ze čtyřpísmenné řeči nukleotidů do jazyka sestávajícího z 20 aminokyselinových (AMK) písmen. Základní mechanistické schéma: Polypeptidové řetězce se syntetizují ve směru N C postupným přidáváním AMK k C-konci rostoucího řetězce v pořadí určeném matricí mrna. Probíhají dva prostorově oddělené procesy: 1) proces, vyrábějící přepisem genu z DNA matrici mrna odehrává se v jádru 2) proces, zajištující aktivovaný materiál, kterým jsou aminoacyl-trna (aktivace a selekce AMK) odehrává se v cytoplazmě Vlastní výroba polypeptidového řetězce nastává v rizotech, kam přichází jak matrice mrna, tak aktivované AMK nesené specifickými trna. Má 3 fáze: zahájení (iniciaci), růst řetězce (elongaci) a zakončení syntezy (terminaci)

17 Základní součástí proteosyntetického aparátu Ribozomy = organely, jsou buněčnými továrnami na výrobu bílkovin sestávají ze dvou podjednotek: malé a velké. Obě se skládají asi 2/3 z molekul rrna, zatímco zbývající 1/3 hmoty tvoří bílkovinné složky při proteosyteze se ribozom posunuje po mrna, je v přímém styku s ním vždy jen velmi krátký úsek matrice na jednu molekulu mrna se proto může současně vázat několik ribosomů a může se její pomocí zhotovit více kopií polypeptidu (zvýšení efektivity procesu) komplex mrna s více ribozomy = polynom, může být různě velký podle rozsahu mrna obsahují řadu vazebných míst, klíčový význam mají dvě oblasti: 1. aminoacylové místo (místo A) 2. peptidové (peptidylové) místo (místo P) prvé je asi celé umístěno ve větší podjednotce a váže trna přenášející napojovanou AMK. peptidové místo je situováno převážně v malé podjednotce a umožňuje vazbu trna nesoucí tvořící se polypeptid. ve velké podjednotce jsou dále místa pro vazbu faktorů účastnících se růstu řetězce (elongace) a jeho ukončení a uvolnění z ribozomu (terminace) malá podjednotka má vazebné místa pro faktory, podílející se na zahájení (iniciaci) proteosyntezy a oblast kam se zachytí úvodní sekvence mrna Prvním krokem procesu translace je enzymová konverze každé AMK na odpovídající aminoacyl-trna. To umožňuje jednak zvýšení reaktivity AMK pro tvorbu peptidové vazby (aktivace), jednak je AMK vybrána specifickou trna (selekce) aminoacyl-trna-ligaza každá z 20 AMK má nejméně jeden specifický aktivační enzym Aktivace AMK: 1. aa + ATP aa~amp (aminoacyladenylát přechodný produkt)+pp; účast aminoacyl-trna-syntetázy 2. aa~amp + trna aa~trna + AMP, kde ~ je makroergická vazby Matrice představující instrukci pro předepsané řazení AMK ve vyráběném polypeptidovém řetězci, je mrna aktivní formy mrna obsahují na obou koncích struktury, které se nepřekládají Translační faktory mnohým je společné, že vytvářejí komplex s GTP, který funguje jako allosterický efektor měnící konformaci faktoru a tím i jeho vazebné schopnosti. Řada translačních faktorů jsou fosfoproteidy Allosterický enzym - enzym obsahující oblast, oddělenou od místa vazby substrátu, na niž se mohou vázat malé regulační molekuly (efektory) a ovlivňovat katalytickou aktivitu enzymu.

18 Transferová RNA (trna) Mechanizmus proteosyntezy Iniciace proteosyntézy Umístnění první AMK, označované jako iniciace je trochu speciální. Jde o komplexní proces, jehož se zúčastňují obě podjednotky ribozomů, mrna, zvláštní trna (nesoucí první AMK zbytek), která se liší v některých vlastnostech od ostatních trna, iniciační faktory a GTP jako zdroj energie

