Sekundární metabolismus Antibiotika

Transkript

1 Sekundární metabolismus Antibiotika Ing. Hana Sýkorová, Ph.D. 2014

2 sekundární metabolismus 1961 Bulock termín sekundární metabolit metabolity, které nejsou nepostradatelné pro růst a reprodukci specifický význam pro producenta nepřesný termín vhodnější speciální nebo specifický metabolismus (resp. obecný metabolismus místo primární ) na vstupu relativně málo intermediátů, na konci široké spektrum sloučenin Common metabolites generated from secondary biosynthesis pathways in fungi

3 sekundární metabolismus jedinečné metabolické dráhy enzymy s nižší substrátovou a reakční specifitou ve srovnání s obecným m. vznik skupiny chemicky a strukturně podobných látek syntéza sekundárních metabolitů strukturně podobných primárním metabolitům: existující enzymy primárního metabolismu speciální (klasická ribosomální syntéza lantibiotik x speciální typ multienzymových komlexů při syntéze polypeptidových antibiotik)

4 sekundární metabolismus klíčové intermediáty: sacharidy šikimová kyselina a/nebo aromatické kyseliny nearomatické aminokyseliny C1 sloučeniny krátké mastné kyseliny (octová, propionová) intermediáty citrátového cyklu puriny a pyrimidiny kys. šikimová Klasifikace sekundárních metabolitů podle původu intermediátů

5 Význam sekundárního metabolismu poskytování výhody v konkurenčním prostředí (zvýšení schopnosti růstu, reprodukce, rozšíření nebo přežití v daném prostředí) signální funkce (autoregulátory luminiscenčních bakterií, koordinace spolurace u streptomycet, sexuální diferenciace kvasinky S. cerevisiae α x a faktor ) obranná funkce (antibiotika, mykotoxiny, pigmentace ) účinek na široké spektrum konkurentů včetně vyšších organismů (srovnej s bakteriociny!) Doporučený zdroj: sylabus k předmětu Biochemie sekundárních metabolitů, Ústav biotechnologie VŠCHT, prof. Jan Masák

6 Antibiotika

7 Úvod, historie Klasifikace Mechanismy účinku, zásahová místa Rezistence Skupiny atb podle chemické struktury Metodika stanovení citlivosti, hodnocení účinku

8 antibiotika látky které inhibují růst mikroorganismů (bakteriostatické), nebo je usmrcují (baktericidní) potlačení konkurenčních mo přírodní látky produkované převážně mikroorganismy, nebo podobné látky připravené semisynteticky popř. synteticky produkty sekundárního metabolismu

9 Historie "...podle mne budou do deseti let antibiotika jako léčivo zakázána" Sir Alexandr Fleming ( ) 1928 penicilin (Penicillium nonatum) 1939 izolace (H.W. Florey a E.B. Chain) 1945 Nobelova cena za fyziologii a medicínu 1944 pokusná produkce penicilinu v továrně Benjamin Fragner v Praze (dnes Zentiva)

10 Historie

11 Antibiotika pro klinické použití nesmí poškozovat eukaryotní buňky účinek již v nízkých koncentracích této hladiny má dosáhnout přiměřeně brzy výhodou post-antibiotický efekt určitý časový interval, ve kterém přetrvává potlačení metabolické aktivity mo a jeho množení i když antibiotikum není v těle přítomno.

12 Kritéria dělení antibiotik: Původ Biologické účinky Biosyntetická dráha Mechanizmus účinku Chemická struktura

13 Podle původu: mikroorganismy (70% ř. Actinomycetales) vyšší rostliny, řasy, lišejníky živočichové přirozené semi-syntetické syntetické

14 Podle biologického účinku: antivirotická antibakteriální antifungální antiparazitická širokospektrá x úzkospektrá bakteriostatická x baktericidní

15 Podle mechanismu účinku: Inhibice syntézy buněčné stěny Porušení buněčné membrány Inhibice syntézy bílkovin Inhibice syntézy nukleových kyselin Inhibice metabolismu kys. listové (antimetabolity)

16 Zásahová místa:

17 Inhibice syntézy buněčné stěny

21 Inhibice syntézy buněčné stěny β-laktamy Fosfomycin Bacitracin Vankomycin Fosfomycin zabraňuje syntéze peptidoglykanové podjednotky. Bacitracin interferuje s funkcí baktoprenolu. Penicilin a vankomycin inhibují křížné propojení peptidoglykanu.

