Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie. Bakalářská práce

Transkript

1 Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Bakalářská práce Brno 2016 Barbora Plšková

2 Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Signalizace pomocí Toll-like receptorů Bakalářská práce Barbora Plšková Vedoucí práce: RNDr. Lenka Švihálková Šindlerová, Ph.D. Brno 2016

3 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Obor: Vedoucí práce: Barbora Plšková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie Signalizace pomocí Toll-like receptorů Biochemie Biochemie RNDr. Lenka Švihálková Šindlerová, Ph.D. Akademický rok: 2015/2016 Počet stran: 44 Klíčová slova: Toll-like receptory, signalizace, signální dráhy, nespecifická imunita

4 Bibliographic entry Author: Title of Thesis: Degree Programme: Field of study: Supervisor: Barbora Plšková Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Signalling of Toll-like receptors Biochemistry Biochemistry RNDr. Lenka Švihálková Šindlerová, Ph.D. Academic Year: 2015/2016 Number of Pages: 44 Keywords: Toll-like receptors, signalling, signalling pathways, innate immunity

5 Abstrakt Toll-like receptory jsou transmembránové glykoproteiny typu I, které jsou schopné rozpoznávat typické molekulární vzory asociované s patogeny nebo molekulární vzory poškozených vlastních tkání organismu spojené se vznikem nebezpečí. Svou charakteristikou spadají do mechanismů nespecifické imunity, nicméně podporují i rozvoj specifické imunitní odpovědi. Této vlastnosti lze využít i při studiu různých onemocnění a jejich léčbě. Tato bakalářská práce se zabývá popisem Toll-like receptorů a jejich signálních drah v návaznosti na fyziologické či patofyziologické stavy organismu. Kromě literární rešerše obsahuje práce také popis testování aktivity jednotlivých receptorů prostřednictvím specifických ligandů.

6 Abstract Toll-like receptors are transmembrane glycoproteins type I, which are able to recognize pathogen associated molecular patterns or dangerous associated molecular patterns. According to their characteristics they belong to mechanisms of innate immunity though they promote progress of adaptive immune response as well. This can be used in further studies of various diseases and therapies. This thesis is focused on description of Toll-like receptors and their signalling pathways in a relation with physiological and pathophysiological states of organism. Besides literature search, this thesis includes also description of activation testing of individual receptors by specific ligands.

7

8 Poděkování Mé poděkování patří vedoucí této bakalářské práce RNDr. Lence Švihálkové Šindlerové, Ph.D. a také konzultantovi Mgr. Lukášovi Kubalovi, Ph.D. za cenné rady, věcné připomínky a vstřícnost při konzultacích a vypracování bakalářské práce.

9 Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno, 15. května 2016 Podpis autora

10 Obsah 1 Úvod Imunitní systém Nespecifická a specifická imunita Mezibuněčná komunikace Působení signálů Cytokiny Tumor nekrotizující faktor α Interleukin 1β Interleukin Interleukin Interleukin Interferony typu I Toll-like receptory Výskyt TLR Struktura TLR Ligandy TLR z vnějšího prostředí TLR ropoznávající lipidy a lipoproteiny TLR rozpoznávající proteiny TLR rozpoznávající nukleové kyseliny Ligandy TLR z vnitřního prostředí Signální dráhy Dráha závislá na MyD Dráha nezávislá na MyD Regulace signalizace Rozvoj specifické imunity Patofyziologie Cíl práce Materiál a metody Postup analýzy Výsledky a diskuze Závěr A Seznam zkratek Literatura x

11 1 Úvod Toll-like receptory (TLR, Toll-like receptors) tvoří prvotní rozpoznávací systém organismu proti škodlivým činitelům. V případě, že takového škodlivého činitele z vnitřního či vnějšího prostředí rozpoznají, spouští signální dráhy, které vedou k produkci látek, jež slouží jako signální molekuly a aktivují obranné mechanismy imunitního systému. Cílem je škodlivého činitele zneškodnit, popřípadě aktivovat mechanismy specifické imunity a obránit organismus při další infekci. Účinnost rozpoznávání ligandů TLR je velmi vysoká a pokud jejich aktivita není správně regulována, může dojít ke vzniku chronických zánětů či autoimunitních onemocnění [1]. Signalizace pomocí TLR ovlivňuje také nádorové buňky. Některé nádorové buňky dokonce vystavují TLR na svém povrchu [2]. Objev TLR přispěl nejen k porozumění mechanismů nespecifické imunity, ale jejich vlivu na imunitní odpověď lze využít i v klinické praxi. Prostřednictvím specifických ligandů TLR je možné imunitní odpověď systému podporovat, ale i potlačovat, což má svůj význam hlavně při léčbě autoimunitních onemocnění. Některé ligandy TLR se využívají jako přídavné látky ve vakcínách [3]. Teoretická část bakalářské práce shrnuje současné poznatky o TLR. Kapitoly této části se věnují výskytu TLR, jejich struktuře, popisují hlavní signální dráhy, jejich regulaci a způsoby, jakými může být ovlivněna specifická imunitní odpověď. Je zde také uveden přehled působení některých látek uvolněných během signalizace prostřednictvím TLR a také přehled ligandů TLR z vnějšího i vnitřního prostředí. Tyto informace jsou pak zasazeny do kontextu patofyziologických stavů v organismu. V experimentální části je popsáno testování aktivace receptorů TLR1/2, TLR2/CD14 a TLR2/6 specifickými ligandy. Úkolem bylo vybrat z osmnácti různých klonů embryonálních buněk ledvin HEK293 ty, které měly funkční a citlivé TLR. Výběr byl proveden na základě rozdílu mezi bazální a indukovanou tvorbou interleukinu 8 (IL-8), který byl detekován pomocí metody ELISA. Celkem bylo vybráno devět klonů buněk HEK293, které mohou být použity v experimentech pro testování dalších potenciálních ligandů TLR. 1

12 2 Imunitní systém Funkční imunitní systém, který je tvořen molekulami, buňkami, tkáněmi a orgány, představuje nepřetržitou ochranu organismu proti okolnímu prostředí. Rozpoznává škodlivé činitele z vnějšího i vnitřního prostředí a specificky nebo nespecificky na ně reaguje, rozpoznává a toleruje vlastní tkáně a odstraňuje staré, poškozené a mutované buňky, čímž udržuje integritu organismu. Všechny živé organismy mají vyvinuty své způsoby, jak bojovat s infekcemi. Schopnost obrany proti infekci a ochrany při dalším propuknutí stejné infekce se označuje jako imunita. V závislosti na typu škodlivých činitelů se imunitní odpověď liší, např. bakterie vyvolávají jinou reakci než viry nebo plísně. 2.1 Nespecifická a specifická imunita Nespecifická imunita, neboli vrozená, tvoří první obrannou linii organismu. Vývojově je starší než specifická imunita a její základ tvoří molekuly a buňky, které jsou v organismu již od narození. Aktivace nespecifických mechanismů imunity je založena především na rozpoznání chemických struktur, které se vyskytují na povrchu mnoha mikroorganismů, ale nejsou přítomny na povrchu vlastních buněk. U každého organismu ovlivňuje nespecifickou imunitu jeho druh, rod nebo kmen, pohlaví a u lidí také rasa [4]. Mezi mechanismy nespecifické imunity patří fyziologické bariéry, fagocytóza a zánět. Fyziologické bariéry mohou být anatomické (kůže, sliznice), mechanické (pohyb řasinek), mikrobiální (přirozeně se vyskytující prospěšné mikroorganismy konkurují patogenním mikroorganismům) nebo chemické (nízké ph v žaludku, enzymy) [5, 6]. Imunitní mechanismy specifické i nespecifické imunity mají dvě složky buněčnou a humorální (látkovou). U nespecifické imunity tvoří buněčnou složku imunitních mechanismů především granulocyty a makrofágy, do humorální složky se řadí komplementový systém a různé cytokiny [5, 7]. Specifická imunita je vývojově mladší, adaptivní a na antigeny, tedy látky, které jsou schopné vyvolat imunitní odpověď, reaguje specificky. Je iniciována aktivitou nespecifické imunity a plný rozvoj imunitní 2