19 První AMK, kterou začíná synteza všech polypeptidových řetězců je metionin. Váže se na startovací signál (iniciační kodon) na mrna prostřednictvím specifické trna (iniciatorová trna (trna f )) Kde začne čtení zprávy obsažené v mrna určují 2 druhy interakci: 1. párování bází iniciační oblasti mrna s úsekem na 3 -konci 16S rrna 2. interakcemi iniciačního kodonu (AUG) s antikodonem iniciatorové trna f Průběh procesu iniciace (u E.coli) Podstatou iniciační fáze proteosyntezy je spojení mrna menší podjednotky ribozomu a Met-tRNA f za vzniku tzv. 30S iniciačního komplexu. Vyžaduje GTP jako zdroj energie a 3 iniciační faktory IF1, IF2, IF3. Proces začíná: rozpadem ribozomu na volné podjednotky na komplementární úsek 16S rrna podjednotky 30S se pak za spoluúčasti IF3 váže iniciační oblast mrna tak, aby iniciační kodon (AUG) byl přístupný pro antikodon UAC iniciatorové trna faktor IF3 současně brání předčasné asociaci podjednotek na funkční inaktivní ribosom (bez MRNA) iniciatorová trna se připojuje k podjednotce 30S s navázanou mrna prostřednictvím komplexu fmet-trna f -IF2-GTP za součinnosti IF2 tento komplex se váže tak, že fmet-trna f se napojí na iniciační kodon GTP přejde do kontaktu s enzymem, který je součástí podjednotky 30S a katalyzuje jeho hydrolýzu na GDP, který zůstává vázán na iniciační faktor, a na P i, který se uvolní celý proces katalyzuje stejná ligaza, jaká zprostředkovává vazbu metioninu na trna f hydrolyza GTP vyvolá změnu konfirmace iniciačního faktoru IF2 tak, že ztratí schopnost vazby s fmet-trna f i s podjednotkou 30S odpadá z iniciačního komplexu, tím se uvolní místo pro napojení podjednotky 50S a 30S iniciačního komplexu přechází na 70S iniciační komplex (konečný produkt iniciace) 70 iniciačný komplex je připraven k elongační fázi proteosyntezy Růst polypeptidového řetězce v místě P (peptidovém) ribozomu má navázanou fmet-trna f (čímž je vymezen čtecí rámec) místo A (aminoacylové) je volné Umísťování každé následující AMK probíhá v opakujících se cyklech, sestávajících ze 3 kroků: 1. umístění připojované aminokyseliny na mrna řízené specifickým rozpoznáním (interakcí) kodon antikodon 2. její napojení peptidovou vazbou a posun ribozomu po mrna 3. aby se mohla vázat další AMK na svůj kodon a mohl být zahájen další cyklus kodon mrna, který je místě A, určuje výběr vhodné aminoacyl-trna, která se na něj naváže samotná trna se váže slabě, proto její vazbu zprostředkovává cytoplazmatická bílkovina EF-Tu (elongační faktor)

20 vytváří ternární komplex EF-Tu-GTP-aminoacyl-tRNA, který se váže na ribozom pevně při vazbě aminoacyl-trna tohoto komplexu v místě A se současně z GTP odštěpí fosforylová skupina a zbylý binární komplex EF-Tu-GTP odpadne od ribozomu faktor EF-Tu, funguje zcela analogicky jako faktor IF2 při iniciaci vazbu jednotlivých aminoacyl-trna, včetně vazby fmet-trna f, tedy umožňuje hydrolýza GTP, kterou v případe elongace a iniciace pravděpodobně katalyzuje stejný enzym nukleotidy GTP a GDP fungují jako allosterické efektory: GTP mění konformaci faktorů EF-Tu a IF2 tak, že mohou vázat aminoacyl-trna GDP tuto vazbu znemožňuje faktor IF2 je zřejmě specializován na vazbu metionyl-trna f elongační faktor EF-Tu je schopen vázat všechny ostatní aminoacyl-trna vzhledem k obsahu EF-Tu v buňce se zdá, že je tato bílkovina limitujícím faktorem procesu elongace a tím celé protesyntezy buňka potřebuje rychlý a účinný mechanizmus na regeneraci faktoru EF-Tu klíčovou úlohu v mechanizmu hraje bílkovina = elongační faktor Ts na rozdíl od ostatních translačních faktorů se nikdy nenavazuje na ribozom když se uvolní binární komplex EF-Tu-GDP z ribozomu, jsou umístěny první dvě AMK na mrna prostřednictvím svých trna a může nastat další fáze elongačního cyklu tj. jejich spojení peptidovou vazbou dochází k tomu odštěpením metioninu a jeho přenosemna aminoskupinu nově napojovaného AMK zbytku, vázaného v místě A reakce je katalyzována enzymem peptidytransferazou, který je součástí větší ribozomální podjednotky peptidy-trna, která se vznikem peptidové vazby prodloužila o jeden aminokyselinový zbytek, se teď nachází v místě A, zatímco místo P je obsazeno volnou (deacylovanou) trna posledním stupněm elongačního cyklu je tzv. translokace, spočívající v pohybu ribozomu o vzdálenost jednoho kodonu směrem k 3'-konci. Translokace má 3 důsledky: a) trna má vysokou afinitu k místu P pouze tehdy, když je na ní vázán aminoacyl. Deacylovaná trna proto disociuje od ribozomu do cytosolu, kde může vázat další molekulu AMK b) Peptidyl-tRNA, která je stále navázána na mrna prostřednictvím interakce antikodon-kodon se přemístí z místa A do místa P. c) posunem ribozomu po mrna o 3 nukleotidy se následující kodon dostane do takové pozice, že může být čten další aminoacyl-trna, vstupující na uvolněné místo A. Tím se dosáhne výchozího bodu elongačního cyklu, který se tak může opakovat Předpokládá se, že tyto posuny jsou výsledkem konfirmačních změn jedné ribozomální podjednotky vůči druhé. Tento pohyb vyžaduje přítomnost další bílkoviny nesoucí GTP a umožňující jeho hydrolyzu. Je označovaná jako elongační faktor G (EF-G), translokační faktor nebo translokaza cytoplazmatická bílkovina.

