Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií"

Jaromír Sedláček
před 5 lety
Počet zobrazení:

Zdráhal Centrální laboratoř-proteomika, CEITEC-MU Oddělení funkční

1 Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecká fakulta MU Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií Část III Zbyněk Zdráhal Centrální laboratoř-proteomika, CEITEC-MU Oddělení funkční genomiky a proteomiky, ÚEB PřF zdrahal@sci.muni.cz

Analýza proteomu proteinů je podstatně víc než genů lidský genom obsahuje ~21 000 genů, ale lidský proteom může obsahovat ~ 1 000 000 proteinů a jejich forem (izoformy, PTMs) (http://www.expasy.

2 Analýza proteomu proteinů je podstatně víc než genů lidský genom obsahuje ~ genů, ale lidský proteom může obsahovat ~ proteinů a jejich forem (izoformy, PTMs) ( ~ proteinů v buňce v každém okamžiku široký rozsah koncentrací proteinů (~ 10 řádů) nutnost účinné separace majoritních proteinů od minoritních, chybí obdoba PCR reakce používané pro amplifikaci DNA široké spektrum fyzikálně-chemických vlastností analýza komplexů pro úplné pochopení buněčných procesů mnohdy nestačí prostá identifikace jednotlivých proteinů, cca 80% je funkčních jako součást komplexů

3 Pečlivá příprava vzorku základní kámen úspěchu GIGO zachování původního proteinového složení zachování modifikací (např. inhibitory fosfatáz)...

4 Keratiny!!! from skin, hair, nails, wollen clothes. EVERYWHERE a.i. 700 In-gel digestion of very weak Ag stained band zbytky media detergenty netěkavé pufry EGs m /z /D = /D ata/z bynek/2003/10_oct/031030/v z_2/0_j11_2r ef/pdata/1 A dm inistrator W ed D ec 10 13:46:

6 Standardní 1-D postupy JEDNODUCHÉ SMĚSI 1-D GE Separace proteinů Specifické proteolytické štěpení MALDI-MS/MS LC-MS/MS Specifické proteolytické štěpení Separace naštěpených peptidů 1-D LC-MS/MS shotgun proteomics MS/MS

kda 97.4 66.2 45.0 31.0 GE Proteinový extrakt fága 1-D separace cca 50 bandu Intens. x10 7 2.0 1.5 LC/MSMS Iden. 5 majoritních proteinů 21.5 14.4 1.

7 kda GE Proteinový extrakt fága 1-D separace cca 50 bandu Intens. x LC/MSMS Iden. 5 majoritních proteinů koncentrační rozsah snížená možnost detekce minoritních komponent rozhoduje instrumentace podmínky LC separace Time [min]

9 2-D Klasické 2-D postupy 2-D GE Separace proteinů Specifické proteolytické štěpení MALDI-MS MALDI-MS/MS LC-MS/MS Specifické proteolytické štěpení Separace naštěpených peptidů 2-D LC-MS/MS on-line/off-line LC-MALDI MS/MS

10 Proteinový extrakt fága 2-D separace 2-D GE/MALDI-MS 700 skvrn 20 proteinů

$Protein mix 2-D LC peptides On-line ( MudPIT ) digesce 1D - SCX 2D - RP MS/MS frakcionace step by step Peptide Peptide fraction Peptide Off-line fraction Peptide$

11 Protein mix 2-D LC peptides On-line ( MudPIT ) digesce 1D - SCX 2D - RP MS/MS frakcionace step by step Peptide Peptide fraction Peptide Off-line fraction Peptide fraction Peptide 1D - SCX fraction UV Peptide fraction Peptide fraction LC fraction MS/MS 2D - RP Peptide fraction MudPIT (multidimensional protein identification technology)

12 2-D LC peptides

13 2-D LC (peptides) 1D-RP 2D-RP, frakce 5 mm 2D-RP, frakce 50 mm 2D-RP, frakce 100 mm Dionex application note

14 Průměr HPLC kolony vs citlivost Sensitivity increases with a decrease in column diameter because the same sample mass (amount) is eluted in a smaller volume. Therefore the concentration of the eluting peak is higher and the detection signal is stronger. Amer. Lab., 2001, 33 (10),

15 2-D LC peptides sorbenty 1-D: ionex 2-D: reverzní fáze IMAC (fosfoproteiny) affinity (lectin glyko) On-line vs Off-line automatizace flexibilita optimalizace kontinuální odběr frakcí

16 LC MALDI (peptides) Peptide fraction nano LC (RP) on-line ESI-MS/MS Depozice na MALDI target off-line MALDI TOF/TOF MS Archivace