13 2. Imunitní systém reakce specifické imunity trvá několik dní až týdnů. Charakteristickou vlastností reakcí specifické imunity je imunologická paměť. Na samotných reakcích specifické imunity se podílí T-lymfocyty a B-lymfocyty. Lymfocyty tak představují buněčnou složku těchto mechanismů a protilátky a cytokiny představují humorální složku [5, 7]. T-lymfocyty mají schopnost rozeznávat intracelulární struktury, které mohou vyvolat imunitní reakci. Na povrchu každého T-lymfocytu se vyskytuje specifický receptor a koreceptory (membránové proteiny) [6]. Existují tři subpopulace T-lymfocytů: cytotoxické T-lymfocyty (T C lymfocyty), pomocné T-lymfocyty (T H lymfocyty) a regulační T- lymfocyty (T REG lymfocyty) [8]. T C lymfocyty obsahují koreceptor CD8 a označují se také jako CD8 + T-lymfocyty. Rozpoznávají buňky napadené patogeny nebo vlastní poškozené buňky, které ničí vlastními mechanismy (uvolněním proteáz nebo perforinů) a nebo aktivují v buňce specifický receptor pro apoptózu, popřípadě indukují apoptózu buňky vyloučenými cytokiny [6]. T H lymfocyty obsahují koreceptor CD4 a označují se také jako CD4 + T-lymfocyty. Produkují řadu cytokinů, které ovlivňují další buňky, např. B-lymfocyty a zesilují imunitní reakci proti patogenu [6]. Existují tři typy T H lymfocytů: T H 1, T H 2 a T H 17 lymfocyty [9]. T REG lymfocyty snižují proliferaci jiných efektorových T-lymfocytů a tlumí jejich aktivitu. Obsahují koreceptor CD4 nebo CD8 a CD25 a jsou označovány CD4 + CD25 + nebo CD8 + CD25 + T-lymfocyty [8]. Hlavní funkcí B-lymfocytů je produkce protilátek. Obsahují na svém povrchu receptory, které rozpoznávají extracelulární struktury mohou to být téměř jakékoliv biologické molekuly. Existují dva základní typy B-lymfocytů: plazmatické buňky produkující protilátky a paměťové buňky zajišťující rychlejší a silnější imunitní odpověď při opakované infekci [6]. 3

14 3 Mezibuněčná komunikace Pro mnohobuněčný organismus je komunikace mezi jednotlivými buňkami naprosto nezbytná a nenahraditelná. Probíhá prostřednictvím extracelulárních chemických signálů, které mohou mít různou formu. Během přenosu informace se formy mohou měnit a taková přeměna se nazývá transdukce signálu [10]. Signalizace obvykle probíhá tak, že buňka, která signál vydává, produkuje specifický typ molekul, které cílová buňka přijímá prostřednictvím proteinu receptoru. Receptor signální molekulu rozpozná, má k ní afinitu a specificky na ni reaguje převádí signál z vnějšku dovnitř buňky, kde ovlivňuje její chování. Zahajuje se tak signální dráha. V buňce přenáší signál intracelulární signální molekuly a dochází k jeho zesílení. Během svého přenosu může být signál rozdělen do různých směrů. Dílčí kroky signální dráhy mohou být ovlivněny jinými pochody v buňce, navíc spolu různé signální dráhy v buňce interagují, díky čemuž může vzniknout komplexní odpověď na složitou kombinaci signálů, které buňka registruje [10, 11]. Většina signálních molekul nemůže volně procházet buněčnými membránami a proto jsou receptory na jejich povrchu pro komunikaci nezbytné. Bude-li tedy mít buňka na svém povrchu receptor pro daný signál, bude na něj reagovat. Mezi molekuly, které buňky využívají pro komunikaci, patří například proteiny, aminokyseliny, steroidy, mastné kyseliny, dokonce i rozpuštěné plyny [10]. 3.1 Působení signálů Signály se mohou šířit na různé vzdálenosti. Signální molekuly hormony, které se tvoří v endokrinních žlázách, přenáší signál krví po celém těle. Neuronová signalizace také přenáší signály na velké vzdálenosti a velmi rychle. Nervové signály jsou přenášeny podél axonu cílové buňky a jakmile dospějí k jeho konci, dochází k převedení elektrického signálu na chemickou formu a dochází k vyloučení nervových mediátorů do štěrbiny mezi koncem axonu a membránou cílové buňky, na které jsou umístěny receptory, které mediátory rozpoznávají [10, 11]. 4

15 3. Mezibuněčná komunikace Lokálně působí parakrinní signály, které jsou uvolňovány buňkami do extracelulární hmoty, ale zůstávají v sousedství těchto buněk. Tímto způsobem působí například signální molekuly regulující zánět v místě infekce [10, 11]. Sousední buňky spolu komunikují bezprostředně díky signálním molekulám, které se nachází v plasmatické membráně jedné buňky a jejich navázání na receptor, který se nachází v plasmatické membráně sousední buňky. Podmínkou tohoto typu komunikace je, že se plasmatické membrány sousedních buněk musí dotýkat [10, 11]. 3.2 Cytokiny Buňky imunitního systému komunikují s ostatními buňkami prostřednictvím různých produkovaných cytokinů. Jsou to většinou proteiny, peptidy nebo glykosylované proteiny s malou molekulovou hmotností a jsou účinné i při nízkých koncentracích fyziologické koncentrace těchto látek jsou pikomolární. Pro srovnání, fyziologické koncentrace hormonů v krevním oběhu bývají nanomolární [12, 13]. Jedna buňka může produkovat více různých cytokinů, které rozvíjí různou odpověď. Cytokiny mají pleiotropní efekt (každý cytokin má více funkcí) a jsou redundantní (více cytokinů vykonává stejnou nebo podobnou funkci) [14]. Obecně cytokiny ovlivňují buněčný růst, diferenciaci, pohyb, chování a přežívání buněk [13] Tumor nekrotizující faktor α Tumor nekrotizující faktor α (TNF-α) je jedním z nejdůležitějších prozánětlivých cytokinů, protože má významné funkce v obranných mechanismech imunitního systému, podporuje imunitu a velkou roli hraje také v patogenezi autoimunitních onemocnění [12]. Hlavní funkcí TNF-α je stimulace tvorby prozánětlivých cytokinů, chemokinů, adhezivních molekul, růstových faktorů a dalších molekul. V místě zánětlivé reakce ovlivňuje TNF-α indukci adhezivních molekul a chemokinů na epitelu a endotelu, proliferaci fibroblastů a angiogenezi [13]. Kromě těchto lokálních účinků způsobuje TNF-α např. fyzickou slabost, hypoglykemii [15], destrukci tukových a svalových 5