22 Porucha funkce CM Porušení integrity CM únik endogenních látek zánik mikroorganismu Polymyxiny cyklické peptidy s postranním hydrofobním řetězcem směs několika antibiotik (Bacillus polymyxa) účinek na G- lokální použití (v očním lékařství či ORL) Polymyxin B, kolistin (polymyxin E)

23 Porucha funkce CM Kolistin Polymyxin B Vazba na LPS vnější membrány, průnik k CM, vazba na fosfolipidy dezintegrace hydrofobní řetězec zásadní úloha "detergent-like" efekt

24 Inhibice syntézy bílkovin

25 Inhibice syntézy bílkovin vždy vazba na ribozom (výjimka = mupirocin)

26 Inhibice syntézy bílkovin Streptomycin ( a další aminoglykosidy) vazba na malou podjednotku a fixuje ribosom na mrna. Ribosom tak nemůže pokračovat v protesyntéze Erytromycin (a další makrolidy) vazba na velkou ribosomální podjednotku a brání elongaci Tetracykliny deformují strukturu malé podjednotky, takže molekuly trna s navázanou aminokyselinou nemohou interagovat s mrna Chloramfenikol vazba na velkou podjednotku (inhibice elongace) Linkosamidy vazba na velkou podjednotku (inhibice translokace)

27 Inhibice syntézy bílkovin Mupirocin (produkce - Ps. fluorescens) část molekuly strukturou blízká izoleucinu reverzibilní vazba na izoleucyl-trna-syntetázu znemožnění vazby Ile na příslušnou trna inhibice syntézy proteinového řetězce (Ile nemůže být inkorporován) účinný proti G+ mikroorganizmům působícím většinu kožních infekcí (stafylokoky, včetně methicilinrezistentních kmenů) Bactroban (mast)

28

29 DNA gyráza RNA polymeráza Vazba na DNA Zlomy v DNA Inhibice syntézy NA Chinolony (kys. nalidixová, ciprofoxacin) vazba na GyrA podjednotku DNA-gyrázy Novobiocin vazba na GyrB podjednotku DNA-gyrázy Rifampin vazba na β-podjednotku DNAdependentní RNA polymerázy účinek před zahájením transkripce Aktinomycin Toxické polypeptidové antibiotikum, cytostatický účinek Inhibice transkripce (vazba na DNA, interkalace mezi G-C) Metronidazol, nitrofurantoin Zlomy v DNA

30 Sulfonamidy Analogy PABA Kompetitivní inhibice Trimethoprim Inhibice metabolismu kys. listové kys. listová (folát) - vit B9 - eukaryota příjem z prostředí - bakterie příjem jen v omezeném množství, nutná syntéza (kys. p-aminobenzoová + pteridin) - nezbytná pro syntézu NA Analog části molekuly DHF Vazba na DHF-reduktázu Synergický účinek (dvě místa v metabolickém řetězci) kys. listová

31 Inhibice metabolismu kys. listové aktivní forma kyseliny listové = THF = koenzym transferáz součást syntézy nukleotidů

32 Zásahová místa - shrnutí Inhibice syntézy buněčné stěny Porušení buněčné membrány Inhibice syntézy bílkovin Inhibice syntézy nukleových kyselin Inhibice metabolismu kys. listové

33 Rezistence

34 Rezistence = schopnost přežít účinek inhibiční koncentrace daného atb primární (přirozená - intrinsic) - dána druhem (přirozenými vlastnostmi) bez ohledu na předchozí kontakt s atb - př.: β-laktamy x buněčná stěna buňky bez b.s. přirozeně rezistentní (živočišné b.) sekundární (získaná - acquired) - na základě kontaktu s atb (selekce odolných jedinců) - mutací nebo přenosem genů (plasmidy, transpozony) penicilinový typ (multiple step mutation) = po dlouhodobém podávání atb (penicilin, chloramfenikol, bacitracin) streptomycinový typ (one step mutation) = rychlý vznik vysoce rezistentních kmenů (streptomycin, erytromycin, linkomycin)

