Masarykova univerzita Lékařská fakulta LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA PREDIABETU A DIABETU POMOCÍ OGTT. Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA PREDIABETU A DIABETU POMOCÍ OGTT Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí diplomové práce: MUDr. Ingrid Wilhelmová Autor: Jana KLINEROVÁ Brno, duben 2015

2 Jméno a příjmení autora: Jana Klinerová Název bakalářské práce: Pracoviště: Vedoucí bakalářské práce: LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA PREDIABETU A DIABETU POMOCÍ OGTT Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně MUDr. Ingrid Wilhelmová Rok obhajoby bakalářské práce: 2015 Souhrn: Bakalářská práce zpracovává jedno z nejčastějších metabolických onemocnění v naší populaci diabetes mellitus, a to zejména z hlediska jeho laboratorní diagnostiky pomocí ogtt. V teoretické části práce je stručně popsán vznik a příčina onemocnění, jednotlivé typy diabetu a metody jejich stanovení. Praktická část práce se zabývá správným postupem při provádění ogtt, včetně vyhodnocení zátěžového testu. Experimentální část práce vychází ze sběru dat na OKB FN USA a hodnotí frekvenci záchytu obou forem prediabetu, diabetu a těhotenského diabetu. Téměř u 74 % pacientů odhalil test patologický nález. Klíčová slova: prediabetes, diabetes mellitus, laboratorní diagnostika, orální glukózový toleranční test Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Ingrid Wilhelmové a uvedla v seznamu literatury všechny literární a odborné zdroje. V Brně dne..

4 Děkuji paní MUDr. Ingrid Wilhelmové za odborné vedení mé bakalářské práce, za cenné rady, připomínky a čas, který věnovala konzultacím. Děkuji také pracovníkům Oddělení klinické biochemie FN u sv. Anny, za zodpovězení mých dotazů v oblasti přístrojové techniky.

5 Použité symboly a zkratky ADA American Diabetes Association (Americká diabetologická asociace) ATP Adenosine triphosphate (adenosintrifosfát) BMI Body Mass Index (index tělesné hmotnosti) ČDS Česká diabetologická společnost ČSKB Česká společnost klinické biochemie DM Diabetes mellitus EKK externí kontrola kvality FN USA Fakultní nemocnice u sv. Anny FPG Fasting Plasma Glucose (glukóza v plazmě žilní krve nalačno) G-6-PDH glukóza-6-fosfátdehydrogenáza GDM gestační diabetes mellitus HbA 1 glykovaný hemoglobin HBsAg Hepatitis B surface Antigen (povrchový antigen viru hepatitidy B) HCV Hepatitis C virus (virus hepatitidy C) HDL High density lipoprotein (vysokodenzitní lipoprotein) HIV I, II. Human Immunodeficiency Virus (virus lidské imunitní nedostatečnosti) HK hexokináza IFG Impaired Fasting Glucose (hraniční glykémie nalačno) IGT Impaired Glucose Tolerance (porušená glukózová tolerance) IKK interní kontrola kvality LIS laboratorní informační systém NAD(P) Nikotinamidadenindinukleotid(fosfát) Např. například NIS nemocniční informační systém ogtt orální glukózový toleranční test OKB Oddělení klinické biochemie PPG postprandiální plazmatická glukóza, glukóza v plazmě žilní krve za 2 hodiny po podání zátěžové dávky glukózy SWA Serum Work Area TK tlak krve Tzv. tak zvaný WHO World Health Organization (světová zdravotnická organizace)

6 Obsah 1 Úvod A. Teoretická část Historie diabetes mellitus Diabetes mellitus Glukóza Hladina glukózy v krvi Hormonální regulace Metabolické přeměny glukózy Klinické příznaky diabetu Léčba diabetu Klasifikace onemocnění Prediabetes Diabetes mellitus I. typu Diabetes mellitus II. typu Gestační diabetes mellitus Diabetes mellitus provázející jiné choroby Laboratorní diagnostika a sledování stavu pacientů Stanovení koncentrace glukózy v plazmě Metody stanovení koncentrace glukózy Hodnocení hladiny glykémie v plazmě Orální glukózový toleranční test ogtt Laboratorní diagnostická kritéria Sledování stavu nemocných B. Praktická část Cíl práce Preanalytická část orálního glukózového tolerančního testu

7 7.1 Mimolaboratorní preanalytická část Laboratorní preanalytická část Analytická část orálního glukózového tolerančního testu Modular Analytics Evo SWA Princip reakce Reagencie Kalibrace Interference metody Parametry metody Pracovní rozsah Kontrola kvality Postanalytická část orálního glukózového tolerančního testu C. Experimentální část Zpracování a vyhodnocení dat dospělých pacientů Popis souboru Frekvence záchytu prediabetu a diabetu pomocí ogtt Záchyt onemocnění prediabetes Záchyt onemocnění diabetes mellitus Frekvence záchytu gestačního diabetu mellitu pomocí ogtt Závěr Seznam použité literatury Přílohy

8 - 7-1 Úvod Diabetes mellitus neboli cukrovka je celoživotní onemocnění projevující se zvýšenou hladinou glukózy v krvi. Patří mezi metabolická onemocnění a souvisí s životním stylem, zejména nondependentní diabetes mellitus je označován za civilizační nemoc [4]. V posledních letech dochází k výraznému zvýšení výskytu diabetiků v naší populaci, příčinou je celosvětové stárnutí obyvatelstva, prodlužování života a nezdravý životní styl. Nezanedbatelný podíl na tom má také zlepšení diagnostiky diabetu, neustálé zkvalitňování lékařské pomoci, zlepšující se informovanost odborné i laické veřejnosti. Počet nově diagnostikovaných diabetiků navyšuje též úsilí Světové zdravotnické organizace a diabetologických společností o co nejčasnější záchyt jedinců s klinickými příznaky DM a vyhledávání rizikových osob v populaci [4,9,22]. Statistiky WHO i Světové federace diabetu pravidelně poskytují údaje o výskytu diabetu. Údaje z roku 2014 odhadují celosvětový počet diabetiků na 9 % dospělých ve věku nad 18 let. Ústav zdravotnických informací a statistiky ČR uvádí, že v roce 2013 dosahoval počet nemocných DM v České republice osob, z toho diabetiků II. typu, diabetiků I. typu a osob se sekundárním diabetem. Počet léčených diabetiků v ČR každým rokem stoupá [22,38,39]. Protože se jedná o onemocnění velmi časté s možností vzniku závažných komplikací v důsledku poškození funkce mnoha orgánů, je včasná diagnostika tohoto onemocnění nezbytná [3,22].

9 - 8 - A. Teoretická část 2 Historie diabetes mellitus Stavy, které připomínají dnešní pojetí diabetu, byly popsány již v roce 1552 před Kristem starověkými Egypťany v Ebersově papyru. Další písemné záznamy o této nemoci pochází ze starého Egypta, později i ze starého Řecka, Říma a arabských zemí. Sladká chuť diabetické moči byla známá již lékařům staré Číny a Indie. Ve 2. století nazvali Apolonius z Memfisu a Demetrios z Apamei onemocnění termínem diabetes (řecky uplynout, odtékat). Název diabetes doplnil přídavným jménem mellitus (latinsky medový, sladký) v 17. století Evropan Thomas Willis, který také upozornil na příčiny nemoci, dietní chyby a na podivuhodně sladkou moč. Ostrůvky buněk s vnitřní sekrecí v pankreatu objevil v roce 1869 Paul Langerhans, podle tohoto badatele byly později přejmenovány na Langerhansonovy ostrůvky [17]. Při obléhání Paříže v roce 1871 bylo zjištěno, že při nedostatku jídla a následného hladovění, ustoupil počet onemocnění diabetes mellitus. V roce 1889 Oskar Minkowsky a Joseph von Mering dokázali vztah mezi pankreatem a cukrovkou na základě svých pokusů se psy. V roce 1909 belgický lékař Jean de Meyer nazval hypotetický hormon, nezbytný pro metabolismus sacharidů vznikající v Langerhansonových ostrůvcích, insulin (insula latinsky ostrov). Zjistilo se, že příčina cukrovky spočívá v poškození endokrinní části pankreatu [2]. Dalších mnoho let se usilovalo, na základě experimentů, o izolaci dostatečně čisté látky produkované Langerhansonovými ostrůvky. Teprve v roce 1921 provedli Frederick Grant Banting a Charles Herbert Best extrakci inzulinu z psích a telecích slinivek. Inzulin zkoušeli Banting a Best nejprve na sobě. Prvním diabetikem léčeným inzulinem byl v lednu 1922 čtrnáctiletý chlapec Leonard Thompson [2]. V roce 1923 byla Bantingovi a Macleodovi za objevení inzulinu udělena Nobelova cena za fyziologii a medicínu [31]. Od té doby se onemocnění věnovalo mnoho odborníků a díky tomu se každý rok zdokonalovala a zlepšovala diagnostika a léčba diabetu. Právě za posledních 90 let bylo učiněno daleko víc objevů než v předchozím období a obrovský pokrok je zaznamenáván každý den.