16 3. Mezibuněčná komunikace buněk, aktivuje koagulaci [16] a zabraňuje replikaci kmenových buněk kostní dřeně [12]. Dokáže také ovlivňovat termoregulaci, respektive ovlivňuje syntézu prostaglandinů v hypothalamu, které způsobují hypertermii [17]. Nárůst TNF-α značí nejen infekční stavy, ale je spojen také s různými onemocněními, např. revmatoidní artritidou [18], psoriázou, chronickými záněty, anémiemi, Crohnovou chorobou a dalšími onemocněními [12]. Náhlý vysoký nárůst koncentrace TNF-α vede k rozvoji šokového stavu [19]. Nicméně zvýšení hladiny TNF-α může mít i pozitivní efekt u imunodeficitních stavů, virových onemocnění, tuberkulózy, hyperglykémii a jako prevence nádorového bujení [12] Interleukin 1β Interleukin 1β (IL-1β) je jednou ze dvou forem interleukinu 1 (IL-1). Nejdříve vzniká inaktivní prekurzor IL-1β, který je štěpen proteolytickou kaspázou 1 a tak vzniká aktivní IL-1β. Tento proces probíhá v inflamazomu, což je buněčná struktura obsahující proteiny a NOD-like receptory (NLR, nucleotide binding oligomerization domain receptors), které patří do rodiny receptorů rozeznávajících molekulové vzory (PRR, pattern recognition receptors) [20]. IL-1β má vliv na centrální nervovou soustavu, působením na ni vyvolává fyzickou slabost, úbytek hmotnosti i svalové hmoty. Kromě toho ovlivňuje mozková centra pro chování a tělesnou teplotu, má vliv na indukci spánku a horečky. Jeho vazba na receptory v hypothalamu navozuje anémii. Podporuje regeneraci tkání [12, 13]. Zvýšená hladina IL-1β značí infekce (bakteriální, virové, mykotické i parazitární), revmatologická onemocnění, nádorová onemocnění, akutní i chronické záněty, horečky a její následky, ospalost v průběhu zánětlivých onemocnění a další symptomy či onemocnění [12] Interleukin 6 Interleukin 6 (IL-6) je prozánětlivý cytokin mnoha funkcí, který ovlivňuje mechanismy specifické i nespecifické imunity. Uvolňuje se při infekcích, popálení, traumatech a nádorových onemocněních [12]. IL-6 má vliv na diferenciaci T-lymfocytů, protože je pro ně růstovým faktorem v prvním stadiu diferenciace. Podporuje také diferen- 6

17 3. Mezibuněčná komunikace ciaci a proliferaci B-lymfocytů a tvorbu protilátek [21]. Kromě toho navozuje tvorbu proteinů akutní fáze v játrech, zejména C-reaktivního proteinu, který pozitivně ovlivňuje fagocytózu bakterií a fibrinogenu, který podporuje koagulaci [12], ovlivňuje přes hypothalamus zvýšení tělesné teploty a horečku [17], má vliv na embryonální vývoj a plodnost a přispívá regeneraci jater a neuronů [22]. Hladina IL-6 se zvyšuje v akutní fázi zánětlivých onemocnění, ať už infekčních (např. při infekční mononukleóze) nebo neinfekčních, při revmatodiní artritidě, ateroskleróze a nádorových onemocněních. Nízká hladina IL-6 se projevuje nedostatečnou reaktivitou imunitního systému při akutních onemocněních. Naopak příliš vysoká produkce IL-6 může vést k autoimunitním onemocněním [12] Interleukin 8 Interleukin 8 (označován jako IL-8 nebo CXCL8) patří do skupiny chemokinů, což jsou cytokiny, které ovlivňují chemotaxi, adherenci a pohyb buněk [13]. Chemokiny obsahují skupinu čtyř cysteinů, které jsou propojeny disulfidickou vazbou. Podle polohy prvních dvou cysteinů se rozlišují dvě skupiny chemokinů: CXC (dva cysteiny odděleny jinou aminokyselinou) a CC (sousedící cysteiny) [23]. IL-8 má schopnost regulovat aktivaci, migraci a v menší míře adherenci polymorfonukleárních neutrofilů k endotelu [12, 13]. Stimuluje vylití mediátorů z granul neutrofilů, stimuluje jejich oxidační metabolismus a produkci volných radikálů, které mají baktericidní účinky. Koncentrace IL-8 v tkáních kolísá. Zatímco ve zdravé tkání není detekovatelný, v průběhu infekce nebo zánětu jeho koncentrace výrazně stoupá, nárůst produkce je vyvolán působením prozánětlivých cytokinů (např. TNF-α a IL-1) [12]. Produkce IL-8 může být aktivována také hypoxií [24], ischemií [25] nebo nádorovými buňkami, zvláště buňkami vysoce maligních nádorů [12]. IL-8 ovlivňuje také angiogenezi [26]. S vyšší koncentrací IL-8 jsou spojena zánětlivá onemocnění, revmatoidní artritida, virové a bakteriální infekce, nádorová onemocnění, ateroskleróza, obezita, schizofrenie a další [12]. 7

18 3. Mezibuněčná komunikace Interleukin 12 Interleukin 12 (IL-12) patří mezi prozánětlivé imunoregulační cytokiny. Jeho produkce je vyvolána nejčastěji mechanismy nespecifické imunity a následně ovlivňuje buňky specifické imunity. Je to heterodimer tvořený dvěma podjednotkami p35 a p40. Funkční cytokin vzniká až spojením těchto podjednotek pomocí disulfidických vazeb a nese označení p70. IL-12 má pozitivní vliv na vývoj T-lymfocytů, selektivně podporuje diferenciaci pomocných lymfocytů T H 1 na úkor vývoje pomocných lymfocytů T H 2 [12]. Má vliv i na další buňky imunitního systému, např. zvyšuje aktivitu přirozených zabíječů i cytotoxických T-lymfocytů [27]. U T-lymfocytů a přirozených zabíječů podporuje tvorbu interferonu γ (IFN-γ). IFN-γ pak zase podporuje produkci IL-12 [13]. Protinádorový účinek IL-12 je připisován jeho schopnosti inhibovat angiogenezi. IL- 12 dokáže podporovat zánětlivou odpověď organismu natolik účinně, že musí být jeho tvorba omezována pomocí dalšího interleukinu, a to interleukinu 10 (IL-10) [12]. Zvýšená koncentrace IL-12 je spojena s patofyziologickými stavy, které jsou charakterizovány převahou T H 1-lymfocytů oproti ostatním efektorovým T-lymfocytům. Mezi taková onemocnění patří např. diabetes mellitus prvního typu [28], atopický ekzém, Crohnova choroba [29], roztroušená skleróza a další. Naopak snížená koncentrace IL-12 vede k vyšší náchylnosti k infekcím [12] Interferony typu I Jako interferony se označují cytokiny s antivirovými účinky. Jsou schopny interferovat s replikací viru a od toho nesou svůj název. Hlavními zástupci inteferonů typu I jsou interferon α (IFN-α) a interferon β (IFN-β). Kromě svých antivirových účinků zvyšují tyto cytokiny aktivitu přirozených zabíječů a mají imunoregulační účinky - podporují diferenciaci T-lymfocytů ve prospěch T H 1 lymfocytů [30] [13]. Produkce interferonů typu I není jen reakcí buněk na virové infekce, ale může být spuštěna také vazbou bakteriálních ligandů (např. endotoxinu) na receptory buněk nespecifické imunity [30], buněčným stresem, radiací [12] nebo nádorovými podněty [13]. 8