21 Terminace proteosyntezy Elongační cykly se opakují tak dlouho, až je polypeptidový řetězec kompletní. Jeho růst končí, když se v aminoacylovém místě ribozomu objeví jeden z terminačních signálů (terminačních kodonů, stop-kodonů) V místě P se nachází kompletní polypeptidový řetězec, připojený prostřednictvím trna, která přinesla na ribozom poslední C-koncový AMK zbytek Terminační kodony nejsou rozpoznávány trna, ale rozpustnými bílkovinami zvanými uvolňovací faktory. Uvolňovací faktory po vazbě na stop-kodony zabraňují vstupu dalšího aminoacyltrna na aminoacylové místo ribozomu, vytvářejí komplex s GTP, který funguje jako allosterický efektor a mění jejich konformaci a tím i vazebné schopnosti. podílejí se na uvolnění polypeptidového řetězce z ribozomu aktivují peptidyltransferazu a mění její specifiku tak, že katalyzuje hydrolýzu esterové vazby mezi polypeptidový řetězcem a poslední trna, která deacylací ztratila schopnost vazby. z ribozomu odpadá i mrna vyrobený polypeptidový řetězec samovolně zaujímá odpovídající osobitou prostorovou strukturu nakonec ribozom účinkem faktoru, který je ztotožňován s iniciačním faktorem IF1 disociuje na podjednotky, čímž je připraven k zahájení nové proteosyntezy Krátký shrnutí: Informace mrna je překládána z jazyku bází do jazyka aminokyselin a jejich sekvence v proteinu. Komplementárně přepsaný triplet bazí do mrna, který kóduje určitou aminokyselinu se nazývá kodon. Soubor 64 tripletových kodonů pro 20 aminokyselin a 3 stop-kodonů představuje genetický kód. Každý kodon (kromě STOP kodonů ) v sekvenci mrna kóduje specifickou aminokyselinu v sekvenci polypeptidu, genetický kód je nepřekryvný. Některé aminokyseliny jsou kódovány více než jedním tripletem, což označuje termín degenerace kódu. Pořadí tripletových kodonů v genu, jak jsou postupně čteny a překládány od iniciačního kodonu ke stop kodonu se nazývá čtecí rámec. Ribozomy jsou složeny ze dvou podjednotek jejichž nejpodstatnější částí jsou 4 typy ribozomální RNA (rrna). V ribozomu představuje mrna templát s kodony, na které postupně nasedají transferové RNA (trna) odpovídajícími antikodony na antikodonové kličce. Na aminoacylovém konci trna je navázána příslušná aminokyselina, která se peptidickou vazbou spojí s předchozí aminokyselinou polypeptidového řetězce. Terminační kodon translaci ukončí. Polypeptidový řetězec dále podléhá posttranslačním úpravám tj. např. změny konformace, zkrácení nebo rozštěpení řetězce, acetylace, glykosidace. Posttranslační úpravy jsou jedním z mechanismů vedoucích k produkci několika proteinů z jednoho genu. Proteosynteza eukaryot Rozdíly: a) odlišné velikosti ribozomů, b) odlišné struktury a organizace molekul mrna c) větši počet iniciačních faktorů, d) možnosti regulace výroby bílkovin na úrovni translace e) odlišné velikosti a organizace eukaryotních a prokaryotních buněk: zatím co u prokaryot již během výroby mrna dochází k jejímu překladu, u eukaryot jsou důsledky existence jaderné membrány transkripce a translace prostorově i časově oddělené

22 Kotranslační a posttranslační úpravy Polypeptidové řetězece vzniklé při překladum RNA nejsou většinou konečnými produkty, ale jen hrubými výrobky (prekurzory), které jsou dále různě upravovány, a to ješte během své syntezy (kotranslační modifikace) nebo až po jejím dokončení (posttranslační modifikace). Kotranslační úpravy: a) reformulace b) odštěpení AMK c) chemická modifikace AMK peptidu d) tvorba disulfidových vazeb e) připojení cukerných zbytků (za vzniku glykoproteinu) f) vytváření sekundární a terciární struktury Posttranslační úpravy: a) vyštěpení peptidů b) tvorba kvartérní struktury c) přidání prostetické skupiny d) sestavování oligomerních proteinů a nadmolekulárních struktur Regulace produkce bílkovin v buňce konstitutivní (základní) bílkoviny, které buňky potřebují za všech okolností indukovatelné (adaptivní) bílkoviny, které jsou syntetizovány jen v určitých situacích a) regulace genů (replikace, reparace) b) regulace transkripce (ovládáním její iniciace a terminace) c) posttranskripční regulace (sestřih, modifikace, řízení transportu mrna) d) regulace translace (řízením její iniciace a terminace) e) posttranslační regulace (modifikační úpravy) Alberts, B. a kol.:základy buněčné biologie. 2.vyd. Ústí nad Labem: Espero Publishing, 2005 Murray, R. a kol.: Harperova biochemie. 4.(české) vyd. Jinočany: H+H, 2002 Rozsypal, S.: Úvod do molekulární biologie. 3. vyd. Brno: MU, 2002, díl první, Informační makromolekuly Molekulární biologie prokaryot Vodrážka. Z.:Biochemie. Praha: Academia, 2002