10 - 9-3 Diabetes mellitus Diabetes mellitus je multifaktoriální onemocnění, při kterém je porušen metabolismus sacharidů. Tato porušená schopnost organismu hospodařit s cukrem, se projevuje nadměrným množstvím glukózy v krvi (hyperglykémií) [1, 3] Glukóza Pro lidské tělo je glukóza nezbytná. Patří do triády hlavních metabolických živin, spolu s tuky a proteiny. Představuje pro organismuss nepřetržitý zdroj energie, nutný pro správnou funkci všech orgánů. Glukóza je monosacharid ze skupiny aldohexóz a přirozeně se vyskytuje jako D-izomer. Sumární vzorec glukózy je C 6 H 12 O 6 a strukturní vzorec zobrazuje obrázek (Obr.1) [35]. Obr. 1. Strukturní vzorec glukózy [35] 3..2 Hladina glukózy v krvi Naměřené hodnoty koncentracee glukózy jsou různé podle toho, zda je měříme v séru, plazmě, žilní či kapilární krvi. Většina literárních dat považuje naměřenou hladinu glukózy v séru a plazmě za rovnocenné. WHO a ADAA v doporučení zmiňují pouze použití plazmy. V plazmě kapilární a žilní krve je na lačno stejná koncentrace glukózy. Po zátěži glukózou však může být rozdíl mezi koncentrací glukózy v kapilární a žilní krví i více než 25 %. Mezi koncentracemi glukózy v plné krvi a v plazmě jsou také významné rozdíly. Pokud je vzorek krve měřen bez ředění, rovná se hodnota glukózy v plazmě 0,94 násobku koncentrace glukózy v plné krvi. Jestliže je analýza prováděná se vzorkem krve zředěným hemolyzačním nebo deproteinačním činidlem je koncentrace glukózy v plazmě 1,11x větší než hodnota glukózy v plné krvi [24].

11 Koncentrace glukózy v krvi (glykémie) by měla být stále udržována v konstantním rozmezí. Může však nastat patologický stav, kdy je koncentrace glukózy v krvi výrazně snížena či zvýšena. Fyziologicky je koncentrace glukózy v krvi udržována v úzkém rozmezí hodnot 3,9-5,5 mmol/l nalačno a po jídle hodnota nepřesáhne 11 mmol/l [20,24]. Jako hypoglykémie se označuje pokles glykémie pod fyziologickou hranici. Většinou vzniká při diabetu jako akutní komplikace léčby inzulinem. K mírné hypoglykémie může dojít i u zdravých lidí, při nízkém příjmu potravy nebo vysoké tělesné zátěži. Hypoglykémie může být doprovázena pocením, nevolností, třesem, slabostí a pocitem úzkosti. Protože je při velmi nízké glykémii omezené zásobování mozkové tkáně glukózou, může dojít až k poruše vědomí. Nemocnému při vědomí pomůžeme podáním většího množství cukru, v bezvědomí lze do svalu injekčně aplikovat glukagon [1,16]. Glykémie zvýšená nad referenční rozmezí, je nazývána hyperglykémie. Nejčastějšími akutními projevy hyperglykémie jsou žízeň, nevolnost, únava, bolest břicha, rozostřené vidění a spavost. Hodnota koncentrace glukózy se běžně vyšetřuje pro riziko vzniku diabetes mellitus. Dlouhotrvající hyperglykémie organizmu nepřispívá a může způsobit až ireverzibilní poškození tělesných orgánů [16,17]. 3.3 Hormonální regulace Hospodaření s glukózou je řízeno několika hormony, zejména těmi produkovanými slinivkou břišní, ale na regulaci se podílí i adrenalin, kortizon a růstový hormon. Buňky Langerhansonových ostrůvků pankreatu produkují několik hormonů, z nichž nejdůležitější pro hospodaření s glukózou jsou inzulin, glukagon a somatostatin [5]. Inzulin je produkován β-buňkami pankreatu a vyplavuje se při zvýšené hladině glukózy v krvi (Obr.2), snížená hladina glukózy naopak sekreci inzulinu z pankreatu inhibuje. Inzulin snižuje glykémii několika mechanismy: zvyšuje propustnost buněčné membrány pro glukózu, v játrech zvyšuje její vychytávání a přeměnu na zásobní škrob glykogen a na triglyceridy, blokuje odbourávání jaterního glykogenu na glukózu a omezuje v játrech glukoneogenezi.

12 Obr. 2. Hormonální regulace glukózy po jídle [36] Naopak při snížené hladině glukózy v krvi (Obr.3), je sekretovaný α-buňkami pankreatu hormon glukagon a dření nadledvin katecholamin adrenalin. Tyto hormony stimulují katabolické a omezují anabolické procesy. Somatostatin, vylučovaný D-buňkami pankreatu, sekreci inzulinu inhibuje [5]. Obr. 3. Hormonální regulace glukózy v době hladovění [36]

13 Metabolické přeměny glukózy Metabolismus glukózy v lidském těle závisí na příjmu a spotřebě živin. Glukózu přijímáme potravou buď volnou, nebo jako součást disacharidů a polysacharidů. Cukry jsou absorbovány v tenkém střevě ve formě monosacharidů, poté vstupuje glukóza symportem se sodnými kationty do enterocytu. Do krve přestupuje glukóza aktivním transportem. Vrátnicovým systémem se glukóza dostává do jater, k jednotlivým orgánům a tkáním. Nadbytek glukózy přijaté potravou může být po přeměně na triacylglyceroly skladován v tukové tkáni. V těle může být glukóza syntetizována také z necukerných prekurzorů reakcemi glukoneogeneze (Obr.4) [4,13]. Syntéza glykogenu i glykogenolýza jsou regulovány převážně koncentrací glukózy v krvi a energetickými potřebami organismu. Metabolismus glykogenu je řízen metabolicky a hormonálně [13]. Glykolýza Glykolýza je hlavní cestou odbourávání glukózy. V těle probíhá při vysokých koncentracích glukózy v krvi (po jídle), je zodpovědná za utilizaci glukózy játry a snížení její koncentrace v krvi. Probíhá v cytosolu téměř všech buněk a slouží jako zdroj energie. Je to metabolický proces, při kterém je glukóza (dále jen C 6 H 12 O 6 ) přeměněna na dvě molekuly pyruvátu za čistého výtěžku dvou molekul ATP a dvou molekul NADH [13]. Glykolýza může probíhat za přítomnosti kyslíku (aerobní glykolýza) nebo bez kyslíku (anaerobní glykolýza). Počáteční společná cesta aerobního i anaerobního glykolytického odbourávání glukózy je stejná, přeměna glukózy na pyruvát (dále jen CH 3 -CO-COOH). Skládá se z deseti kroků, každý z nich katalyzuje jiný enzym [13]. Celkově ji můžeme popsat sumární rovnicí: C 6 H 12 O 6 + 2NAD + + 2ADP +2P 2 CH 3 -CO-COOH + 2NADH + 2H + + 2ATP Při anaerobní glykolýze, za nepřítomnosti kyslíku, je pyruvát (kyselina pyrohroznová) redukován na laktát (kyselina mléčná) enzymem laktátdehydrogenáza. Laktát se tvoří v erytrocytech a ve svalech za anaerobních podmínek a za náročné fyzické aktivity. Hromadění laktátu v buňkách a jeho přesun do krve vyvolá acidózu, která se projeví vyčerpáním a svalovou bolestí. Tento způsob získávání energie označujeme jako práce na kyslíkový dluh a může probíhat pouze po omezenou dobu. Pokud je opětovné zásobení svalu

14 kyslíkem dostatečné, část laktátu se přemění v játrech zpět na pyruvát a NADH, který je reoxidován v dýchacím řetězci [8]. V erytrocytech probíhá anaerobní glykolýza proto, že nemají mitochondrie a chybí jim dýchací řetězec. Zisk energie za anaerobních podmínek je malý, ale je rychlý a umožní dodávku energie i bez přístupu kyslíku [10,11]. Za přístupu kyslíku, při aerobní glykolýze, je pyruvát oxidačně dekarboxylován na acetyl- CoA. Podmínkou započetí oxidační dekarboxylace je, aby se vzniklý pyruvát dostal do mitochondrie, kde aerobní glykolýza probíhá. Tento složitý proces je katalyzován pyruvátdehydrogenázou, která je součástí komplexu, který je umístěn ve vnitřním povrchu mitochondriální membrány. Vzniklý acetyl-coa vstupuje do citrátového cyklu. Za aerobních podmínek vzniká při oxidaci jedné molekuly glukózy energie ve formě 38 molekul ATP [8]. Glykogenolýza Glukóza je v organismu ukládána ve formě glykogenu hlavně do jater a svalové tkáně. Glykogen je zásobním polysacharidem živočichů, který je syntetizován po přísunu živin do těla. Degraduje se při hladovění a výdeji energie, tím poskytuje organismu energii i v době mezi jídly. Glykogenolýza znamená štěpení polysacharidu glykogenu na glukózu a probíhá v cytoplazmě [10]. Obr. 4. Metabolické přeměny glukózy v játrech a ve svalech [36]