19 4 Toll-like receptory PRR mají schopnost rozpoznat typické molekulární vzory spojené s patogeny (pathogen associated molecular patterns, PAMPs). Klíčovou roli v rozpoznávání těchto struktur a spuštění požadovaných imunitních reakcí ve vyšších organismech mají Toll-like receptory (TLR) [31]. Některé z těchto receptorů rozpoznávají také specifické molekulární vzory poškozených tkání vlastního organismu spojené se vznikem nebezpečí (dangerous associated molecular patterns, DAMPs) a opět vyvolávají příslušnou imunitní odpověď [32]. Transmembránový Toll receptor byl objeven v roce 1985 a jeho funkcí je rozpoznávání struktur napadajících organismů (dochází dokonce k rozlišení těchto organismů a tím ke spuštění různých signálních drah [33]). Původně byl Toll receptor identifikován jako gen, který určuje dorzoventrální osu v časné embryogenezi octomilky (Drosophila) [34]. Savčí homology receptoru Toll byly pojmenovány Toll-like. Lidské homology byly objeveny v roce 1997 a doposud známe 10 funkčních typů TLR receptorů lidských a 12 myších [3, 35]. Objev TLR byl natolik významný, že v roce 2011 byla udělena Nobelova cena vědcům J. Hoffmannovi a B. Beutlerovi za fyziologii a lékařství [3]. 4.1 Výskyt TLR Mezi buňky, které vystavují TLR na svém povrchu, patří nejen různé buňky imunitního systému, jejichž přehled je uveden v tabulce 4.1, ale také další buňky např. fibroblasty, kardiomyocyty a epiteliální buňky (např. dermální buňky, buňky intestinálního traktu) [33, 36]. Exprese TLR je rychle regulována jako odpověď na působení patogenů, různé cytokiny a stres, není statická [36]. TLR jsou vystavovány na buněčném povrchu (TLR 1, 2, 4, 5, 6, 10 a 11) nebo jsou lokalizovány v intracelulárních vesikulech v endoplazmatickém retikulu, endozomech, lysozomech a endolysozomech (TLR 3, 7, 8 a 9) [37, 38]. Dále mohou být TLR exprimovány jako homodimery nebo heterodimery, např. TLR1 + TLR2 (TLR1/2) nebo TLR2 + TLR6 (TLR2/6) [37]. Heterodimerizace rozšiřuje spektrum rozpoznávaných ligandů [39]. 9

20 4. Toll-like receptory TLR buňky imunitního systému TLR1 Většina typů buněk včetně dendritických buněk a B- lymfocytů TLR2 Periferní mononukleární leukocyty, dendritické buňky, monocyty a T-lymfocyty TLR3 Dendritické buňky, přirození zabíječi a T-lymfocyty TLR4 Makrofágy, dendritické buňky a T-lymfocyty TLR5 Monocyty, dendritické buňky, přirození zabíječi a T- lymfocyty TLR6 Vysoká exprese B-lymfocyty, dendritické buňky; nízká exprese monocyty, přirození zabíječi TLR7 B-lymfocyty, dendritické buňky, monocyty a T- lymfocyty TLR8 Monocyty, dendritické buňky; nízká exprese přirození zabíječi, T-lymfocyty TLR9 Dendritické buňky, B-lymfocyty, periferní mononukleární leukocyty, makrofágy, přirození zabíječi, mikroglie TLR10 B-lymfocyty; nízká exprese dendritické buňky Tabulka 4.1: Exprese TLR na různých buňkách imunitního systému (shrnuto ve zdroji [1]) 4.2 Struktura TLR TLR jsou transmembránové glykoproteiny typu I, které mají tři domény extracelulární, transmembránovou a intracelulární. Extracelulární doména je bohatá na leucin (LRR, leucin rich repeat) a obsahuje LxxLxLxxN motivů ( L představuje leucin, x jakoukoliv aminokyselinu, N N konec motivu [40]), kde každý z nich má délku aminokyselin. Všechny LRR struktury mají typický tvar podkovy, kde každý LRR motiv tvoří smyčku [41, 42]. Mezi jednotlivými smyčkami jsou vodíkové vazby [43]. Leucin a další hydrofobní residua tvoří hydrofobní jádro celého útvaru, stabilizují jej a představují tak konzervativní část, zatímco ostatní aminokyseliny vyčnívají směrem ven, mohou se značně lišit a představují tak variabilní část [42]. LRR tvoří strukturní jednotky, které se skládají z β listů a α smyček. β listy tvoří vnitřní osu podkovy (konkávní stranu), zatímco α smyčky představují boční struktury na konvexní straně [40]. Na N i C konci podkovy 10

21 4. Toll-like receptory dochází k tvorbě disulfidických vazeb, které chrání hydrofobní jádro před vnějším vodným prostředím. Svým strukturním uspořádáním poskytuje extracelulární doména velkou plochu pro vazebné interakce s ligandy z vnějšího i vnitřního prostředí [42]. Transmembránová doména určuje lokalizaci v buňce [44]. Cytoplasmatický konec receptoru obsahuje konzervativní doménu, která je velice podobná doménám, které obsahují receptory pro IL-1 a je proto nazývána Toll/IL-1 doména, neboli TIR. Navzdory podobnosti intracelulární části těchto receptorů se jejich extracelulární části strukturně liší, receptor pro IL-1 obsahuje imunoglobulinovou doménu [45]. TIR doména se skládá z přibližně 150 aminokyselinových reziduí [41]. 4.3 Ligandy TLR z vnějšího prostředí PAMP sktruktury se vyskytují typicky na povrchu buněk patogenních mikroorganismů. U gramnegativních bakterií jsou rozeznávány lipopolysacharidy (LPS), u grampozitivních bakterií peptidoglykan a lipoteichoová kyselina, u mykobakterií lipoarabinomanan a dále nemethylovaná DNA a bakteriální lipoproteiny. Tento systém rozpoznání mikrobiálních komponent je evolučně velice starý a byl objeven i u octomilky (Drosophila), u které je taková signalizace zprostředkována výše zmíněným Toll receptorem [33]. Každý TLR reaguje na jiný ligand. Obecně lze rozdělit TLR do tří skupin podle typu ligandů [46], jak je uvedeno v následujících podsekcích. Na obrázku 4.1 jsou znázorněny jednotlivé TLR se svými přirozenými ligandy z vnějšího prostředí TLR ropoznávající lipidy a lipoproteiny Do této skupiny patří TLR1, TLR2, TLR4 a TLR6. TLR4 v komplexu s proteiny myeloidního diferenciačního faktoru 2 (MD-2, myeloid differentiation factor 2) a CD14 (cluster of differentiation 14) rozpoznává zejména LPS z buněčné stěny gramnegativních bakterií, nicméně právě TLR4 má schopnost rozpoznat několik různých ligandů, které mají navíc odlišnou strukturu [36]. Mezi další ligandy patří např. protein respiračního syncytiálního viru, manan hub nebo glykoinositolfosfolipidy prvoků [47]. 11