35 Rezistence - mutace odhad: dceřiná buňka s mutací 1 : konkurenční výhoda, selekce

36 Rezistence - přenos během dělení z buňky mateřské do buněk dceřiných různými mechanizmy i do buněk bakterií různých druhů (horizontální přenos) - mobilní částice - plazmidy, transpozony, integrony - mechanizmy přenosu: transdukce (virovou částicí) konjugace (spájení přes pilus) transformace (DNA z volného prostředí, např. mrtvé b.)

37 Rezistence obecné mechanismy změna cílové struktury omezená penetrace atb do buňky (poriny) zvýšené vylučování atb z buňky (eflux) enzymatická inhibice/inaktivace antibiotika Antibiotikum Beta-laktamová Aminoglykozidy a makrolidy Chloramfenikol Tetracykliny Chinolony Sulfonamidy Trimetoprim Mechanizmy rezistence Produkce beta-laktamáz permeability buněčné stěny Změna penicilin-vazebných proteinů Snížená vazebnost na ribozómy permeability buněčné stěny Produkce inaktivujících enzymů vazebnosti na cílové ribozómy permeability buněčné stěny aktivity chloramfenikol-acetyltransferázy transport k ribozómům Aktivní buněčný eflux (vylučování antibiotika z buňky) Rezistence DNA-gyrázy permeability buněčné stěny Aktivní buněčný eflux Rezistence syntetázy kyseliny listové Rezistence reduktázy kyseliny dihydrolistové permeability buněčné stěny

38 Rezistence změna cílové struktury příklady: penicilin vázající proteiny (PBP) - přítomnost genu meca pro pozměněný PBP rezistence na methicilin (MRSA stafylokoky) modifikace prekurzorů peptidoglykanu - přítomnost genů vana, vanb rezistence na vankomycin modifikace DNA gyrázy - mutace v genu gyra a gyrb rezistence na fluorochinolony změna RNA polymerázy - bodové mutace, inzerce a delece v oblasti rpob (gen pro β- podjednotku RNA polymerázy) rezistence k rifampicinu mutace v syntéze ribosomálních proteinů rezistence k aminoglykosidům a makrolidům

39 Rezistence změna cílové struktury Vankomycin - glykopeptidové atb. - mechanismus: inhibice buněčné stěny (transpeptidace) - nahrazení koncového D-Ala laktátem - rezistentní enterokoky (VRE) = nebezpečí, vankomycin používán jako atb poslední volby - popsán přenos na MRSA stafylokoky

40 MRSA methicilin rezistentní Staphylococcus aureus S. aureus kůže, sliznice (30% populace) po proniknutí bariérou záněty, sepse (diabetická noha) 40. léta potvrzena rezistence některých kmenů S. aureus na penicilin dnes - více než 90% penicilin-rezistentních kmenů šíření rezistence - gen pro β-laktamázu (blaz) na plasmidu přelom 50. a 60. let semisyntetické peniciliny (methicilin) 1961 popsán kmen rezistentní na veškeré β-laktamy meca modifikace PBP = MRSA problém nemocničních nákaz (otevřené rány, snížená imunita ) účinná léčba především vankomycinem nebezpečí = rozšíření VRSA

41 Rezistence změna propustnosti LPS v membráně G- (lipid A + polysacharid + O-antigen) - bariéra proti účinkům atb modifikace lipidu A snížení vnějšího záporného náboje membrány rezistence k polymyxinům a aminoglykosidům poriny - rychlost difuze atb závisí na velikosti, počtu a selektivitě porinů - OprD porin pro malé β-laktamy (imipen) - OprE porin pro chinolony a cefalosporiny absence nebo snížení počtu porinů, popř. mutace vedoucí k zúžení porinů rezistence