15 Klinické příznaky diabetu DM je chronické onemocnění, které se vyvíjí pozvolna. Hyperglykémie často probíhá u pacienta mírně nebo asymptomaticky i řadu let, aniž by byla odhalena. Proto může být pacientovi DM diagnostikován i přesto, že nejsou přítomny žádné klinické příznaky. Snahou je zachytit onemocnění již v této časné fázi a zabránit tak vzniku pozdních komplikací a ireverzibilního poškození orgánů. [2,37]. Dlouhodobě zvýšená hladina glukózy v krvi chronicky poškozuje krevní cévy. Důsledkem může být ateroskleróza, která podmiňuje změny ve větších cévách (makroangiopatie). Důsledkem aterosklerózy může být cévní mozková příhoda, infarkt myokardu i ischemická choroba dolních končetin. Poškození nejmenších cév (mikroangiopatie) se projevuje poruchami zraku, zhoršenou funkcí ledvin a poruchou nervové citlivosti končetin. Projevy makroangiopatie a mikroangiopatie jsou ze začátku nenápadné, postupem času však mohou vyústit v nevratné poškození životně důležitých orgánů. [2,37]. Mezi další příznaky neléčeného DM patří polyurie, kdy je denní diuréza vyšší než ml, dehydratace a polydipsie. V důsledku zvýšené proteolýzy a lipolýzy dochází k poklesu svalové hmoty a tukových zásob, což je příčinou ztráty hmotnosti, únavy i postupného tělesného chátrání. Můžeme pozorovat svědění kůže, pomalé hojení ran, větší kazivost zubů a bolesti břicha. Hyperglykémie se projevuje také přítomností cukru v moči (glykosurie) a přítomností acetonu v moči ( ketonurie) [2]. V některých případech mohou klinické příznaky pomoci odhalit onemocnění, ale často se jedná o pokročilé stádium nemoci. 3.6 Léčba diabetu Lidé s DM by měli dodržovat dietu pro diabetiky, která se podobá doporučením racionální stravy pro populaci s vysokým rizikem kardiovaskulárních komplikací. Doporučuje se také dostatečný pitný režim a přiměřená fyzická aktivita. Farmakologický způsob léčby spočívá v podání inzulinu (inzuliny lidské nebo inzulinová analoga), kdy je co nejpřesněji napodobena fyziologická sekrece lidského inzulinu ve slinivce břišní, nebo v podání perorálních antidiabetik [16]. Léčba onemocnění je složitá a celoživotní. DM nelze úplně vyléčit, ale léčbou se mohou výrazně omezit příznaky a poškození organismu. Podrobněji se léčbou zabývat nebudu, protože přesahuje rozsah mé práce.

16 Klasifikace onemocnění Onemocnění DM má několik forem i stádií, které je třeba rozlišit jak z důvodu prognostických, tak terapeutických. Poruchy glukózové homeostázy se podle etiologie rozlišují na prediabetes, DM I. typu, DM II. typu, těhotenský diabetes a DM provázející jiné choroby [3,14,17]. 4.1 Prediabetes Prediabetes je dnes považován za samostatnou klinickou jednotku s definovanou diagnostikou, patogenezí a klinickým obrazem. Predikuje rozvoj DM II. typu, současně nese výrazné kardiovaskulární riziko a mírně zvyšuje i riziko onkologického onemocnění. Proto by měl být prediabetický stav léčen, hlavně úpravou režimu a životního stylu, popř. podáváním léků. Prediabetes je asymptomatické onemocnění, charakterizované pouze laboratorními abnormalitami. Diagnostická kritéria jsou kvantitativní hodnota glykémie, glykovaného hemoglobinu nebo výsledek orálního glukózového tolerančního testu [1]. Prediabetes značí: náhodná glykémie 7,8 11,0 mmol/l glykémie nalačno 5,6 6,9 mmol/l glykémie za 2 hodiny po podání glukózy 7,8 11,0 mmol/l [24] Jako prediabetes se označuje hraniční glykémie nalačno a porucha glukózové tolerance, které tvoří přechodný stav mezi normálním stavem metabolizmu glukózy a manifestním diabetem. IFG je definována jako glykémie nalačno v žilní plazmě 5,6 6,9 mmol/l. Zvýšená glykémie nalačno je obvyklá spíše u pacientů středního věku s vyšší mírou obezity [24]. IGT je definována jako glykémie v žilní plazmě 7,8 11,0 mmol/l, 2 hodiny po podání zátěžové dávky glukózy. Nejčastěji se vyskytuje zejména u osob obézních, nemocných hypertriacylglycerolémií a hypertenzí. Přibližně třetina pacientů se v průběhu několik let stane diabetiky, zejména II. typu, třetina pacientů upravuje toleranci sacharidů do fyziologických hodnot a u třetiny porucha přetrvává. Většinou bývá spojena s hyperinzulinismem a inzulinovou rezistencí, což přispívá k rozvoji aterosklerózy. U těchto pacientů se častěji vyskytuje infarkt myokardu, ischemická choroba dolních končetin a mozkové cévní příhody.

17 Doporučuje se hlídat BMI v mezích normy, podstoupit vyšetření glykémie alespoň 1 krát ročně a ogtt se u nich opakuje každé dva roky. Ke screeningu prediabetu je možné použít i hodnotu glykovaného hemoglobinu [1,24]. Může nastat situace, kdy vyšetření svědčí pro tzv. kombinovanou poruchu, tedy kombinaci hraniční glykémie nalačno a porušené glukózové tolerance. 4.2 Diabetes mellitus I. typu Synonymem pro diabetes I. typu je insulindependentní DM, vzácně také juvenilní DM. Patří mezi polygenní autoimunitní choroby a je méně častou formou diabetu. Onemocnění tohoto typu postihuje jak děti, tak dospělé [2,20]. Genetická predispozice kombinovaná s určitými vnějšími faktory (toxiny, stres, virová infekce) může navodit prediabetickou fázi onemocnění, která trvá i několik let. V této době dochází k pomalé destrukci β-buněk Langerhansových ostrůvků zprostředkovanou aktivovanými T-lymfocyty a cytokiny, která se projevuje jako insulitis (lymfocytová infiltrace ostrůvkových buněk, zánět). Zánětem je postupně snižován počet funkčních β-buněk, což způsobuje poruchy syntézy a sekrece inzulinu. Nakonec dojde k jejich úplnému zániku a k nulové sekreci inzulinu z β-buněk. Osoba postižená tímto typem diabetu je po celou dobu onemocnění odkázána na substituční terapii inzulinem [2,20]. 4.3 Diabetes mellitus II. typu DM II. typu neboli non-insulindependentní DM, je převažující formou diabetu. U většiny pacientů je součástí onemocnění metabolický syndrom, kde se kromě příznaků DM objevují i obezita, hypertenze, dyslipidémie a zvýšené hladiny prokoagulantů. Nemocní jsou především ohroženi předčasnými kardiovaskulárními komplikacemi. Masově se vyskytuje hlavně u dospělých vyššího věku [4,20]. Tento typ diabetu je způsoben zvýšenou rezistencí na inzulin nebo relativním nedostatkem inzulinu. Mohou se vyskytovat normální nebo dokonce zvýšené hladiny vlastního inzulinu, ale tělo není schopno na inzulin adekvátně reagovat. Rezistence na působení inzulinu může být výsledkem sníženého počtu plazmatických membránových receptorů na cílových buňkách nebo následkem postreceptorové blokády nitrobuněčného metabolismu glukózy. Stupeň nedostatečnosti je odrazem postupné ztráty schopnosti β-buněk reagovat na glukózu. Porušený mechanismus odbourávání glukózy v organismu vede k hyperglykémii a následně ke vzniku možných komplikací [3,4,20].

