Hyphenated techniques

Transkript

1 multidimensional analyses Jan Preisler 312A1 life science research omics genomics proteomics organellomics metabolomics cellomics 1 hyphen - spojit spojovníkem (dvě slova) hyphen - spojovací čárka (spojovník) hyphen - pomlčka hyphen - označit čárkou hyphen - rozdělit slovo (čárkou) hyphen - spojovací hyphen - rozdělovací čárka hyphen - rozdělovací znaménko hyphen - spojovník hyphenate - spojit hyphenate - rozdělit čárkou hyphenate - spojit spojovníkem hyphenate - rozdělit spojovníkem 3 Definice the marriage of two separate analytical techniques via appropriate interfaces, usually with the backup of a computer tying everything together Analytical Chemistry (Wiley-VCH, 1998) Hyphenated separation techniques refers to a combination of two (or more) techniques to detect and separate chemicals from solutions. Most often the other technique is some form of chromatography. A slash is sometimes used instead of hyphen, especially if the name of one of the methods contains a hyphen itself. Wikipedia (27)... zpravidla sestava některé separační techniky kombinovaná s jinou separační/detekční technikou, např. MS detekcí... specifičtější multidimenzionální analýza... odstranění vzájemných rušení a překryvů signálu Co ještě je a co už není hyphenated technique? LC 25 nm záznam absorbance při zvolené l LC DAD diode array detector, záznam spektra Více detekčních technik: hypernated techniques Současnost kapilární separační techniky + vysoce citlivé detekční techniky (hmotnostní spektrometrie ESI a MALDI, elektrochemické aj.) kombinace vysoké selektivity a vysoké citlivosti dovoluje jednoznačné stanovení analytů ve stopových množstvích Rozhraní (interface) zachování separační účinnosti zachování citlivosti (minimalizace ztrát analytů) Aplikace multidimensionální analýza komplexních směsí: proteomika, dopingové testy, toxiny, pesticidy, speciační analýza polutantů

2 Typy spojení MS IR OES AAS NMR Fluo UV/Vis GC *** *** ** * ** * LC *** ** ** ** ** *** *** SFC * * ** CE ** * * *** *** TLC * ** *** *** GE *** ** *** *** *** komerčně dostupné a v praxi používané ** komerčně dostupné, ale méně v praxi využívané * ve výzkumném stadiu, ale komerčně nedostupné Klasifikace spojení Sběr eluentu diskrétní frakce (fraction collector) spojitý tok Režim on-line off-line in-line Využití vzorku beze ztráty vzorku se ztrátou vzorku (splitter) Separátor (splitter) rozdělení eluentu mezi více technik miniaturizace, kapilární kolony 7 8 Spojení separace a selektivní detekce Proč separace?... nutnost analýzy velmi složitých vzorků, směsí mnoha analytů Když specifická detekce není dostatečně specifická: vysoká pravděpodobnost výskytu 2 nebo více analytů se stejným spektrem vzájemné rušení analytů omezený dynamický rozsah detektoru, nemožnost současné analýzy minoritních a majoritních složek odstranění nečistot zdroj dalších informací o analytech Ion Intensity (V) Př.: vzájemné rušení MALDI MS signálu směsi peptidů AF 3-8 AF 1-7 AIII AII AI AII (off scale) c(peptidů) = 1 mm AG 1-1 c(peptidů) = 1 mm kromě c(aii) = 5 mm m/z 1 Nejčastěji používané hyphenated techniky HPLC-TLC (MALDI-TOF MS) všechny techniky spojené s MS, UV, Fluo Př.: HPLC, CE MS GC-MS GC-FTIR LC-GC GC-AES LC-AAS LC-ICP MS LC-elektrochemické detektory Probot

3 LC-GC GC-AES 13 1 LC-MS LC-AAS ICP-MS

4 HPLC NMR MS analysis of a commercial dye sample. A: HPLC (UV) spectrum at 25 nm. B: Photodiode array contour plot. C: Total ion chromatogram under negative ion electrospray conditions. D: Density plot of the negative ion electrospray mass spectra. E: 1 H NMR spectra of peaks 1, 3 and 5 of the HPLC chromatogram in A 19 2 This example is for a 1 C-labeled-blocker dosed to a rat. NMR and MS data for the minor hydroxyglucuronide metabolite clearly enables the structure to be determined. In addition, the drug was dosed as the racemate, but the NMR spectrum clearly shows that the metabolism (or excretion) was enantioselective based on the slightly different intensities of the anomeric proton resonances of the two 21 diastereoisomeric glucuronides. 22 Typy interface pro MS Plyn vakuum tryskový separátor pro obohacení ABC v nosném plynu (particle beam) membránové interface kapilární kolona (místo klasické kolony se splitrem) Kapalina vakuum API ionizační metody (ionizace přímo z kapaliny za atmosferického tlaku) Průtokové sondy (FAB) Nanesení vzorku na tuhý nosič (terčík) pohyblivý pás (naneseni při atmosferickém tlaku přenos, diferenciální pumpování - ionizace) Sběr frakcí Příklad: spojení separace s MALDI MS Off-line - Sběr frakcí. Terčíky s hydrofilními místy (anchorchip) - Vyříznutí a extrakce skvrny z GE - Mikrometody používající piezoelektrické pipetory a mikroterčíky On-line - Průtoková sonda s fritou/bez frity - Zmlžovač pro tvorbu aerosolu In-line - Interface ROBIN - Nanášení vzorku na povrch ve vakuu, moving belt interface Off-line vs. on-line - Oddělení separace od hmotnostní analýzy - Možnost archivování vzorku 23 2