22 4. Toll-like receptory Obrázek 4.1: Přehled jednotlivých TLR a jejich přirozených ligandů z vnějšího prostředí (upraveno ze zdroje [45]. TLR4 je v klidovém stavu buňky lokalizován v Golgiho aparátu a na plasmatické membráně. Aby došlo k translokaci receptoru z Golgiho aparátu na plasmatickou membránu a k jeho aktivaci LPS, je zapotřebí malý sekretovaný glykoprotein MD-2. LPS se váže pomocí proteinu LBP (LPS binding protein), který přenáší LPS na protein CD14. Prostřednictvím CD14 je pak LPS přenesen na komplex TLR4 s MD-2, čímž se spouští signální dráha [48, 49]. MD-2 se tak podílí nejen na distribuci receptoru v buňce, ale také na jeho aktivaci [50]. Struktura TLR4 s navázaným LPS je zobrazena na obrázku 4.2. TLR2 tvoří heterodimery s TLR1 nebo TLR6, které rozpoznávají peptidoglykan, lipopeptidy a lipoproteiny grampozitivních bakterií, lipopeptidy mykoplazmat a zymosan hub [36] TLR rozpoznávající proteiny Mezi TLR rozpoznávající proteiny patří TLR5 a myší TLR11 [46]. TLR5 je exprimován hlavně v buňkách střevního epitelu a je hojně zastoupen také v plicích. Je aktivován flagelinem, který tvoří vlákna bakteriálních bičíků a to pouze tehdy, pokud bakterie pronikne epitelem [36]. Myší TLR 11 rozpoznává doposud nepopsané komponenty uropatogenních bakterií [46] a molekulu podobnou profilinu parazitického prvoka Toxoplasma gondii [39, 52]. Lidský TLR11 je označován za nefunkční, protože jeho gen obsahuje stop kodon [36]. 12

23 4. Toll-like receptory Obrázek 4.2: Struktura dimerního komplexu TLR4 s MD-2 a navázaným LPS (upraveno ze zdroje [51]) TLR rozpoznávající nukleové kyseliny Receptory rozpoznávající nukleové kyseliny jsou TLR3, TLR7, TLR8 a TLR9. V intracelulárních vesikulech je prostředí kyselé, a proto je lokalizace těchto receptorů v intracelulárních vezikulech nezbytná, protože mohou být aktivovány právě jen v kyselém prostředí [38]. Umístění receptorů uvnitř buňky jim také umožňuje rozpoznávat nukleové kyseliny, které se zde zpracovávají během fagocytózy po napadení buňky virem nebo jinými patogeny. Nukleové kyseliny vlastní buňky, které se nachází v extracelulární hmotě, jsou rychle degradovány nukleázami a nevstupují do intracelulárních vesikulů, narozdíl od nukleových kyselin virů, které jsou před nukleázami chráněny proteinovým obalem [49]. I proto je lokalizace těchto TLR uvnitř buňky důležitá, jinak by mohlo dojít k interakci mezi receptorem a vlastní nukleovou kyselinou a spuštění nežádoucí autoimunitní reakce [53]. TLR3 rozpoznává virovou dvouřetězcovou RNA, jednořetězcovou virovou DNA jsou aktivovány TLR7 a TLR8 [39]. TLR7 reaguje také 13

24 4. Toll-like receptory na syntetické molekuly podobné imidazoquinolinu a guanosinové analogy (např. loxoribin) [46]. TLR9 rozpoznává nemethylovaná CpG místa DNA (část DNA s dvěma nukleosidy vázanými fosfátem, zde konkrétně cytosin-fosfát-guanosin), běžně se vyskytující v bakteriálních i virových genomech [39]. TLR10 je exprimován jako homodimer nebo heterodimer s TLR1 nebo TLR2, ale jeho ligand je zatím neznámý [54]. 4.4 Ligandy TLR z vnitřního prostředí TLR váží nejen ligandy patogenních struktur z vnějšího prostředí, ale interagují také s ligandy z vlastního vnitřního prostředí. Jsou to molekuly uvolněné z poškozených tkání nebo mrtvých buněk a regulují mnoho procesů, které provází sterilní zánět. Mezi ligandy z vnitřního prostředí patří buněčné komponenty a fragmenty extracelulární hmoty: proteiny a peptidy, polysacharidy a proteoglykan, nukleové kyseliny, lipoproteiny a malé organické molekuly [39]. Jejich přehled je uveden v tabulce 4.2 a jejich patofyziologické působení je shrnuto v kapitole 7. 14

25 4. Toll-like receptory TLR TLR1 TLR2 TLR4 TLR2 TLR4 TLR3 TLR7 TLR8 TLR9 TLR4 TLR2 TLR4 proteiny, peptidy β-defensin-3 proteiny teplotního šoku (HSP, heat shock proteins) HSP60, HSP70, gp96 (endoplasmin), HMGB1 (high mobility group box 1), β-defensin-3, surfaktantové proteiny A a D β-defensin-2, gp96 (endoplasmin), fibrinogen, fibronektin, HMGB1, HSP22, HSP60, HSP70, HSP72, resistin, proteiny S100, surfaktantové proteiny A a D, tenascin-c, laktoferin polysacharidy a peptidoglykan biglykan, versikan, fragmenty kyseliny hyaluronové biglykan, heparan sulfát, fragmenty kyseliny hyaluronové nukleové kyseliny mrna RNA RNA DNA lipoproteiny oxidované LDL částice (low density lipoprotein) malé organické molekuly urát sodný urát sodný Tabulka 4.2: Přehled ligandů TLR z vnitřního prostředí (vytvořeno na základě informací ze zdrojů [1, 39, 55]) 15

26 5 Signální dráhy TLR spouští různé signální dráhy na základě specifických kombinací čtyř adaptorových molekul: myeloidního diferenciačního faktoru 88 (MyD88, myeloid differentiation primary response protein 88), adaptorového proteinu indukujícího tvorbu interferonu β (TRIF, TIR domain containing adaptor inducing interferon β, známý také jako TICAM1), adaptorového proteinu podobnému TRIF (TRAM, TRIF related adaptor molecule, známý také jako TICAM2) a adaptorového proteinu TIRAP (TIR domain containing adaptor protein, známý také jako MAL) [1, 45]. Všechny tyto molekuly obsahují TIR doménu. Interakce mezi TIR doménami receptorů, adaptorů nebo receptoru a adaptoru jsou klíčové pro spuštění signalizace [41]. Signální dráhy pak aktivují transkripční faktory nukleární faktor κb (NF-κB) a aktivátorový protein 1 (AP- 1) a podněcují tvorbu různých zánětlivých cytokinů (např. TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 a IL-12 [46]) nebo aktivují interferonové regulační faktory (IRF, interferon regulatory factors) a tím produkci interferonů typu I (IFN-α/β) [39]. Signální dráhy TLR vyvolávají také up-regulaci kostimulačních molekul na dendritických buňkách, což je důležitý krok pro spuštění antigen-specifické odpovědi adaptivní imunity [46]. Rozlišujeme dvě hlavní signální dráhy dráhu závislou na MyD88 a dráhu na MyD88 nezávislou. MyD88 je univerzálním adaptorem a aktivuje signalizaci u všech TLR kromě TLR3 [46]. TLR3 a také TLR4 využívají pro alternativní dráhu nezávislou na MyD88 adaptor TRIF. U TLR2 (respektive TLR1/2 a TLR2/6) a TLR4 se MyD88 váže na jiný adaptor a to TIRAP. Adaptor TRAM představuje spojení mezi TLR4 a TRIF [53]. TLR4 je jediným receptorem, který váže čtyři adaptorové proteiny a aktivuje obě dráhy, na MyD88 závislou i nezávislou [56]. Spuštění jedné nebo druhé dráhy závisí na lokalizaci TLR4 v buňce [57]. 5.1 Dráha závislá na MyD88 Po navázání ligandů z vnějšího nebo vnitřního prostředí dochází k homodimerizaci nebo heterodimerizaci TLR a k vazbě adaptorových molekul dochází k interakcím TIR domén proteinů. Spojení 16