18 Gestační diabetes mellitus Těhotenství vyvolává řadu metabolických změn, které mají zajistit optimální dostupnost nutrientů pro matku a vyvíjející se plod. To společně s hormonálními změnami zapříčiní vznik gestačního diabetu. Odhad prevalence diabetu u těhotných je 1,5 2 %. Tento typ diabetu se poprvé manifestuje v těhotenství. Nejvýznamnější komplikací je diabetická fetopatie: hypertrofie plodu, plicní nezralost, hypoglykémie, polycytémie. Cílem terapie je udržení normoglykémie a hladin glykovaných proteinů v normálních mezích v průběhu celé gravidity [4]. V naprosté většině případů gestační diabetes po porodu mizí. Pokud zvýšené hladiny glukózy přetrvávají i po ukončení těhotenství, je překlasifikován podle příznaků na jiný typ diabetu [4]. 4.5 Diabetes mellitus provázející jiné choroby K sekundárnímu diabetu dochází buď z důvodů snížené sekrece inzulinu při postižení pankreatu, nebo při toxickém zničení β-buněk ostrůvků, nebo při působení kontraregulačních hormonů či diabetogenních léků. Mohou také vznikat poškozením pankreatu zánětlivým procesem, kalcifikací, nádorovými změnami, resekcí nebo úrazy v oblasti slinivky břišní. U tohoto typu diabetu je velmi důležité, aby byla prokázána primární příčina diabetu a onemocnění bylo náležitě zaléčeno [2,18].

19 Laboratorní diagnostika a sledování stavu pacientů Včasná a správná diagnostika onemocnění je nezbytná k zahájení vhodné léčby a předchází tak vzniku chronických komplikací diabetu ještě v časné, reverzibilní fázi onemocnění. Vzhledem k narůstajícímu výskytu diabetu v naší populaci i vzhledem k jeho závažnosti je třeba provádět screening zaměřený na časný záchyt hyperglykémie. K diagnostice onemocnění slouží jak laboratorní vyšetření, tak i zhodnocení klinických příznaků pacienta (kap. 3.4). Tato práce se zabývá diagnostikou laboratorní [16,20]. V České republice se laboratorní diagnostika DM provádí na základě výsledků vyšetření lačné glykémie, náhodné glykémie a ogtt. Stanovení koncentrace glukózy v žilní plasmě je základním prostředkem pro diagnostiku DM, ale i pro vyhledávání rizikových jedinců v populaci. K vyšetření pomocí ogtt se dostane jen část pacientů, kterým byl tento test doporučený ošetřujícím lékařem, u nichž nebyly závěry z vyšetření FPG jednoznačné [16,18]. Při diagnostikování diabetu je vždy potřeba brát v úvahu aktuální stav pacienta, protože hladina glykémie může být přímo ovlivněna stresovými situacemi nebo současně probíhajícím onemocněním v době provádění testů [16,20]. 5.1 Stanovení koncentrace glukózy v plazmě Kontrola glykémie se provádí jednou za 2 roky u nerizikových jedinců jako součást preventivních prohlídek, jednou ročně u osob se zvýšeným rizikem onemocnění a okamžitě u osob se zjevnými příznaky diabetu (kap. 3.4) [16]. Mezi stavy se zvýšeným rizikem vzniku diabetu vhodné k provádění screeningu patří: nadváha a obezita (BMI > 25 kg/m 2 ) prvostupňový příbuzný diabetik arteriální hypertenze (TK > 140/90 mm rtuti) HDL cholesterol < 0,9 mmol/l a triacylglyceroly > 2,82 mmol/l porod dítěte s hmotností nad 4,5 kg porušená glukózová tolerance nebo porušená glykémie nalačno kardiovaskulární nebo cerebrovaskulární příhoda symptomy vedoucí k podezření na diabetes mellitus [16] Kontrola glykémie u těchto osob se provádí náhodně stanovenou glykémií v průběhu dne. Pokud je náhodně stanovená glykémie 11,1 mmol/l a jsou přítomny klinické příznaky,

20 diagnostikuje se DM. Pokud jedno z těchto kritérií chybí, provede se u pacienta vyšetření hodnoty glykémie za standardních podmínek nalačno. [20] Standardními podmínkami pro diagnostiku diabetu se rozumí stanovení koncentrace glukózy v žilní plazmě nalačno (FPG - Fasting Plasma Glucose). Koncentrace FPG je vhodná pro určení diagnózy DM a vyhledávání osob se zvýšeným rizikem DM. K určení diagnózy DM je nezbytné potvrdit výsledek opakovaným měřením z dalšího odběru v některém z příštích dnů [24]. Vyšetření se provádí po osmihodinovém lačnění s vyloučením větší fyzické aktivity a kouření cigaret den před odběrem. Při odběru má být pacient v klidové poloze. Periferní žilní krev se odebírá do odběrové nádobky s protisrážlivým činidlem, nejčastěji se jedná o EDTA s přídavkem fluoridu sodného. Fluorid sodný zpomaluje proces glykolýzy, která by mohla během preanalytické fáze ovlivnit naměřené hodnoty. Plazma musí být od krevních elementů oddělena do 60 minut [6,24] Metody stanovení koncentrace glukózy Koncentraci glukózy v krvi můžeme stanovit několika různými metodami. Metody stanovení koncentrace glukózy dělíme na enzymové, elektrochemické a stanovení pomocí glukometrů Metody enzymové Metody enzymové patří mezi velmi rozšířené metody. Glukózu můžeme stanovit pomocí každého enzymu, který ji metabolizuje. Metody s glukózaoxidázou Během stanovení dochází k oxidaci glukózy v analyzovaném vzorku pomocí enzymu glukózaoxidázy na glukonolakton a peroxid vodíku. Vzniklý peroxid vodíku se stanoví oxidační kopulací tzv. Trinderovou reakcí, při které reaguje peroxid vodíku s 4- aminoantipyrinem a fenolem (nebo jeho deriváty) v přítomnosti enzymu peroxidázy. Reakcí vznikne chinonmonoiminové barvivo, které stanovíme spektrofotometricky. Spektrometricky se sleduje nárůst absorbance barevného produktu, který je úměrný množství glukózy v analyzovaném vzorku [20].

21 Metody s hexokinázou Glukóza přítomná v analyzovaném vzorku je v přítomnosti adenozintrifosfátu (ATP) fosforylována pomocí enzymu hexokinázy na glukózo-6-fosfát a adenozindifosfát (ADP). Glukózo-6-fosfát je oxidován v přítomnosti NADP + na glukonolakton-6-fosfát. Současně dochází za katalytického působení enzymu glukóza-6-fosfátdehydrogenázy k redukci NADP + na NADH. Množství glukózy ve vyšetřovaném vzorku je úměrné absorbanci NADH při 340 nm [20]. Metody s glukózodehydrogenázou Glukóza je v přítomnosti NAD + oxidována pomocí enzymu glukózodehydrogenázy na glukonolakton a současně dochází k redukci NAD + na NADH. Sleduje se absorbance NADH při 340 nm, která je úměrná koncentraci glukózy v analyzovaném vzorku. Tento princip se příliš nevyužívá [20] Metody elektrochemické Metody založené na zkoumání procesů probíhajících na rozhraní elektrod a elektrolytu. Biosenzory s membránou se zakotvenou glukózaoxidázou Enzym glukózaoxidáza katalyzuje oxidaci glukózy na glukonolakton a peroxid vodíku. Vzniklý peroxid vodíku oxiduje na platinové elektrodě elektrometrického článku. Biosenzory pracují na ampérometrickém principu, tedy velikost proudu je přímo úměrná koncentraci glukózy ve vyšetřovaném vzorku [20]. Elektochemických metod s detekcí specifickými enzymovými metodami je v současnosti využíváno glukometry. Glukometr je přístroj určený pro měření hladiny glukózy v krvi zejména v domácím prostředí, u lůžka pacienta nebo přímo v ordinaci u lékaře. Alternativní cestou monitorování glykémie může být použití senzorů implantovaných do podkoží, kterými jsou data přenášena radiově [15,20] Hodnocení hladiny glykémie v plazmě Diagnostická kritéria pro FPG, která byla přijatá Českou společností klinické biochemie a Českou diabetologickou společností v červenci 2005 od ADA, platí dodnes (Tab.1) [27].