42 Rezistence eflux - eflux = mechanismus, kterým se bakterie zbavuje široké škály chemicky a strukturně odlišných sloučenin - transmembránové proteiny eflux pumpy úzce specifické (tetracyklin) nespecifické - multidrug transportéry - schopné odstraňovat celou řadu atb - multirezistentní fenotyp - AcrAB/TolC - E.coli, Salmonella - MexAB/OprM - Ps. aeruginosa rezistence s omezenou kapacitou, při zvýšení koncentrace atb buňka opět citlivá

43 Rezistence eflux Tetracyklin - mechanismus účinku: inhibice proteosyntézy (vazba na 30S ) - indukce tetracyklinem - geny tet na konjugativních plasmidech

44 Rezistence inaktivace atb enzymy modifikující aminoglykosidy acetyltransferázy (aac) - acetylace aminosk. (acetyl-coa) fosfotransferázy (aph) - fosforylace hydroxylové sk. (ATP) adenyltransferázy (ant) - adenylace hydroxylové sk. (ATP) - geny většinou na plasmidech a transpozonech enzymatická inaktivace chloramfenikolu acetyltransferáza (cat) acetylace hydroxylové skupiny, modifikovaný derivát není schopen vazby na ribosom - geny většinou na plasmidech a transpozonech enzymy hydrolyzující β-laktamová antibiotika β-laktamázy

45 Rezistence inaktivace atb β-laktamázy - přerušení β-laktamového kruhu hydrolýzou amidové vazby - široká skupina enzymů (více než 340 typů) - na chromosomech i plasmidech - konstitutivní i indukovaná biosyntéza - penicilinázy, cefalosporinázy, metalo-β-laktamázy (závislé na iontu kovu, obvykle Zn 2+ )

46

47 Kritéria dělení antibiotik: Původ Biologické účinky Biosyntetická dráha Mechanizmus účinku Chemická struktura

48 Třídění antibiotik podle struktury: β-laktamy aminoglykosidy linkosamidy makrolidy tetracykliny polypeptidy glykopeptidy polyketidy chinolony/fluorochinony sulfonamidy další - chloramfenikol, rifampicin

50 β-laktamy peniciliny cefalosporiny monobaktamy karbapenemy inhibitory β-laktamáz

51 β-laktamy základní struktura: 4 členný β-laktamový kruh + postranní řetězec peniciliny: 5-členný heterocyklus cefalosporiny: 6-členný heterocyklus monobaktamy: bez heterocyklu peniciliny monobaktamy cefalosporiny kys. klavulanová

52 β-laktamy mechanismus: - poškození buněčné stěny (inhibice transpeptidace) - vazba na transpeptidázu (PBP penicilin binding protein) - baktericidní účinek - působí především na G+

53 produkce: β-laktamy Penicilium chrysogenum (přirozené peniciliny) Cephalosporium acremonium (přirozené cefalosporiny) Streptomyces clavuligerus (kys. klavulanová) biosyntéza: základní prekurzory = 3 aminokyseliny L-cystein L-valin α-amino-adipová kyselina rezistence inaktivace atb (β-laktamázy) změna struktury cílového místa (PBP) narušení transportu (mutace porinových kanálků) aktivní transport ven z buňky P. chrysogenum

54

55 β-laktamy: peniciliny základní, přirozené antistafylokokové širokospektré penicilin G, penicilin V oxacilin, meticilin, cloxacilin, flucloxacilin aminopeniciliny ampicilin, amoxicilin karboxypeniciliny ticarcilin acylureidopeniciliny piperacilin základní: penicilin V acidorezistentní penicilin G není acidorezistentní - nejsou odolné vůči β laktamázám - léky první volby u infekcí způsobených streptokoky, pneumokoky, stafylokoky, Bacillus anthracis

56 β-laktamy: peniciliny základní, přirozené antistafylokokové širokospektré penicilin G, penicilin V oxacilin, methicilin, cloxacilin, flucloxacilin aminopeniciliny ampicilin, amoxicilin karboxypeniciliny ticarcilin acylureidopeniciliny piperacilin antistafylokokové: - odolné vůči β laktamázám - streptokoky a stafylokoky - methicilin pouze parenterálně - oxacilin perorálně u méně závažných stafylokokových infekcí