27 5. Signální dráhy TLR a MyD88, popřípadě spojení TLR, TIRAP a MyD88, stimuluje vazbu kinázy asociované s receptorem pro interleukin 1 (IRAK, IL-1 receptor associated kinase), konkrétně IRAK4. IRAK4 poté fosforyluje a tím aktivuje IRAK1 [45]. Následně se IRAK4 i IRAK1 odštěpí od MyD88 a interagují s faktorem 6 asociovaným s receptorem tumor nekrotizujícího faktoru (TRAF6, tumor necrosis factor receptor associated factor 6). TRAF6 představuje ubikvitin E3 ligázu, která tvoří komplex s ubikvitin konjugačními enzymy Ubc13 a Uev1A, čímž katalyzuje syntézu polyubikvitinových řetězců (vázány přes lysin 63) [46]. Ubikvitinace je nezbytná pro aktivaci transformujícím růstovým faktorem β aktivované kinázy 1 (TAK1, transforming growth factor β activated kinase 1) [58], která vytváří komplex s dalšími proteiny TAB1, TAB2 a TAB3 (TAK1 binding proteins) a aktivuje tak dvě možné dráhy, kterými může signál probíhat [46]. První možnost zahrnuje vazbu s komplexem IκB kinázy (IKK, IκB kinase). IKK komplex se skládá ze dvou katalytických podjednotek IKKα a IKKβ a jedné regulační podjednotky IKKγ (označuje se také jako protein NEMO) [59]. Aktivace komplexu IKK vede k fosforylaci kináz IκB, což je nezbytný krok pro jejich degradaci, a následně dochází k uvolnění a jaderné lokalizaci NF-κB. Tím je iniciována transkripce genů různých zánětlivých cytokinů [35, 46]. Druhý způsob vede k aktivaci (fosforylaci) transkripčního faktoru AP-1 prostřednictvím mitogenem aktivovaných proteinkináz (MAPK, mitogen activated protein kinases). Tato signalizace vede opět k expresi zánětlivých cytokinů [35, 46]. 5.2 Dráha nezávislá na MyD88 Tato dráha je nazývána také jako dráha závislá na TRIF. Uplatňuje se při signalizaci přes TLR3 a TLR4. Nejprve opět dochází k interakci TIR domén receptoru a adaptorových molekul. TLR3 má schopnost interagovat přímo s adaptorem TRIF, nicméně TLR4 vyžaduje pro vazbu TRIF ještě adaptor TRAM. Dále je signál zprostředkován faktorem 3 asociovaným s receptorem tumor nekrotizujícího faktoru (TRAF3, tumor necrosis factor receptor associated factor) a nekanonickými IKK: TANK vázající kinázou (TBK1, TANK binding kinase 1; TANK, TRAF family member associated NF-κB activator) a IKKɛ [60]. Dochází k 17

28 5. Signální dráhy aktivaci transkripčních faktorů IRF3 a IRF7, jejich translokaci do jádra a následné tvorbě interferonů typu I. Signalizace přes TLR3 může být převedena přes protein RIP1 (receptor interacting protein) na TRAF6, tedy molekulu, která se účastní dráhy závislé na MyD88, čímž dochází k aktivaci NF-κB jak je popsáno výše [61]. Také u signalizace přes TLR4 může dojít k aktivaci NF-κB přes TAK1 [1]. Obrázek 5.1 na konci kapitoly přehledně zobrazuje výše popsané signální dráhy. 5.3 Regulace signalizace Existuje mnoho látek, které regulují signalizaci přes TLR. Bez negativní regulace signalizace by mohlo dojít k rozsáhlým nebo dlouhotrvajícím zánětům, se kterými jsou spojena různá onemocnění včetně autoimunitních. V důsledku interakce signálních drah v buňce může docházet k pozitivním nebo negativním regulacím signalizace přes TLR. Například signalizace přes NLR, konkrétně přes receptory NOD1 a NOD2, může mít pozitivní efekt na TLR a a může vést k aktivaci NF-κB [57], na rozdíl od aktivace tyrosinkinázových receptorů TAM (Tyro3, Axl, Mer), které signalizaci přes TLR inhibují [62]. Některé procesy dokonce mohou mít pozitivní i negativní efekt, např. ubikvitinace proteinů. Jsou-li polyubikvitinové řetězce vázány přes lysin 63, pak dochází k aktivaci proteinů, ale pokud jsou vázány přes lysin 48, dochází k jejich degradaci [57]. Pátý adaptorový protein obsahující sterilní alfa a armadillo motiv (SARM, sterile alpha and armadillo motif containing protein) obsahuje jako ostatní adaptorové proteiny TIR doménu, přes kterou může interagovat s adaptorem TRIF a inhibovat signalizaci, která přes TRIF probíhá. Negativně tak reguluje celou dráhu na TRIF závislou [63]. Také některé bakterie a viry dokáží regulovat signalizaci přes TLR a zvýšit tak své šance na přežití v hostitelském organismu. Salmonella enteritica má protein podobný TIR doméně, který signalizaci přes TLR zabraňuje [64]. Uropatogenní kmen Escherichia coli s označením CFT073 obsahuje protein C, který obsahuje TIR doménu (TcpC, TIR containing protein C). Po uvolnění proteinu z bakterie dochází k jeho pohlcení makrofágy, protein C se váže na MyD88 a inhibuje 18

29 5. Signální dráhy signalizaci [65]. Některé viry z čeledi Poxviridae také produkují proteiny obsahující TIR doménu, které reagují s adaptorem MyD88 nebo TRIF a zabraňují aktivaci NF-κB [36]. Další variantou obrany virů je napadení samotných signálních molekul v hostitelském organismu. Např. virus hepatitidy C obsahuje proteázu, která štěpí adaptor TRIF a rozpojuje tak signální dráhu vedoucí k produkci IFN [66]. Glukokortikoidy jsou známé pro svůj protizánětlivý účinek. Inhibují totiž jak aktivaci MAP kináz [57], tak aktivaci transkripčních faktorů IRF3 a IRF7 [67], čímž opět negativně ovlivňují signalizaci a zabraňují tvorbě zánětlivých cytokinů. Rozpoznávání patogenů a následná signalizace nevede pouze přes jeden TLR, ale přes několik. Každý receptor pak rozpoznává jinou část patogenních struktur. Může docházet k aktivaci různých kombinací TLR, které spolu mohou spolupracovat (např. TLR3 a TLR4 v kombinaci s TLR7, TLR8 a TLR9) nebo se naopak rušit (např. TLR7, TLR8, TLR9 v kombinaci s TLR2) [37, 68]. 19