22 Vyloučení DM Porušená glukózová tolerance Potvrzení DM FPG (mmol/l) < 5,6 5,6 6,99 7 Tab. 1. Referenční rozmezí koncentrace glukózy Pokud u pacienta zjistíme FPG nižší než 5,6 mmol/l a pacient nemá klinické příznaky, můžeme prediabetes a DM vyloučit. Jestliže se naměřená glykémie nalačno pohybuje v rozmezí 5,6 6,9 mmol/l, jedná se o hraniční glykémii nalačno a je vhodné doporučit provedení ogtt. Při naměřené hodnotě FPG 7 mmol/l se pravděpodobně jedná o DM, ale diagnózu je třeba potvrdit opakovaným odběrem. Diagnózu DM stanovíme, je-li hodnota FPG při opakovaném odběru opět 7 mmol/l. Pokud se nález nepotvrdil a druhá naměřená hodnota FPG je < 7 mmol/l, doporučuje se provést ogtt [24]. U těhotných jsou hodnoty glykémie pro hodnocení poněkud odlišné. Hodnota FPG 5,6 mmol/l značí GDM, ale pro vyslovení diagnózy je nutné hodnotu potvrdit opakovaným odběrem. Pokud je další glykémie nalačno < 5,6 mmol/l, doporučuje se provést ogtt (Obr.6) [24]. Vyloučení DM Potvrzení DM FPG (mmol/l) < 5,6 5,6 Tab. 2. Referenční rozmezí koncentrace glukózy u těhotných 5.2 Orální glukózový toleranční test ogtt Orální glukózový toleranční test je funkční test, který se používá jako vyšetřovací metoda k diagnostice onemocnění diabetes mellitus, gestačního diabetu a porušené glukózové tolerance. Provádí se, pokud diagnóza nebyla jednoznačně určena klinickými příznaky a opakovaným vyšetřením hodnoty FPG [14,19]. Při DM a IGT organismus nedokáže dostatečně zpracovat přijatý cukr. OGTT je odrazem reakce organismu na podání glukózy a hodnotí, zda je organismus schopen se s touto zátěží glukózou vyrovnat a udržet její hladinu v krvi ve fyziologickém rozmezí. Výsledky testu

23 podávají informaci nejen o účincích hormonů regulujících glykemii, ale také o procesech probíhajících v gastrointestinálním traktu a o jaterních funkcích [12,14,20]. Test bude podrobněji popsán v praktické části práce. 5.3 Laboratorní diagnostická kritéria Laboratorní diagnostická kritéria pro diabetes mellitus (Obr. 5) (musí platit alespoň jedno z kritérií) glykémie v plazmě 11,1 mmol/l společně s klinickými příznaky (žízeň, polyurie, polydipsie, ) FPG 7,0 mmol/l (opakovaně) PPG 11,1 mmol/l [16,24] Obr. 5. Algoritmus pro laboratorní screening DM [24]

24 Laboratorní diagnostika gestačního DM (skupiny podle rizika onemocnění GDM) 1. vysoce rizikové (s přítomností alespoň 2 rizikových faktorů: BMI > 25, diabetes v příbuzenstvu I. stupně, porucha glukózové tolerance, porod plodu o hmotnosti vyšší než 4 kg v minulosti, glykosurie) doporučuje se vyšetřit glykémii v plazmě nalačno co nejdříve v prvním trimestru a pokud zjistíme koncentraci glukózy: do 5,6 mmol/l, provedeme ogtt co nejdříve, při normálním výsledku opakujeme test ve týdnu gravidity vyšší než 5,6 mmol/l, opakujeme vyšetření glykémie nalačno nejlépe následující den, diagnózu GDM určíme při opakujícím se výsledku [16,29,30] 2. s průměrným rizikem dříve všem těhotným ženám (ogtt provedeme ve týdnu gravidity). Gestační DM je laboratorně diagnostikován, je-li dosaženo alespoň jednoho z následujících kritérií: glykémie nalačno 5,6 mmol/l (opakovaně) glykémie za 2 hod po podání testovacího nápoje 7,7 mmol/l automaticky při nějaké poruše metabolismu glukózy (porušená glukózová tolerance, zvýšená glykémie nalačno) před těhotenstvím (Obr.6) [24,30]. Obr. 6. Algoritmus pro laboratorní screening GDM do [24]

25 Těmito kritérii se řídili laboratoře a lékaři až do února tohoto roku, proto v této práci také pracuji s těmito referenčními hodnotami [24]. Dne uveřejnili ČSKB a ČDS nová kritéria k hodnocení ogtt u těhotných. (Obr.7). Měří se koncentrace glukózy v plazmě před zátěží, 1 a 2 hodiny po zátěži. Gestační diabetes je laboratorně diagnostikován, je-li dosaženo aspoň jednoho ze tří kritérií: FPG 5,1 mmol/l glukóza po 1 hodině 10,0 mmol/l glukóza po 2 hodinách 8,5 mmol/l [23,25] OGTT se provádí ve týdnu gravidity u všech těhotných žen, u nichž byl screening GDM na začátku těhotenství negativní [25,29]. Obr. 7. Algoritmus pro laboratorní screening GDM od dne [23]

26 Sledování stavu nemocných Pokud je porucha metabolismu glukózy diagnostikována, je vhodné kontrolovat zdravotní stav pacientů laboratorními testy. Sleduje se tak úspěšnost kompenzace onemocnění. V zahraničí slouží doteď, nebo dříve sloužily některé následující metody i k diagnostice onemocnění. Stanovení glykovaného hemoglobinu Koncentrace HbA 1 v krvi je rutinní a nejefektivnější nástroj sledování průběhu DM. Hodnotu HbA 1 je možno použít v rámci screeningu prediabetu. Představuje vhodný způsob kontroly koncentrací glukózy u diabetiků, neboť je považována za její vážený dlouhodobý průměr [24,33]. Americké ministerstvo zdravotnictví a sociálních věcí uvádí, že k diagnostice může být použito kromě FPG a ogtt i HbA 1. V USA vyšetření HbA 1 slouží ke zjištění diabetu II. typu a prediabetu, ale není vhodný pro diagnostiku diabetu I. typu a GDM. U nás v České republice se k diagnostice nepoužívá, slouží k posouzení úspěšnosti kompenzace diabetu v období 4 8 týdnů před vyšetřením [33,13]. Glykovaný hemoglobin vzniká neenzymovou reakcí mezi hemoglobinem a glukózou v krvi. Protože je jeho tvorba ireverzibilní, odráží koncentraci glukózy v krvi po celou dobu existence erytrocytu. [13,20]. Množství glykovaného hemoglobinu se stanoví jako poměr (%) absorbancí glykovaného hemoglobinu HbA 1 a celkového hemoglobinu, změřeného při stejné vlnové délce 415 nm. Absorbanci glykovaného hemoglobinu změříme z roztoku odděleného po smíchání hemolyzované krve s katexem, při ph 6,9. Tímto se neglykovaný hemoglobin navazuje na iontoměnič, zatímco glykovaný hemoglobin zůstává díky negativnějšímu náboji volný v roztoku [13,20]. Referenční interval zdravých dospělých je mmol/mol. Kompenzace diabetu se hodnotí těmito kritériemi: výborná kompenzace < 43 mmol/mol uspokojivá kompenzace mmol/mol neuspokojivá kompenzace > 53 mmol/mol U nás se glykovaný hemoglobin vyšetřuje u diabetiků I. typu jednou za 3 měsíce a u diabetiků II. typu nejméně dvakrát ročně [13,20,24].

27 Stanovení glukózy v moči Stanovení glukózy v moči není v České republice doporučeno pro diagnostiku ani pro sledování pacientů s diagnózou DM. Může být však jedním z klinických příznaků onemocnění, což spolu se zvýšenou glykémií vede k podezření DM. Negativní nález glukózy v moči však onemocnění nevylučuje. Vyšetření má význam také pro určení denních ztrát glukózy močí [20,23]. Za normálních okolností se vyskytuje v moči jen nepatrné množství glukózy, které se běžně používanými testy neprokáže. Ke zvýšenému vylučování glukózy močí dochází při hyperglykémii (nejčastěji kolem 10 mmol/l, tzv. renální glukózový práh), když je překročena maximální schopnost buněk proximálního tubulu resorbovat glukózu z glomerulárního filtrátu. Při hodnotách glukózy v moči > 0,8 mmol/l se jedná o glukosurii [20]. Specifický průkaz glukózy v moči lze provést diagnostickými proužky, např. glukophan, kdy je zkouška od koncentrace 2 mmol/l glukózy v moči zřetelně pozitivní [20]. Stanovení ketolátek v moči Stanovení ketolátek v moči má význam pro diagnózu diabetické ketoacidózy. Ketolátky se stanovují u diabetických pacientů s hodnotou glukózy nad 16,7 mmol/l a také při výskytu klinických příznaků diabetické ketoacidózy [23]. Průkaz ketolátek v moči má význam především u diabetiků I. typu. U správně léčeného diabetika v moči ketolátky nenacházíme. Vylučování ketolátek je za normálních okolností nepatrné (< 0,5 mmol/den). Ke zvýšenému vylučování ketolátek močí dochází díky zvýšené produkci ketolátek v organismu, v důsledku zvýšeného zužitkování tuků, současně s nedostatečným využitím glukózy [20]. Stanovení albuminu v moči U diabetiků je kvantitativní stanovení výdeje albuminu močí zařazeno jako základní metoda, která informuje o rozvíjející se diabetické nefropatii. Vyšetřovat mikroalbuminurii je doporučeno u pacientů s DM I. typu od pátého roku od zjištění diagnózy diabetu každý rok a u pacientů s DM II. typu je doporučeno provádět vyšetření 1x ročně [23]. Vylučování albuminu močí u zdravých osob obvykle nepřekročí hodnotu 30 mg/den. Ke zvýšené extrakci proteinů se střední molekulovou hmotností, tedy i albuminu, dochází již při malém zvýšení permeability bazální membrány glomerulů. Běžnými testy na proteinurii prokážeme množství albuminu až nad 100 mg/l, malé množství albuminu v moči (mikroalbuminurie) ještě není běžnými testy prokazatelné. Včasné odhalení mikroalbuminurie

28 je důležité pro odhalení nefropatie ještě v reverzibilní fázi. Koncentraci albuminu v moči stanovujeme imunoturbidimetricky nebo imunonefelometricky. [20,21]. Stanovení autoprotilátek Stanovení autoprotilátek není doporučeno jako nástroj pro diagnózu DM, ale je vhodný při podezření na autoimunitní původ diabetu. Slouží zejména při podezření na pomalu progredující DM I. typu. Protilátky jsou často prokazatelné dříve, než se klinicky projeví onemocnění [23]. U těchto nemocných tedy můžeme v séru prokázat řadu autoprotilátek. Nepřítomnost autoprotilátek ale toho onemocnění nevylučuje. Destrukci β-buněk nepůsobí autoprotilátky, ale aktivované T-lymfocyty a makrofágy. V séru diabetiků můžeme stanovit protilátky proti Langerhansovým ostrůvkům, protilátky proti glutamátdekarboxyláze a protilátky proti inzulinu [14].