57 β-laktamy: peniciliny základní, přirozené antistafylokokové širokospektré penicilin G, penicilin V oxacilin, methicilin, cloxacilin, flucloxacilin aminopeniciliny ampicilin, amoxicilin karboxypeniciliny ticarcilin acylureidopeniciliny piperacilin aminopeniciliny: - semisyntetické - nejsou odolné vůči β laktamázám - krom G+ i některé G- (Listeria monocytogenes) - ampicilin absorpce omezována potravou - amoxicilin kompletní absorpce po perorálním podání

58 β-laktamy: peniciliny základní, přirozené antistafylokokové širokospektré penicilin G, penicilin V oxacilin, meticilin, cloxacilin, flucloxacilin aminopeniciliny ampicilin, amoxicilin karboxypeniciliny ticarcilin acylureidopeniciliny piperacilin karboxypeniciliny: - široké spektrum účinku - částečně i proti Ps. aeruginosa - nejsou odolné vůči β laktamázám acylureidopeniciliny: - proti enterokokům, Ps. aeruginosa - nejsou odolné vůči β laktamázám

59 nežádoucí účinky: β-laktamy: peniciliny - možnost alergické reakce alergenem většinou biodegradační produkty - anafylaktický šok, kožní vyrážky - enteritidy (přerůstání stafylokoků a kvasinek)

60 β-laktamy: cefalosporiny (5.) generace - zvyšování účinnosti na G- - postupně se zvyšuje odolnost vůči β laktamázám - většinou dobře snášeny, občas alergické reakce - sepse, infekce měkkých tkání, kůže, močových cest - Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Serratia, Enterobacter, E.coli, H.influezae

61 β-laktamy: monobaktamy - účinek pouze na aerobní G- - v klinické praxi pouze aztreonam - nevstřebává se v GIT, pouze parenterální podání - vstřebává se do tělesných tkání i tekutin - život ohrožující infekce

62 β-laktamy: karbapenemy - nejširší spektrum účinku mezi betalaktamy (G+, G- i pseudomonády, aeroby i anaeroby, včetně kmenů S. pneumonie vysoce rezistentních na penicilin) - většinou odolné vůči β laktamázám - výhradně parenterální podání - dobrý prostup tkáněmi a tekutinami (i mozkomíšní mok) - terapie život ohrožujících nákaz - léčba nemocničních infekcí vyvolaných multirezistentní mikroflórou - imipenem, meropenem

63 β-laktamy: inhibitory β-laktamáz - β-laktamázy mechanismus rezistence - použití v kombinaci s antibiotiky (co-amoxicilin, co-ampicilin) - rozšíření antimikrobiálního spektra kys. klavulanová - slabé antibiotikum - vazba na penicilinázy kódované plasmidem, na chromozomálně kódované cefalosporinázy neúčinná - co-amoxicilin účinek na kmeny rezistentní vůči amoxicilinu (stafylokoky, H.influenzae, Klebsiella pneumoniae ) sublaktam tazobaktam

65 Aminoglykosidy 1944 streptomycin, účinek proti mykobakteriím (tuberkulóza) základní struktura: 2-4 amino-sacharidy (resp. aminocyklitoly) streptomycin kanamycin gentamicin

66 Aminoglykosidy mechanismus: - ireversibilní vazba na 30S podjednotku - několikastupňový model účinku (blokování činnosti ribozomů, chybná translace, poškození membrán, zvyšování průniku atb) - působí především na G- (narušení integrity vnější membrány): Escherichia, Proteus, Enterobacter, dále Mycobacterium, brucely, pasteurely, ale i G+ stafylokoky produkce: Streptomyces griseus (streptomycin) Streptomyces fradie (neomycin) Micromonospora (gentamicin) biosyntéza: Streptomyces griseus monosacharidy z glukózy, klíčový intermediát myo-inositol, D- glukosamin, D-ribosa