5 Automatizovaný sběr frakcí (off-line) Průtoková sonda (on-line) Např.: Probot (zdroj: 25 Whittal, R. M., Russon, L. M., Li, L. J. Chromatogr. A 1998, 79, Zmlžovač pro tvorbu aerosolu (on-line) Moving belt interface (in-line) Rozhraní pro kontinuální zavádění netěkavého vzorku v těkavějším solventu do hmotnostního spektrometru horký N 2 LC eluent iontový zdroj vyhřívací element štěrbiny IR vyhřívání pohybující se polyimidový pás k vakuovým pumpám Fei, X., Wei, G., Murray, K. K. Anal. Chem. 1996, 68, McFadden W. H., Schwartz H. L. and Evans S. J. Chromatogr. 122, 389, ROBIN (rotating ball inlet), in-line Nanášení vzorku ve vakuu (in-line) 2ND GENERATION VACUUM DEPOSITION INTERFACE atmospheric pressure source chamber (p ~ 1-6 Torr) deposition support repeller probe with capillary interface flange source coil Mylar tape target coil rubber wheel repeller center (tape guide) propelled shaft Orsnes, H., Zenobi, R. Chem. Soc. Rev. 21, 3,

6 integrated ICP MS signal (a.u.) 6 1 A (a.u.) CE - MALDI/MS směsi peptidů Multiplex: CAE MALDI MS MULTIPLEX MALDI/TOF MS desorption laser beam scanning mirror ATMOSPHERIC PRESSURE tape buffer vials flight tube infusion capillaries interface flange VACUUM repeller 2nd extraction grid detector (SOURCE CHAMBER) 1st extraction grid Multiplex: CAE MALDI MS Capillary Array Electrophoresis - MALDI MS osmi proteinových digestů separace (CE) UV detekce Off-line CE MS kapalinové spojení nanášecí kapilára myoglobin fetuin b-lactoglobin b-casein subatmosferická nanášecí komora (2 kpa) cytochrome carbonic anhydrase bovine serum albumin ribonuclease b broušená špička pokrytá PTFE terčík Au-PETG 33 UV detektor: Ryvolová, M.; Preisler, J.; Krásenský, P.; Foret, F.; Hauser, P.C.; Paull, B.; Macka, M. Anal. Chem. 21, 82, Subatmospheric Deposition of CE Effluent.5. CE UV & SALD ICP MS of Cr specií 2.5 CrO 2- CrO Cr Cr III (EDTA) III (EDTA) 1.5 kapalinové spojení.2 1. separační kapilára nanášecí sonda infúzní kapilára.1.5 VN vialky s pufrem a vzorkem terčík MALDI subatmosferická komora time (s) vzorek: 1 mm Cr 3+ (EDTA) a 1 mm CrO 2-, BGE: 1 mm HCOOH, kapilára: 2/26 cm, 1 kv, dávkování: Dh = 2 cm, 5 s (2 fmol), detekce: absorbance při 21 nm/sald ICP 53 (LOD ~ 1 fmol) Peš, O.; Jungová, P.; Vyhnánek, R.; Vaculovič, T.; Kanický, V.; Preisler, J. Anal. Chem. 28, 8,

7 Signal intensity [a.u.] [M- 111Cd SALD ICP ICP MS MS signal (a.u.) m/z Absorbance (a.u.) Tomalová, I.; Foltynová, P.; Kanický, V.; Preisler, J. Anal. Chem. 21, 86, Terčík MALDI : multidetekční platforma Metaloproteomická aplikace vzorek, separační eluent, tkáň terčík MALDI Kolonové separace hmotnostní spektrometrie - prvková analýza: ICP MS - molekolová analýza: elektrosprej (ESI) MS - kolonová separace + ICP MS/ESI MS MALDI MS MALDI MS/MS ICP MS reakce na terčíku laserem buzená fluorescence vzorek separace ICP MS vzorek separace ESI MS nebo vzorek separace ICP MS ESI MS Archivování/reanalýza/expozice jiným detekčním technikám 37 dělič toku nebo duální přístroj 38 Modifikovaný terčík (destička) CE(UV)-MALDI MS/SALD ICP MS Substrát - polyethylen tereftalát glykol (PETG) - nanovrstva Au: 5 nm pro kompatibilitu s MALDI a SALD 1,7 MT-1 1,5 1,3 1,1 MT-2,9,7,5,3,1 -, UV MALDI MS: MT apoformy destička Au-PETG se záznamem separace před a po SALD ICP MS destička Au-PETG na terčíku MALDI t mig at liquid junction (min) SALD ICP MS: kovy (Cd) Detekce formem proteinů MALDI MS CHCA/TFA: apoformy proteinů DHB/NH 3 : komplexy proteinu s kovy MALDI MS [M+H] + [M-H+Cd] + [M-3H+2Cd] + 5H+3Cd] + [M-7H+Cd] + DHB/NH 3 integrated SALD ICP MS signal [a.u.]*1 6 1,9,8,7,6,5,,3,2,1 SALD ICP MS ( 111 Cd) t 1 mig[s] 1 8 CHCA/TFA m/z 1 7