29 B. Praktická část Ve FN u sv. Anny v Brně se test provádí na Oddělení klinické biochemie. Laboratorní diagnostický proces zahrnuje preanalytickou část, analytickou a postanalytickou část. Preanalytickou část vyšetření můžeme dále rozdělit na dvě části a to mimolaboratorní a laboratorní. Aby nám výsledky testu přinesly odpovídající a dále hodnotitelné informace, musíme dbát na dodržování pracovního postupu a předepsaným pokynů.

30 Cíl práce Cílem mé práce je zpracovat údaje veškerých pacientů, kteří byli odesláni k vyšetření ogtt na OKB FN USA během jednoho roku. Sledovat budu pohlaví, věk a závěrečné vyhodnocení zátěžového testu. Při zpracování dat zhodnotím frekvenci záchytu obou forem prediabetu, diabetu a těhotenského diabetu při provádění ogtt. V praktické části se podrobněji zaměřím na správný postup při provádění ogtt. Budu sledovat dodržování předepsaných pokynů na všech úrovních testu od samotných pacientů a jejich ošetřujících lékařů až po pracovníky OKB FN USA.

31 Preanalytická část orálního glukózového tolerančního testu Preanalytická část může významně ovlivnit výsledky laboratorního stanovení, proto ji laboratoř musí trvale sledovat a případné nedostatky preventivně odstraňovat [5]. 7.1 Mimolaboratorní preanalytická část Do mimolaboratorní preanalytické části patří příprava pacienta k odběru biologického materiálu, odběr, identifikace materiálu a jeho transport do laboratoře [5]. Indikace a kontraindikace k vyšetření Doporučení k provedení vyšetření pomocí ogtt předepisuje ošetřující lékař. Test je možné provádět u pacientů od patnácti let věku. U těhotných žen doporučení k vyšetření vydává gynekolog. Většinou je vyšetření doporučováno u jedinců s výskytem diabetu v rodině, u obézních pacientů a u pacientů s vysokým krevním tlakem. Nejpočetnější skupinu tvoří pacienti, u kterých lékař v laboratoři 2x po sobě zachytil hladinu FPG v rozmezí 5,6 6,9 mmol/l. Test se používá také u pacientů s hodnotou glykémie nalačno nižší než 5,6 mmol/l, u nichž je podezření na IGT z předchozích vyšetření, nebo pokud se jedná o jedince se zvýšeným rizikem vzniku DM. U těhotných žen se doporučuje ogtt provádět ve týdnu gravidity a u rizikových žen co nejdříve v prvním trimestru. Test slouží k zjištění diagnózy, v žádném případě neslouží ke sledování dalšího průběhu cukrovky [24]. Kontraindikací k provedení testu je opakovaný výsledek koncentrace glukózy v plazmě žilní krve nalačno 7 mmol/l a postprandiálně nad 11 mmol/l. Test se neprovádí také při jasných klinických příznacích DM. Vyšetření je odloženo i po noční směně a v době akutního onemocnění nebo do 6 týdnů po něm a u žen při menzes [6]. Příprava pacienta před vyšetřením K dosažení potřebné diagnostické správnosti ogtt se vyžaduje, aby byl pacient lačný. To znamená, že před odběrem po dobu hodin nesmí jíst, pít slazené nápoje a kouřit. Minimálně 24 hodin před vyšetřením je nutné vynechat alkoholické nápoje včetně piva. 1-3 dny před vyšetřením by měl pacient konzumovat běžnou stravu bez omezení cukru. Běžná fyzická zátěž je povolena, ale je třeba vyloučit nadměrnou tělesnou námahu. Těsně před vyšetřením jsou zakázané noční směny. Pacient po dohodě s ošetřujícím lékařem vynechá ráno v den vyšetření léky, které vynechat lze. Pravidelně užívané léky mohou být užity, musí

32 se však zapít pouze čistou vodou a musí se nahlásit laborantce, která vyšetření provádí. Pokud se testovaný v den odběru, nebo i dříve, necítí zdráv, měl by se telefonicky odhlásit a test podstoupit až v době po úplném vyléčení, jinak je test zkreslený a nepodává správné informace. Dotazy týkající se testu jsou odpovězeny buď telefonicky, nebo při konzultaci s lékařem před a během vyšetření. Pacient s sebou přinese žádanku na vyšetření vyplněnou odesílajícím lékařem s uvedením poslední hodnoty hladiny FPG a písemnou informaci s pokyny k přípravě na vyšetření. Pacienti, kterým byl test doporučen, se telefonicky nebo osobně objednají na OKB FN USA. Při objednání uvedou informaci od ošetřujícího lékaře o předchozí glykémii nalačno. Jméno objednaného pacienta spolu s kontaktem na něj a poslední hodnotou FPG se zapíše do objednacího kalendáře na příjmu OKB. Pacienti se před provedením testu řídí písemně vydanými pokyny dle Laboratorní příručky. Testovaný pacient se ráno v den provádění testu dostaví v 6:45 hodin do odběrové místnosti laboratoře. Proškolená laborantka, určená k provádění ogtt, provede všechny potřebné administrativní úkony. Zkontroluje identifikaci pacienta podle karty zdravotní pojišťovny a prověří u pacienta dodržení podmínek před testem. Pokud zjistí nesrovnalosti v dokumentaci či klinickém stavu pacienta, konzultuje provedení ogtt s lékařem OKB. Laborantka zodpovídající za provedení testu zjistí, jaká byla u pacienta předchozí hodnota glykémie nalačno. Pokud byla 7 mmol/l (u těhotných 5,6 mmol/l), rozhodne o dalším postupu zodpovídající lékař za ogtt. Jestliže byla předchozí hodnota glykémie < 7 mmol/l (u těhotných < 5,6 mmol/l), nebo není předchozí hodnota glykémie známá, provede pověřená laborantka odběr krve z loketní žíly nalačno na stanovení glykémie a zavolá lékaře, který v ten den zodpovídá dle rozpisu za provedení ogtt. Lékař prověří splnění všech podmínek pro provedení testu a rozhodne, zda bude test proveden. V případě že ano, poskytne pacientovi všechny potřebné informace o postupu testu a zodpoví jeho případné dotazy. Pacient je poté vyzván k podpisu formuláře Souhlas s poskytnutím zdravotního výkonu [6]. Průběh vyšetření Pacientovi podáme standardní dávku glukózy a hodnotíme změnu glykémie. Takto funkční zkouškou ověříme účinnost regulace přeměny glycidů. Testační nápoj glukózy je komerčně dodávaný v tmavých lahvičkách z lékárny. Jedná se o Glucosum solutio CSC, firmy Dr. Kulich Pharma, s. r. o. (Obr.8). Každá lahvička obsahuje 75 g glukózy v 250 ml roztoku. Lahvička se má skladovat v temnu při teplotě C. Laborantka přelije obsah láhve do

33 - 32 jednorázového plastového kelímku a doplní do 300 ml pitnou vodou. Pacientovi acientovi podá kelímek roztoku glukózy a informuje informuje ho, že má nápoj vypít během 5 10 minut. Následně posadí pacienta do čekárny ambulance OKB a průběžně kontroluje, jak zátěžový test snáší a zda u něj nedochází k nežádoucím účinkům [6]. Mezi nežádoucí účinky, které se mohou dostavit, patří nauzea, nauzea, zvracení, průjmový stav. Zvracení je důvodem pro ukončení testu. Ve výjimečných mečných případech se může dostavit kolapsový stav. Po dvou hodinách od vypití zátěžového nápoje glukózy se může projevit posthyperglykemická hypoglykémie [12,20]. Po celé 2 hodiny, od vypití nápoje, je zakázáno jíst, pít, kouřit a pacient musí zůstat v čekárně pod dohledem laborantky zodpovídající za provedení ogtt. Pokud probíhá test bez komplikací, odebere laborantka po 120 minutách od vypití testačního nápoje druhý vzorek žilní krve krve na stanovení PPG, a tím ogtt končí. Před odchodem domů je pacientovi doporučeno sníst svačinu a chvíli setrvat v klidu, toto opatření má omezit výskyt hypoglykémie. Je mu také sděleno, že s výsledky testu ho seznámí lékař, který ho na test odeslal [6]. Obr. 8. Lahvička Glucosum solutio CSC, firmy Dr. Kulich Pharma, s. r. o.[28] o.[28 Odběry vzorků Během testu laborantka odebere krev pacientovi dvakrát, pokaždé musí být dodržen správný odběr dle předepsaných postupů v dokumentu FNUSA a OKB OKB. Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí.