67 Aminoglykosidy - nevstřebávají se střevním traktem, intravenosní nebo intramuskulární podání - vyšší toxicita vůči živočišným buňkám (při dlouhodobém podávání - ototoxicita, nefrotoxicita) strepromycin gentamicin tobramycin kanamycin amikacin (semisyntetický, nejúčinnější, nejpomalejší vývoj rezistence) mechanismy rezistence inaktivace atb (acetylace, adenylace, fosforylace) mutační změny na ribosomu znemožnění vstupu atb do buňky

69 Linkosamidy základní struktura: prolin vázaný amidovou vazbou na pyranosid klindamycin linkomycin

70 Linkosamidy mechanismus: - inhibice proteosyntézy (vazba na 30S, předčasná disociace peptydyl-trna z ribozomu) produkce: Streptomyces lincolnensis (linkomycin) biosyntéza: obě části zvlášť propylprolin z L-tyrosinu dále C3 a C5 cukry

71 Linkosamidy - nízká toxicita - alergické reakce vzácné - antistafylokoková antibiotika - účinné i na anaeroby linkomycin klindamycin - dobrá distribuce v těle - penetrace do kostí, kloubů a šlach - infekce kostí, měkkých tkání, dutiny břišní po chir. zákroku

73 Makrolidy základní struktura: makrocyklický laktonový kruh aglykon + sacharid (amino-, deoxy- sacharidy) nepolyenové makrolidy: aglykon = členný laktonový kruh polyenové makrolidy: aglykon = členný laktonový kruh často obsahují navíc i aromát nystatin etrytromycin

74 Makrolidy - nepolyenové mechanismus: - vazba na 50S podjednotku (blokování vzniku pept. vazby) - vysoká aktivita vůči G+, u G- obtížný průnik do buňky, některé účinné i proti mykoplasmatům - na eukaryotní b. nemají vliv, jiné vazebné místo na ribozomu produkce: Streptomyces Micromonospora biosyntéza: prekurzory krátké karboxylové kyseliny (propionát, acetát, glykolát, izobutyrát) řada typů reakcí - oxidace, redukce, epoxidace, acylace, methylace

75 Makrolidy - polyenové mechanismus: - místem účinku je cytoplasmatická membrána (selektivní účinnost membrány se sterolem) - účinné na eukaryotní b. (nystatin proti kvasinkám) - účinek i na vnitrobuněčné m. (mitochondrie, lysozomy) produkce: Streptomyces sp. biosyntéza: podobná jako u nepolyenových makrolidů aglykon, cukerná část i aromát samostatná syntéza

77 Tetracykliny základní struktura: oktahydrotetracen-2-karboxiamidový řetězec chlortetracyklin tetracyklin

78 Tetracykliny mechanismus: - inhibice proteosyntézy - vazba na 30S podjednotku - bakteriostatický účinek produkce: Streptomyces aureofaciens (chlortetracyklin, tetracyklin) Streptomyces rimosus (oxytetracyklin) biosyntéza: 8x acetyl-coa 1x Asp

79 Tetracykliny široké spektrum účinku: G- i G+, Vibrio cholerae, některé anaeroby, mikroplazmata, chlamydie, rickettsie bakteriostatický účinek nevýhoda častý výskyt rezistence (často u Enterobacteriaceae) nežádoucí účinky: podráždění GIT, fotosenzitivní alergické reakce, ukládání v rostoucích kostech a zubech (léčba vyloučena u malých dětí a těhotných) Mechanismus účinku 30S podjednotka Mechanismus rezistence eflux

80 Biosyntéza polyketidů makrolidy, tetracykliny polyketid synthetasy (PKS) - multienzymové komplexy opakující se moduly složené ze souboru domén nesoucích aktivní místa pro postupnou aktivaci, modifikaci a elongaci zákl. jednotky obvykle acetyl-coa, malonyl-coa postupně narůstající řetězec vázán na tzv. pantetheinové raménko po syntéze další úpravy (cyklizace, laktonizace, tvorba amidových vazeb)

81 Biosyntéza polyketidů Figure 1: The most intensively studied PKS, deoxyerythronolide B synthase (DEBS), which catalyzes the key steps in the biosynthesis of the antibiotic erythromycin. DEBS catalyzes the extension of a propionate starter unit with six equivalents of methylmalonyl-coenzyme A (MM-CoA). After six rounds of decarboxylative Claisen condensations and varying degrees of reduction of the initially formed β-keto thioesters, the polyketide core of erythromycin is released from the enzyme via a terminal esterase [6-8]. Abbreviations: AT: acyltransferase, ACP: acyl carrier protein, KS: ketosynthase, KR: ketoreductase, DH: dehydratase, ER: enoylreductase, TE: thioesterase.