30 5. Signální dráhy Obrázek 5.1: Zobrazení hlavních signálních drah TLR (upraveno ze zdroje [1]) 20

31 6 Rozvoj specifické imunity T-lymfocyty i B-lymfocyty disponují různými receptory, nicméně jejich aktivace závisí na indukci kostimulačních molekul a cytokinech uvolněných během reakcí nespecifické imunity, tedy i při signalizacích přes TLR [69]. T-lymfocyty mohou také vystavovat určité TLR na svém povrchu a mohou tak reagovat na přímé spuštění signalizace [37]. Signalizace přes většinu TLR stimuluje buňky k produkci IL-12p70, který podporuje vznik T H 1 lymfocytů, které uvolňují IFN-γ. Samotný IFN-γ také stimuluje odpověď T H 1 lymfocytů [8]. Jiné ligandy TLR zase způsobují produkci IL-10, který stimuluje vznik T H 2 nebo T REG lymfocytů [37]. Vznik T H 17 lymfocytů je ovlivněn produkcí transformujícího růstového faktoru β (TGF-β, transforming growth factor β), IL-1β, IL-6 a interleukinu 23 (IL-23) [70]. Dendritické buňky jakožto antigen prezentující buňky, aktivované vazbou ligandu z vnějšího prostředí na jejich TLR, mohou ovlivnit vznik T C lymfocytů [37]. Signalizace přes TLR může ovlivňovat také B-lymfocyty a produkci protilátek. B-lymfocyty vystavují některé TLR na svém povrchu a při aktivaci receptoru ligandem dochází k polyklonální proliferaci a expresi kostimulačních molekul a je vyvolána také diferenciace plasmatických buněk [69]. Přestože je známo, že TLR ovlivňují imunitní odpověď T- i B- lymfocytů, zůstávají některá fakta nezodpovězená, např. do jaké míry je aktivita TLR nezbytná pro vyvolání odpovědi specifické imunity nebo jak TLR ovlivňují dlouhožijící paměťové buňky [37]. 21

32 7 Patofyziologie Ligandy z vnitřního prostředí spouští signalizaci TLR a indukují zánětlivou odpověď v mnoha patofyziologických procesech. Za patofyziologických podmínek jsou ligandy z vnitřního prostředí pasivně uvolňovány z poraněných tkání nebo z místa zánětu a umírajících buněk nebo jsou buňkami aktivně uvolňovány prostřednictvím lysozomální dráhy [71]. Za fyziologických podmínek TLR na ligandy z vnitřního prostředí nereagují [39]. TLR se spuštěním zánětlivých reakcí a zahájením procesu hojení podílí na udržování homeostázy tkání [42]. Vysoké systémové nebo lokální koncentrace DAMPs jsou spojovány s různými zánětlivými a autoimunitními onemocněními, s aterosklerózou nebo rakovinou. Nekrotické buňky uvolňují chromatinový protein HMGB1, který podporuje chronický zánět a další poškození tkání. Jeho zvýšené koncentrace jsou spojovány s aterosklerózou, diabetem, revmatoidní artritidou, sepsí a některými nádory [55]. HMGB1 může být také spojován s imunitní odpovědí následující po transplantacích [72]. Kromě HMGB1 uvolňují nekrotické buňky ještě proteiny teplotního šoku, které také mohou aktivovat TLR a podněcovat zánětlivou odpověď [42]. Zvýšená koncentrace těchto proteinů se očekává u aterosklerózy, diabetu, roztroušené sklerózy, sepse a dalších onemocnění včetně nádorových [55]. Při zánětu často dochází k poškození molekul, které se nachází v extracelulární hmotě. Příkladem takové molekuly je hyaluronan, který je enzymaticky štěpen během zánětu na menší fragmenty kyseliny hyaluronové [73]. Další molekulou, která je uvolňována z extracelulární hmoty je fibronektin nebo biglykan. Na všechny tyto molekuly TLR reagují a podporují zánětlivou reakci [42]. Vysoké koncentrace biglykanu doprovází např. aterosklerózu, revmatoidní artritidu, kolorektální karcinom, osteosarkom a karcinom pankreatu [55]. Tenascin-C se také řadí mezi proteiny extracelulární hmoty a je uvolňován zejména v kloubech postižených artritidou. Navázáním na TLR4 spouští signální dráhu a podporuje zánět [39]. Jeho zvýšená koncentrace je charakteristická nejen pro artritidu, ale i pro jiná one- 22

33 7. Patofyziologie mocnění, např. aterosklerózu, astma, diabetes, sepsi, nádory mozku, nádory prsu a další [55]. Při hnisavých nebo alergických zánětech dochází k degranulaci neutrofilů a eosinofilů. Proteiny uvolněné z jejich granulí mohou být ligandy některých TLR, např. β-defensiny, a spouštět signalizaci. Z fagocytů se v místě zánětu uvolňují proteiny S100, které také mohou aktivovat TLR a ovlivňovat tak další zánětlivé pochody [39, 55]. TLR4 mohou být vystavovány na povrchu makrofágů v přítomnosti oxidovaných LDL částic. Taková aktivace hraje důležitou roli v reakcích podporujících zánět při ateroskleróze [74]. Mezi ligandy TLR patří i RNA, která se může uvolňovat z odumřelých tkání nebo může být obsažena v endocytozovaných buňkách [39]. TLR nalezneme také na nádorových buňkách, kde jejich aktivace vede k proliferaci nádorových buněk a odolnosti k apoptóze. Dochází ale také k syntéze prozánětlivých cytokinů a molekul s imunosupresivními účinky, čímž se nádorové buňky brání před napadením T C lymfocyty a rozpoznáním imunitním systémem [2]. Z výše popsaných reakcí vyplývá, že cílené využití ligandů TLR může být výhodné pro léčbu různých onemocnění. Jako adjuvancia se používají ve vakcínách proti nádorovým a infekčním onemocněním. Tyto vakcíny využívají signalizaci pomocí TLR ke zvýšení antigen specifické imunitní odpovědi. Ligandy TLR lze tedy využít v terapii pro zvýšení produkce prozánětlivých cytokinů a nebo naopak lze tyto signální dráhy inhibovat a produkci prozánětlivých cytokinů zamezit, čímž se odpověď imunitního systému utlumí [32]. 23

34 8 Cíl práce Cílem této práce bylo zpracovat literární rešerši v oblasti signalizace pomocí Toll-like receptorů, jak z pohledu jejich signálních drah, tak z pohledu jejich agonistů a antagonistů z kategorie PAMP i DAMP a fyziologických/patofyziologických procesů v organismu. V praktické části práce pak bylo prováděno testování aktivace jednotlivých receptorů specifickými ligandy pomocí metody ELISA. 24