34 Pacient při odběru sedí v odběrovém křesle. Místo odběru žilní krve z loketní jamky se potře dezinfekčním prostředkem na kůži a poté se provede odběr. Krev se odebírá jednorázovým odběrovým systémem do zkumavek s antiglykolytickými přísadami a antikoagulanciemi. Používají se zkumavky Sarstedt se žlutým uzávěrem na 2,7 ml krve. Tyto zkumavky obsahují jako antiglykolytickou přísadu fluorid sodný (NaF) a K 2 EDTA jako antikoagulancium [7]. Na zkumavku s odebranou krví se ihned označí identifikační údaje pacienta, datum, čas a odnesou ke zpracování do laboratoře. 7.2 Laboratorní preanalytická část Začíná příjmem biologického materiálu v laboratoři a kontrolou identifikačních údajů na žádance a odběrové nádobce. Požadavek na ogtt se zadá do LIS ručně v případě papírové žádanky, nebo načtením čárového kódu na elektronické žádance. Zkumavka s materiálem se při příjmu do laboratoře označí čárový kódem, který obsahuje potřebné identifikační údaje o vzorku a pacientovi, tento kód je automaticky vygenerován počítačovým systémem. Vizuálně se zkontroluje množství a kvalita vzorku. Vzorek se zpracovává ihned po příchodu do laboratoře, nejpozději však musí dojít k oddělení plazmy od krevních elementů do 60 minut od odběru. K oddělení složek plazmy se použije centrifugace. Plazma se centrifuguje při otáčkách 5 minut. Poté laborantka přepipetuje plazmu do jiné připravené a řádně označené zkumavky, kterou odnese k analyzátoru. Tato zkumavka s plazmou je připravena k analýze. Zkumavky krve, které jsou donášeny běžně do laboratoře s požadavkem na vyšetření hladiny glukózy, jsou zpracovány preanalytickou linkou a poté analyzátorem. Ke stanovení glukózy v rámci ogtt se používají zkumavky se žlutým uzávěrem, které nelze vložit do preanalytické linky, proto se centrifugace a pipetování plazmy provádí manuálně [7].

35 Analytická část orálního glukózového tolerančního testu V laboratoři OKB ve FN u sv. Anny v Brně se pro kvantitativní stanovení koncentrace glukózy ve vzorku séra nebo plazmy používá analyzátor Modular Analytics Evo SWA [7]. 8.1 Modular Analytics Evo SWA Biochemický analyzátor Modular SWA slouží ke kvantitativnímu stanovení koncentrace glukózy v séru, plazmě, moči, dialyzátu a likvoru [7]. Při práci s analyzátorem Modular SWA je nutné znát pracovní návod pro práci s analyzátorem Modular SWA, jeho preventivní údržbu a provozní řád v oblasti hygieny. Dále příbalové informace kalibrátoru i kontrolního materiálu firmy Roche s.r.o. a další související dokumenty [7,32,34]. S přístrojem musí pracovat pouze proškolený personál. Stav systémových roztoků kontroluje Modular SWA sám, pokud je potřeba výměna roztoků, upozorní personál alarmem [7]. Obr. 9. Modular Analytics Evo [32] 8.2 Princip reakce Na analyzátoru Modular SWA se stanovuje koncentrace glukózy spektrofotometricky. Rutinní metoda je určena pro enzymové stanovení glukózy metodou hexokináza. V první reakci spolu reaguje glukóza s ATP za vzniku glukózo-6-fosfátu a ADP. Reakce je katalyzována enzymem hexokinázou. Následně vzniklý glukózo-6-fosfát reaguje s NADP+, přičemž vzniká 6-fosfoglukonát a redukovaný koenzym NADPH. Reakce probíhá za katalýzy enzymu glukóza-6-fosfátdehydrogenáza. Vzniklý NADPH se detekuje fotometricky. Velikost naměřené absorbance NADPH při 340 nm je přímo úměrná koncentraci glukózy [7].

36 glukóza + ATP glukóza-6-fosfát + ADP (HK) glukóza-6-fosfát + NADP + 6-fosfoglukonát + NADPH (P-PDH) 8.3 Reagencie Potřebné reagencie jsou připraveny přímo k použití. Neotevřené jsou stabilní při 2 8 C do data expirace. Otevřené, na palubě přístroje, jsou stabilní po dobu 28 dní. V analyzátoru jsou uloženy v chlazeném prostoru pro reagencie, kde jsou chráněny před slunečním světlem a bakteriální kontaminací [7]. Činidlo 1 obsahuje: TRIS pufr 100 mmol/l, ph 7,8, Mg 2+ 4 mmol/l, APT 1,7 mmol/l, NADP 1,0 mmol/l, konzervanty. Činidlo 2 obsahuje: HEPES pufr 30 mmol/l, ph 7, Mg 2+ 4 mmol/l, HK (kvasinky) 8,3 U/ml, G-P-PDH (E.Coli) 15 U/ml, konzervanty. Reagenční roztoky potřebné pro prováděné reakce jsou uloženy v lahvičkách označených čárovými kódy. Roztoky jsou uloženy v pozicích vnějšího (R1) a vnitřního (R2) reagenčního kruhu [7]. 8.4 Kalibrace Ke kalibraci se používá přípravek Calibrator for automated systems firmy Roche. Kalibrační sérum je lyofilizované na bázi lidského séra. Kalibrátor byl připraven z krve dárců, kteří byli individuálně testovaní na přítomnost protilátek HBSAg, HCV, HIV I a HIV II. Musí se s ním zacházet podle pravidel bezpečnosti práce s biologickým infekčním materiálem. Jeho hodnota byla stanovena provedením testů v různých laboratořích, ve více nezávislých sériích. Koncentrace a aktivity přípravků byly vybrány tak, aby zajistily optimální kalibraci automatických analyzátorů. Specifické standardní hodnoty jsou stanoveny jako medián získaných hodnot. Kalibrátor se musí před použitím nejdříve připravit. Po otevření lahvičky kalibrátoru se přidají přesně 3 ml deionizované vody. Lahvička se uzavře a poté se 30 minut promíchává na laboratorní míchačce, aby se obsah rozpustil. Do eppendorfských zkumavek se připraví alikvoty o objemu 0,3 ml, které je možné uchovávat při teplotě -15 až -20 C. Přípravek se po

37 přidání rozpouštědla používá nejdříve za 2 hodiny. Pokud se uchovává zmražený, může se použít ihned po rozpuštění a promíchání. V lyofilizovaném stavu je kalibrátor stabilní do data uvedeného na obalu. Po rozpuštění kalibrátoru v deionizované vodě jsou složky stabilní 8 hodin při pokojové teplotě, 2 dny při 4 C a 1 měsíc při -20 C. Roztok smí být zmražen pouze jednou. Kalibrace je lineární, dvoubodová. Prvním bodem kalibrační funkce je fyziologický roztok, druhým bodem je kalibrátor se zadanou hodnotou koncentrace. Každý kalibrační bod se analyzuje dvakrát. Kalibrační data jsou automaticky tištěna a uschovávají se ve složce CALIBRATION LIST. Kalibrační funkce je vypočtena softwarem přístroje. Kalibrace se provádí denně před zahájením provozu, vždy po změně šarže činidel a v případě, kdy výsledky kontrolních vzorků neodpovídají zadaným kritériím správnosti [7]. 8.5 Interference metody Při stanovení glukózy v séru a plasmě neinterferuje bilirubin do 1026 µmol/l, hemolýza do indexu H = 621 (10 g/l), lipemie do indexu L = 1000 [7]. 8.6 Parametry metody Nastavení metody v analyzátoru: dvoučinidlová metoda Činidlo R1: 180,0 µl Činidlo R2: 36,0 µl Vzorek - sérum, plazma: 2,0 µl Čas trvání analýzy: 10 minut Vlnová délka - hlavní/vedlejší: 340/700 nm Typ reakce: 2 PointEnd Hodnoty koncentrace glukózy se vydávají na 1 desetinné místo v mmol/l [7]. 8.7 Pracovní rozsah Pracovní rozsah metody je 0,11 41,6 mmol/l. Pokud přesáhne výsledek hodnotu 41,6 mmol/l, přístroj výsledek označí a sám měření opakuje s ředěním nastaveným v parametrech metody [7].