18 LC separace komplexních proteinových směsí exp. exp. Protein mix Protein 1D frakce Frakcionace I. Ionex, SEC,. Frakcionace II. RP Protein 1D frakce Protein 2D frakce Různé druhy detekce Protein 2D frakce digesce 1D (2D) HPLC ESI-MS/MS

19 LC separace komplexních proteinových směsí

20 LC MALDI (proteins) Protein mix (2 D) LC CE 2. Digesce na destičce 1. Depozice na MALDI target off-line MALDI TOF/TOF

21 Kombinace GE a HPLC separace 1-D GE slices protein fractionation digesce nano 1-D LC ESI-MSMS nebo IPG strip často používané pro analýzu proteinových komplexů

22 2D-Off-line (3D?) 2D-On-line from Carter et. al. The Plant Cell, 2004, 16,

23 from Carter et. al. The Plant Cell, 2004, 16,

24 Celková analýza proteomu (screening) Depletovaná plazma ( proteinů??) 0. rozměr IEF (liq) 1. rozměr 20 frakcí LC (RP) 2. rozměr 1600 frakcí GE (1D/2D) 3/4. rozměr frakcí from H. Wang, Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 4,

25 Cílená analýza imunoafinitní frakcionace (Y(phos)) from A.D. Zoumaro-Djayoon et al. / Methods 56 (2012)

Cílená analýza jednotlivých proteinů Parent mass CID Fragment mass Q1 fix Q3 fix Q1 Q2 Q3 kvadrupol Q1 i Q3 jsou nastaveny na vybrané hodnoty m/z (prekurzoru a vybraného fragmentu), zaznamenány

26 Cílená analýza jednotlivých proteinů Parent mass CID Fragment mass Q1 fix Q3 fix Q1 Q2 Q3 kvadrupol Q1 i Q3 jsou nastaveny na vybrané hodnoty m/z (prekurzoru a vybraného fragmentu), zaznamenány jsou jen prekurzory, z kterých při fragmentaci v kolizní cele Q2 vzniká určený fragment během analýzy lze sledovat více reakcí (MRM) from K. Bluemlein et al. / Nature protocols 6 (2011)

28 High throughput

29 + Miniaturizace - chip technologie

30 MS Charakterizace Modifikací Phos

31 N-terminus C-terminus b- ion serie y- ion serie b 1 b y 1 y b 3 y 3 b y 4

32 Fragmentace peptidů CID vs ETD b, y c, z C-terminus (z- serie) CID ETD N-terminus (c-serie)

33 Proč analýza modifikací proteinů? Možnosti MS při analýze modifikací Druh Místo Úroveň

34 Druhy modifikací: mutace (záměna AMK) chemické posttranslační Užitečný přehled modifikací: DeltaMass ExPASy -

35 Chemické modifikace: záměrné modifikace (karbamidometylace Cys, N terminal acetylace, PSD derivatizace, kvantifikační značky aj.) nechtěné modifikace (oxidace Met, deamidace N D při purifikaci, adukty farmak)

36 Common Posttranslational Modifications Methylation Formylation Acetylation Lipoic acid Amines (K/N-terminus) Farnesylation Myristoylation Biotinylation Palmitoylation Stearoylation Geranylgeranylation Acids & amides (E/D/Q/N) Pyroglutamic acid (Q) Deamidation (Q/N) Carboxylation (E/D) Hydroxyl groups (S/T/Y) Phosphorylation Sulphation Carbohydrates (S/T/N) Pentoses Deoxyhexoses Hexosamines Hexoses N-acetylhexosamines Sialic acid Další detaily:

37 MS Charakterizace mutací

38 Potvrzení výměny AMK na peptidové úrovni Protein: Zm-p60 (pozice 186) wild type NWLTFNEPQTFTSFSYGTGVFAPGR 2824 E186Q Q 2823 peptide mass difference: - 1 Da In-gel digesce MALDI-TOF MS a.i Zm-p60.1 E186Q Da 400 Zm-p60.1 wild type m/z

39 Identifikace výměny AMK na aminokyselinové úrovni Protein ve dvou variantách v jednom spotu na 2-D gelu Vstupní informace: Změna hmotnosti tryptického peptidu: 14 Da... DEEELQKENVKNTASLTGKITLSVTQSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQG... MALDI-MS MALDI-PSD potvrzení změny hmotnosti daného peptidu (2 proteázy) nejednoznačné výsledky LC-MSMS nalezena mutace D/E v pozici DEEELQKENVKNTASLTGKITLSVTQSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQG...