35 9 Materiál a metody V praktické části práce bylo prováděno testování aktivace receptorů TLR1/2, TLR2/CD14 a TLR2/6 specifickými ligandy. Byly testovány klony embryonálních buněk ledvin HEK293 (human embryonic kidney cells). Buňky byly vysety na 6jamkovou desku (TPP) a byly kultivovány 24 hodin. Následně jim bylo vyměněno médium s přídavkem (označeno znaménkem +) nebo bez přídavku příslušného ligandu (označeno znaménkem -). Expozice trvala 48 hodin, poté bylo médium odebráno. V médiu byla následně stanovována koncentrace IL-8. Seznam klonů s TLR1/2: 4D6, 4J4, 4D7, 4F4, 4D1, 4G7, 4D2, 4D4 Specifický ligand pro TLR1/2: Pam3CSK4 (syntetický triacylovaný lipoprotein) Seznam klonů s TLR2/CD14: 1A, 1B, 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F a navíc 1/2 (směs klonů s TLR1/2, jejich seznam je uveden výše) Specifický ligand pro TLR2/CD14: HKLM (usmrcené bakterie Listeria monocytogenes, heat killed Listeria monocytogenes) Seznam klonů s TLR2/6: 3A, 3B Specifický ligand pro TLR2/6: FSL-1 (syntetický diacylovaný lipoprotein, follistatin-like) Testování bylo provedeno pomocí metody ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Tato metoda má několik variant, při tomto pokusu byla provedena standardní sendvičová ELISA. Jako antigen byl tedy detekován IL-8, který byl navázán mezi dvě protilátky, přičemž na 25

36 9. Materiál a metody sekundární (detekční) protilátku byla navázána křenová peroxidáza. Substrátem pro peroxidázu byl roztok 3,3,5,5 -tetramethylbenzidinu. Po jeho chemické přeměně vznikl barevný produkt a reakce byla ukončena kyselinou sírovou. Vyhodnocení metody bylo provedeno spektrofotometricky. Pro analýzu byl použit kit Human IL-8 ELISA Ready-SET-Go! (2nd Generation) od firmy ebioscience (katalogové číslo ), který se používá pro kvantitativní detekci lidského IL-8 v séru, plasmě a supernatantu tkáňových kultur. Obsah kitu: primární protilátka: anti-human IL-8, 250x koncentrovaná sekundární (detekční) protilátka: anti-human IL-8 Biotin, 250x koncentrovaná standard: lidský IL-8 rekombinantní protein, koncentrace = 1 µg/ml koutovací pufr: 10x koncentrovaný rozpouštědlo: fosfátový pufr doplněný fetálním hovězím sérem, 5x koncentrovaný detekční enzym: enzym Avidin-HRP (horseradish peroxidase, křenová peroxidáza), 250x koncentrovaný roztok substrátu: TMB (3,3,5,5 -tetramethylbenzidin), 1x koncentrovaný 96jamková destička Další roztoky: promývací fosfátový pufr, 0,05 % (připraven v laboratoři) roztok pro ukončení reakce: 2N H 2 SO 4 (od firmy Penta) Přístroje: promývačka (od firmy SLT Labinstruments) SUNRISE - ELISA spektrofotometr (od firmy Schoeller Instruments) 26

37 9. Materiál a metody 9.1 Postup analýzy 1. Navázání primární protilátky na dno jamek: Ve 12 ml zředěného koutovacího pufru (1 díl koutovacího pufru, 9 dílů destilované vody) bylo rozpuštěno 48 µl primární protilátky. Z tohoto roztoku bylo pipetováno 100 µl do každé jamky destičky. Poté byla destička přikryta folií a inkubována přes noc při 4 C. 2. Promytí jamek promývacím pufrem v promývačce třikrát (>250 µl na jamku). 3. Nanesení rozpouštědla: 1 díl 5x koncentrovaného rozpouštědla byl rozpuštěn ve 4 dílech destilované vody, 200 µl výsledného roztoku bylo naneseno multikanálovou pipetou do každé jamky. Destička byla opět přikryta fólií a následovala inkubace při pokojové teplotě 1 hodinu. 4. Promytí jamek promývacím pufrem v promývačce třikrát. 5. Do prvních dvou sloupců jamek na destičce byla připravena kalibrační řada standardu. Příprava nejvyšší koncentrace standardu 250,00 pg/ml: 1 µl standardu byl rozředěn ve 4 ml zředěného rozpouštědla (ředění viz 3. bod), do příslušných jamek pak bylo naneseno 100 µl takto připraveného roztoku. Ředěním standardu o nejvyšší koncentraci zředěným rozpouštědlem byly připraveny roztoky o koncentracích standardu 125,00 pg/ml, 62,50 pg/ml, 31,25 pg/ml, 15,63 pg/ml, 7,81 pg/ml a 3,91 pg/ml. Z každého roztoku bylo naneseno 100 µl do příslušných jamek. Do posledních dvou jamek prvních dvou sloupců na destičce bylo pipetováno 100 µl zředěného rozpouštědla. Do ostatních jamek bylo pipetováno 100 µl vlastních vzorků (schéma nanesených vzorků je zobrazeno v tabulkách 9.1, 9.2 a 9.3). Destička byla opět přikryta fólií a následovala inkubace při pokojové teplotě 2 hodiny. 6. Promytí jamek promývacím pufrem v promývačce třikrát. 7. Nanesení sekundární (detekční) protilátky: 48 µl protilátky bylo zředěno ve 12 ml zředěného rozpouštědla. Z takto připraveného roztoku bylo pipetováno 100 µl do každé jamky. Destička 27

38 9. Materiál a metody byla opět přikryta fólií a následovala inkubace při pokojové teplotě 1 hodinu. 8. Promytí jamek promývacím pufrem v promývačce třikrát. 9. Nanesení enzymu: 48 µl enzymu bylo zředěno ve 12 ml zředěného rozpouštědla, poté bylo pipetováno 100 µl takto připraveného enzymu do každé jamky. Destička byla opět přikryta fólií a následovala inkubace na tmavém místě při pokojové teplotě 30 minut. 10. Promytí jamek promývacím pufrem v promývačce třikrát. 11. Do každé jamky bylo pipetováno 100 µl substrátu. Destička byla opět přikryta fólií a následovala inkubace při pokojové teplotě přibližně 15 minut (podle intenzity zbarvení). 12. Bylo přidáno 50 µl 2N H 2 SO 4 do každé jamky pro ukončení reakce. 13. Spektrofotometrické vyhodnocení při 450 nm (referenční filtr 570 nm). Poznámka: v používaných roztocích se nesmí vyskytovat azid sodný, inhibuje aktivitu křenové peroxidázy. Standard [pg/ml] Rozložení vzorků A 250,00 250,00 4D6+ 4D6+ 4D1+ 4D1+ B 125,00 125,00 4D6-4D6-4D1-4D1- C 62,50 62,50 4J4+ 4J4+ 4G7+ 4G7+ D 31,25 31,25 4J4-4J4-4G7-4G7- E 15,63 15,63 4D7+ 4D7+ 4D2+ 4D2+ F 7,81 7,81 4D7-4D7-4D2-4D2- G 3,91 3,91 4F4+ 4F4+ 4D4+ 4D4+ H 0,00 0,00 4F4-4F4-4D4-4D4- Tabulka 9.1: Rozložení vzorků na destičce při testování TLR1/2 28