38 Kontrola kvality Pro kontrolu správné funkce analyzátoru je nutné provádět interní a externí kontroly kvality. IKK provádějí pracovníci laboratoře s cílem získat co největší míru pravděpodobnosti, že vydávané výsledky jsou maximálně věrohodné. IKK se provádí pomocí kontrolních přípravků firmy Roche. Přípravky jsou připraveny ze séra dárců, stejně jako kalibrátory. Před použitím se musí vytemperovat na laboratorní teplotu a dokonale rozpustit v deionizované vodě. Před zahájením provozu se nejprve zpracují kontrolní vzorky. V případě, že se výsledky vychýlí mimo povolené rozmezí, je nutné zopakovat analýzu chybného kontrolního vzorku. Pokud se výsledek nachází opakovaně mimo povolené rozmezí, je třeba provést úpravu kalibrací [5,7]. EKK provádějí nezávislé organizace s cílem objektivního hodnocení laboratorních výsledků, získávání výsledků o srovnatelnosti měření a také mezilaboratorního srovnávání. U analyzátoru Modular SWA provádějí laborantky IKK třikrát denně. EKK se provádí čtyřikrát ročně. Po nahlédnutí do záznamu o proběhlých kontrolách kvality jsem viděla, že OKB FN USA opakovaně úspěšně prospívá [5,7].

39 Postanalytická část orálního glukózového tolerančního testu Postanalytický proces navazuje na získání výsledku analýzy a vydání laboratorního nálezu. Výpisy z analýzy se zálohují a uchovávají 5 roků. Uvolňování výsledků probíhá v několika krocích. Laborantka uvolní výsledky vzorků do LISu. Po odsouhlasení analytických hodnot v LISu provede lékař vyhodnocení ogtt a provede zápis do LIS. Poté vysokoškolák uvolní výsledky do NISu. Protokol o výsledku vyšetření se následně automaticky vytiskne a tištěný nález se odešle indikujícímu lékaři podle razítka na žádance. Ošetřující lékař výsledky vyšetření posoudí a zhodnotí s ohledem na léčebný proces a navrhne další postup léčby [5,6]. Kritéria pro hodnocení výsledků ogtt jsou u dospělých a těhotných žen odlišná. OKB FN USA se řídí doporučením ČSKB A ČDS (Obr.5,6). Glukóza (mmol/l) Interpretace Vyloučení DM Prediabetes Diabetes mellitus nalačno < 5,6 5,6-6,9 IFG 7,0 za 2 hodiny < 7,8 7,8-11,0 IGT 11,1 Tab. 3. Rozhodovací meze pro hodnocení ogtt [6] Vyloučení gestačního diabetu Gestační diabetes Gestační diabetes Glukóza za 2 hodiny < 7,7 mmol/l Glukóza za 2 hodiny 7,7 mmol/l Glukóza nalačno 5,6 mmol/l Tab. 4. Hodnocení ogtt u těhotných [6] Rozhodovací meze se liší. Pokud u dospělého pacienta po provedení testu naměříme koncentraci glukózy < 7,8 mmol/l, o DM se nejedná. Hodnota vyšší než 11 mmol/l je potvrzením DM. Pokud se výsledek nachází v rozmezí 7,8 11 mmol/l, jedná se o IGT. U těhotných pacientek jsou pravidla pro vyslovení diagnózy GDM poněkud přísnější. Rozhodovací mez u těhotných je hodnota PPG 7,7 mmol/l. Pokud je PPG nižší než 7,7 mmol/l, můžeme GDM vyloučit. Hodnota 7,7 mmol/l svědčí pro GDM [24].

40 C. Experimentální část Pro splnění cílů mé bakalářské práce jsem z laboratorního informačního systému Oddělení klinické biochemie FN u sv. Anny v Brně získala data 161 pacientů. Sběr dat probíhal na našem pracovišti od do Pacienti byli odesláni ošetřujícím lékařem z důvodu požadavku na provedení vyšetření ogtt. Z celkového počtu vyšetřených bylo 37 těhotných žen. Obě skupiny pacientů, dospělí pacienti a těhotné ženy, zpracuji samostatně, z toho důvodu, že obě skupiny pacientů mají rozdílné meze hodnocení a u těhotných žen nehodnotím věk a pohlaví. Ze získaných dat provedu statistické zpracování a vyhodnocení.

41 Zpracování a vyhodnocení dat dospělých pacientů 10.1 Popis souboru Celkem bylo za uplynulé období na OKB FN USA odeslánoo k vyšetření ogtt 124 dospělých pacientů ve věku let, z tohoo bylo 70 žen a 54 mužů. Žen bylo k vyšetření ogtt tedy odesláno o 12,9 % více než mužů. Ženy tvořily nejpočetnější skupinu ve věku let, kdežto nejvíce mužů bylo k vyšetření odesláno ve věku let. Celkový přehled uvádí tabulkaa (Tab.5) a graf (Obr.10). Věk Celkem Muži Ženy Celkem Tab. 5. Pohlaví a věk pacientů Věk Ženy Věk a pohlaví pacientů Muži % 15% 10% 5% 0% 5% 10% 15% 20% Obr. 10. Pohlaví a věk pacientů

42 Frekvence záchytu prediabetu a diabetu pomocí ogtt Tabulka (Tab.6) ukazuje počty pacientů, rozdělených na základě vyhodnocení ogtt. Vyšetření proběhlo formou změření hladiny glukózy v krvi nalačno ráno před provedením ogtt a změřením hladiny glykémie po 120 minutách od podání zátěžové dávky glukózy. Vyhodnocení ogtt Ženy Muži Celkem Fyziologický nález Prediabetes DM Celkem Tab. 6. Rozdělení pacientů podle pohlaví a vyhodnocení ogtt Fyziologický nález Prediabetes DM 26% 56% 18% Obr. 11. Rozdělení pacientů podle vyhodnocení ogtt

43 ženy (%) 56,5 muži (%) 43, % Fyziologický nález Prediabetes DM Obr. 12. Zastoupení pohlaví podle vyhodnocení ogtt Přehledné rozdělení pacientů do skupin podle vyhodnocení ogtt zobrazuje graf (Obr. 11) Fyziologický nález měli pacienti, jejichž hodnota glykémie nalačno byla < 5,6 mmol/l a hodnota PPG byla < 7,8 mmol/l. U těchto 26 % pacientů mohl být DM vyloučen. Největší rozdíl v zastoupení obou pohlaví byl u pacientů s fyziologickým nálezem glukózy, výrazně převažovaly ženy (Obr.12). Pravděpodobně je to tím, že k vyšetření bylo odesláno více žen Záchyt onemocnění prediabetes U 56 % pacientů jsme určili diagnózu prediabetes, což je u více než poloviny osob odeslaných na vyšetření (Obr. 11). Z toho vyplývá, že u nás byla častěji vyslovena diagnóza prediabetes než DM. Prediabetes byl diagnostikován mužům o 26,1 % více než ženám. Pokud vyšetření svědčí pro prediabetes, může se jednat buď o hraniční glykémii nalačno, porušenou glukózovou toleranci, nebo o kombinaci obou poruch (Tab. 7).

44 Prediabetes IFG IGT IFG+IGT Celkem Počty pacientů Tab. 7. Počty pacientů v jednotlivých skupinách prediabetu Obr. 13. Záchyt prediabetu při ogtt Z grafu (Obr. 13) vyplývá, že největší část pacientů s onemocněním prediabetes spadá do skupiny hraniční glykémie nalačno. Při zátěžovém testu byla FPG 5,6 mmol/l a zároveň < 7 mmol/l. U této skupiny pacientů byla zároveň PPG < 7,8 mmol/l. IGT na základě hodnoty PPG byl zachycen u 12 % pacientů. Tito pacienti měli FPG < 5,6 mmol/l, ale PPG měli v rozmezí 7,8 mmol/l < 11,1 mmol/l. Hodnota glykémie 2 hodiny po vypití zátěžové dávky glukózy tedy svědčí pro porušenou glukózovou toleranci. Poslední skupinu prediabetu tvoří pacienti, u kterých byla FPG v rozmezí 5,6 mmo/l < 7 mmol/l a hodnota PPG v rozmezí 7,8 11 mmol/l. Tato kombinovaná porucha (hraniční glykémie nalačno i porušená glukózová tolerance) byla zachycena u 30 % respondentů. Protože prediabetes je dnes definován jako samostatná klinická jednotka, jsme schopni zachytit i pacienty s asymptomatickým průběhem onemocnění. Zjistila jsem, že 56 % vyšetřených pacientů na ogtt spadá do kategorie prediabetes. Dříve nebylo možné odhalit