40 MSMS peptidu LSVTQSKPXTGEVIGVFES, MW (1992.0) Modif - detail MS/MS spektra D MS2(997.4), 32.6min (#887) Intens EIC chromatogram Modif MS2 (997.4, 2+) m/z m/z Ion b 9 LSVTQSKPX Nemodif detail MS/MS spektra E D / E +MS2(1004.0), 32.1min (#878) Intens Time [min] EIC chromatogram m/z 970 Nemodif MS2 (1004.4, 2+) m/z m/z Time [min] Rt (min)

41 LC-MSMS methylace, potvrzení D v pozici 210 po derivatizaci výměna H za CH3 na karboxy skupině tj. Da/skupinu y 8 VTQSKPX*TGE*VIG* Da y 8 nederiv m/z pro D y 8 methyl m/z pro D

42 MSMS peptidu VTQSKPXTGEVIG před a po methylaci [Abs. Int.] y Da y m/z

43 MS Charakterizace modifikací chemické

44 MALDI MS spektrum digestů před a po modifikaci nemodifikovaný peptid 2060 (výřez spektra) 162 Da Peptid + X 2222

45 a.i MALDI MS spektrum Oxidace Met (výřez spektra) Da Sample prep artefact (Sypro Ruby) m/z

46 Výsledek identifikace proteinu (Mascot) 1. gi Mass: Score: 487 Queries matched: 5 50S ribosomal protein L14 [Escherichia coli O157:H7] Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Peptide (125) MIQEQTMLNVADNSGAR MIQEQTMLNVADNSGAR + Oxidation (M) (147) MIQEQTMLNVADNSGAR + Oxidation (M) (118) MIQEQTMLNVADNSGAR + 2 Oxidation (M). m/z 8 (16). 16 (32) Jen část týkající se modifikovaného peptidu (Petra P. Vz. 3, )

47 LC-MS/MS EIC: m/z (2+) m/z (2+) m/z (2+) 1x Ox 1x Ox 2x Ox

48 MS/MS spektrum nemodifikovaného peptidu - MIQEQTMLNVADNSGAR Abs. b Int. * 1000 E Q T M L N V A D N S G A y R A G S N D A V N L M T y y y y y y b y b y b b b y b y b b b y y b b b y b b m/z

49 y 11 y 10 MIQEQTMLNVADNSGAR b 9 b 9 M 1 IQEQTM 7 LN y 10 LNVADNSGAR y 11 M 7 LNVADNSGAR Posuny v m/z vybraných fragmentů pro jednotlivé případy M (ox) bez 1 Ox 1 Ox 2 Ox M 1 M 7 oba y y b

50 Abs. b Int. * 1000 N V y L M T y y ,5 y 10 LNVADNSGAR y 11 M 7 LNVADNSGAR b 9 M 1 IQEQTM 7 LN b b ,5 nemodifikovaný y 11 y , m/z Abs. b Int. * 1000 N V y L M T y y ,5 M1 - ox + posun celé b serie (b 3 - M 1 IQ) y 11 y b 9 b ,6 1105, m/z Abs. b Int. * 1000 N V y L M* T y y ,5 M7 - ox b 9 b , y 11 y , m/z Abs. b Int. * 1000 N V y L M* T y 10 y ,5 M1, M7- ox b 9 b , y 11 y , m/z

51 LC-MSMS spectrum (výřez spektra) VC*AR Potrzení modifikace na Cys Intens. x C + modifikace y y 3 * y C modifikace y y m/z

52 Intens. [a.u.] Histon H3, lokalizace acetylace (in-vitro) MALDI-MS digestu (detail spektra) 5340 Non-acetylated fragment Ac 5382 Fragment with one E Ac Ac? Fragment with two E Ac m/z

53 c 14 Histon H3, lokalizace acetylace K(14) MALDI-ISD MS (detail spektra) c 13 ARTKQTARKSTGGKAPR Abs. c Int. * 1000 T G G K T G G K* c c c c c c c Da c m/z

55 Konec III. části

Podobné dokumenty

Jaterní homogenát, preparativní nanáška 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 1025 spotů. ph 4 ph 7

Jaterní homogenát, preparativní nanáška 2 mg, barvení koloidní Coomassie Blue 1025 spotů. ph 4 ph 7 2018 PROTEOMIKA 2018 Proteomika, proteiny, co a proč. Metody práce s bílkovinami (Petrák 15/10) Značení bílkovin, separační metody, 2-DE (Petrák 22/10) 2-DE záludnosti, digesce a identifikace bílkovin