83 Polypeptidy základní struktura: peptid (10-15 ak), často cyklický atypické ak (amino-, hydroxy-, D-) produkce: rod Bacillus neribosomální syntéza!!! syntéza na multienzymovém komplexu peptidový řetězec na komplex vázán kovalentně přes fosfopantetein široká substrátová specifita rozsáhlá skupina látek se zcela odlišnou aktivitou: gramicidiny bacitraciny polymyxiny

84 Polypeptidy - gramicidiny mechanismus účinku: ionofory ovlivnění přenosu K + přes membránu, odčerpání iontů z buňky, zastavení proteosyntézy produkce: Bacillus brevis - heterogenní směs gramicidinu A (80%), B, C = gramicidin D - gramicidin D lineární, gramicidin S cyklický

85 Polypeptidy - gramicidiny Gramicidin S příklad neribosomální syntézy peptidu s antimikrobiálním účinkem

86 Gramicidin S produkce: Bacillus brevis cyklický dekapeptid složený ze dvou identických pentapeptidů

87 Gramicidin S syntéza katalyzována enzymovým komplexem Gramicidin S syntetáza (GS syntetáza) skupina neribosomálních peptidových syntetáz (NRPS) komplex tvořen dvěma NPRS: lehký enzym GrsA (127 kda) těžký enzym GrsB (510 kda)

88 Gramicidin S ATP aktivuje jednotlivé AK aminoacyladenylát Lehký enzym katalyzuje aktivaci a racemizaci L-fenylalaninu na D-fenylalanin Těžký enzym aktivuje ostatní aminokyseliny Aminoacyly jsou přeneseny na specifická thiolová místa obou enzymů Thioesterově navázané aminokyseliny se postupně spojují a tvoří pentapeptid Kondenzací 2 pentapeptidů se tvoří GS

89 Gramicidin S 2 L-fenylalanin 2 L-prolin 2 L-valin + 10 ATP GS + 10 ADP + 10 PP i 2 L-ornitin 2 L-leucine A adenylation PCP peptidyl carrier protein E epimerization C condenzation TE thioesterase domain (uvolnění nebo cyklizace)

90 Gramicidin S Gamicidin Soviet 1942 SSSR peptidové antibiotikum účinný na široké spektrum G+ i G- a některé plísně již v nízkých koncentracích způsobuje hemolýzu nelze použít k léčbě systémových infekcí léčba povrchových ran součást topických antibiotických přípravků

91 Polypeptidy - bacitraciny - produkce: Bacillus subtilis - inhibice syntézy buněčné stěny (blokování fosfolipidového přenašeče peptidoglykanové podjednotky baktoprenol) - baktericidní - účinek na G+ včetně MRSA - silně toxický - pouze lokální použití (obchodní n. framykoin) bacitracin

92 Polypeptidy - polymyxiny Kolistin (polymyxin E) Polymyxin B Vazba na LPS vnější membrány, průnik k CM, vazba na fosfolipidy dezintegrace hydrofobní řetězec zásadní úloha "detergent-like" efekt

93 Polypeptidy - polymyxiny - produkce: Bacillus polymyxa - baktericidní účinek - účinek na G- : E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae - klinické použití multirezistentní Ps. aeruginosa - neurotoxicita, nefrotoxicita atb poslední volby

95 Glykopeptidy základní struktura: hepta-peptid + cukerná složka teicoplanin - semisyntetický vankomycin

96 Glykopeptidy mechanismus: - inhibice syntézy buněčné stěny (vazba na koncový peptid D-Ala- D-Ala), znemožnění zesítění - baktericidní účinek produkce: Streptomyces orientalis (vankomycin) teicoplanin semisyntetický derivát biosyntéza: peptidová část - neribosomálně

97 Glykopeptidy Syntéza proteinové části vankomycinu: adenylation (A) domain peptidyl carrier protein (PCP) domain condensation (C) or elongation domain modification domains: epimerization (E) domain, thioesterase domain (TE)

98 Glykopeptidy - účinné na G+ : stafylokoky (včetně MRSA), streptokoky, Bacillus, Listeria monocytogenes - nevstřebávají se v GIT parenterální aplikace - ototoxicita, nefrotoxicita, neurotoxicita - vankomycin atb. poslední volby - život ohrožující infekce G+ bakteriemi, které neodpovídají na méně toxická antibiotika Mechanismus rezistence k vankomycinu

100 Chinolony / fluorochinolony základní struktura: kys. nalidixová ciprofloxacin

101 Chinolony / fluorochinolony mechanismus: - inhibice syntézy NA zablokování DNA-gyrázy produkce: syntetické atb. 1. generace (kys. nalidixová) 2. generace zavedení F (norfloxacin) 3. generace (ciprofloxacin) 4. generace (sparfloxacin) - široké spektrum účinku Ps. aeruginosa, Enterobacteriaceae, stafylokoky, chlamydie, mykoplasmata, méně na streptokoky

103 Sulfonamidy základní struktura: odvozené od sulfanilamidu mechanismus: analogy PABA (metabolismus kys. listové) produkce: syntetické atb. účinné proti E.coli, streptokokům, hemofilům, aktinomycetám, chlamydiím nekomplikované infekce močových cest, toxoplasmóza v kombinaci s trimetoprimem (kotrimazol)

105 Chloramfenikol (amfenikoly) základní struktura: nitrobenzenové jádro mechanismus: - inhibice proteosyntézy (50S podjednotka, inhibice elongace) produkce: Streptomyces venezuelae (dnes výhradně synteticky) bakteriostatický účinek širokospektré (G+, G-, anaeroby) chloramfenikol vysoká toxicita omezené využití (břišní tyfus, těžké anaerobní infekce, meningitidy)

106 základní struktura: Rifampicin (ansamyciny) rifampicin (USA rifampin) mechanismus: - inhibice RNA-polymerázy produkce: Amycolatopsis rifamycinica (řád Actinomycetales) účinný na G+, Mycoplasma tuberculosis, některé G- (Legionella) léčba tuberkulózy a lepry

107

108 Úvod, historie Klasifikace Mechanismy účinku, zásahová místa Rezistence Skupiny atb podle chemické struktury Metodika stanovení citlivosti, hodnocení účinku

109 Metodika stanovení citlivosti - do jaké míry je mikroorganismus k atb citlivý kvalitativní (ano-ne) kvantitativní (MIC) MIC - minimální inhibiční koncentrace = nejnižší koncentrace, která brání viditelnému růstu mo MBC - minimální baktericidní koncentrace = nejnižší koncentrace, která usmrtí nejméně 99,9% buněk

110 Metodika stanovení citlivosti metody: diskový difuzní test diluční test v bujonu diluční test v agaru E-test standardy: - mezní hodnoty - popis metodiky - referenční kmeny - předepsané spektrum atb CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute EUCAST The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

111 Co byste měli určitě znát? 1. Charakteristika sekundárního metabolismu 2. Zásahová místa antibiotik + příklady 3. Rezistence mechanismy, příklady (Van, Tet, β-laktamy), MRSA 4. Skupiny atb, u důležitých základní struktura β-laktamy kruh, 3 AK, cílové místo polyketidy syntéza na multienzymových komplexech polypeptidy neribosomální syntéza (gramicidin) glykopeptidy proteinová část neribosomálně (Van)

112 Antibiotika a chemoterapeutika obecně byla a jsou vlastně nejvýše malá nepříjemnost, episoda na dlouhé vývojové cestě bakterií, drobná překážka, se kterou se dokáží vyrovnat cit.: přednáška Jar. Spížka, MÚ AV ČR

113 Děkuji za pozornost.