Využití variability DNA ve studiu příbuzenských vztahů linií a rodin plemene koně genové rezervy 1. ÚVOD

Transkript

1 Využití variability DNA ve studiu příbuzenských vztahů linií a rodin plemene koně genové rezervy 1. ÚVOD Předmětem ochrany se stávají stále častěji nejen divoce ţijící druhy ţivočichů, ale také tradiční a původní plemena hospodářských zvířat. Důvody k jejich ochraně jsou velmi rozmanité od kulturně historických, zájmových, ekologických atd. aţ po čistě utilitární tato plemena mohou slouţit jako rezervoár těch genů a alel, které byly u vysoce produktivních kulturních plemen eliminovány. Má-li být tento poţadavek uspokojen, stejně tak jako má-li být zajištěno přeţití a udrţena ţivotaschopnost těchto často málopočetných plemen (z nichţ mnohá jsou na hranici vyhynutí), je nutno udrţet jejich genetickou variabilitu na co moţná nejvyšší úrovni. K tomuto účelu jsou rozpracovány různé chovatelské postupy, které se ovšem neobejdou bez důkladné genetické analýzy. Míra polymorfismu těchto plemen, zejména pak jsou-li vystavena inbreedingu, je důleţitou charakteristikou takové analýzy (Frankham, 1995). Polymorfní genetické markery se mohou pouţívat nejen k mapování rozsahu a rozloţení polymorfismu ve sledovaných populacích, ale mohou téţ poslouţit jako základ pro vytvoření strategií na zachování jejich variability. Nástrojem k takovým genetickým analýzám, který zejména poslední dvě dekády zaznamenává bouřlivý rozvoj, je zkoumání polymorfismu DNA, především pak mikrosatelitní a mitochondriální. 6

2 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Polymorfismus DNA nástroj genetické analýzy Nástup masivního vyuţívání variability DNA pro potřeby identifikace individuí, určování parentity i studia příbuzenských vztahů mezi jednotlivci či skupinami různé taxonomické úrovně spadá do 2. poloviny 80. let minulého století. Zásadní vliv na to měl mohutný rozvoj tzv. DNA technologií, které nesmírně urychlily a zjednodušily analýzu DNA, zejména pak metoda PCR vynalezená r Kary Banksem Mullisem (Nobel Foundation official web site; Kary Mullis' personal website), a dále metody automatizovaného sekvenování. Uţitím těchto technik se analýza DNA stala rutinní záleţitostí. Identifikační metody pomocí analýzy polymorfismů DNA rozpracoval A. Jeffreys, (Jeffreys et al., 1985 a,b,c) ve formě DNA fingerprintingu a jako první pouţil těchto metod v praxi k určení parentity a totoţnosti (Aronson 2005). Brzy nato se techniky DNA fingerprintingu (téţ DNA typing, DNA profiling, genetic profiling, otiskování nukleové kyseliny, dle Rosypal et al. 2001) začaly prosazovat i v chovu domácích a hospodářských zvířat (Buitkamp et al. 1991). 7

3 2.2. Organizace a struktura genomu DNA eukaryontních buněk se nachází jednak v jádře, jednak mimo jádro v tzv. semiautonomních organelách (obr. 1 a 2, tab. 1). U ţivočichů jsou tyto semiautonomní organely zastoupeny mitochondriemi. Ke genetickému testování ţivočichů se pouţívá obou těchto typů DNA. Obr. 1: Rozložení jaderné a mimojaderné (zde mitochondriální) DNA v buňce Mitochondriální a nukleární DNA je zde zobrazena pomocí fluorescenční mikroskopie. Tato mikrofotografie ukazuje rostoucí buňku bičíkovce Euglena gracilis. Buňka je obarvena směsí ethidium bromidu a DiOC6, která způsobuje červenou fluorescenci jaderné DNA a zelenou mtdna. Místa bohatá na mtdna emitují ţluté světlo. (Darnell et al. 1990, str. 686, in: Říha (2000) Mitochondrie) 8

4 Tab. 1: Souhrn znaků semiautonomních organel Mají vlastní DNA prokaryontního typu. Jsou schopny proteosyntézy pomocí vlastních ribosomů prokaryontního typu. Jsou kryty dvěma membránami. Probíhá v nich energetický metabolismus. Vznikly endosymbiózou raných eukaryot s prokaryontními organismy. Velikostí se podobají bakteriím. Dlouhodobým souţitím s hostitelskou buňkou ztratily schopnost samostatného přežití, protoţe se redukoval jejich genom a proteosyntetický aparát Jsou schopny samostatné reprodukce, mnoţí se v buňkách dělením do značné míry nezávisle na hostitelské buňce jinak vznikat nemohou. Jejich počet je však regulován genetickou informací jádra. Ta také řídí takřka rovnoměrné rozdělení semiautonomních organel do dceřiných buněk. Mají matrilineární dědičnost Savčí genom je z převáţné části tvořen jaderným genomem. U člověka, kterého jakoţto typického savce lze pokládat za vhodný modelový organismus a jehoţ genom byl kompletně zmapován díky projektu lidského genomu HPG (Human Genome Project Information), činí podíl jaderného genomu 99,9995 % a na mitochondrie zbývá 0,0005 %, viz obr. 2 (Strachan and Read 1999, Human Genome Project Information XII-2007). 9

5 Obr. 2: Organizace DNA sekvencí lidského genomu (Strachan and Read 1999, s. 139; Hruban et al. 1999, s. 70) SINE = short interspersed elements = krátké vtroušené elementy LINE = long interspersed elements = dlouhé vtroušené elementy * Podle současných zjištění je lidský jaderný genom tvořen 3 164,7 Mpb a počet jaderných genů se odhaduje na (Human Genome Project Information (XII-2007) 10

6 Jaderná DNA Jaderná DNA je rozdělena do druhově specifických útvarů zvaných chromozómy. Kůň domácí (Equus caballus) má 64 chromozómů, z toho 31 párů autozómů a 2 gonozómy. DNA se v jaderných chromozómech nachází v komplexu se specifickými proteiny, zejména histony, s nimiţ vytváří tzv. nukleohistonové vlákno, neboli nukleohistonový komplex (Brown 1999, Kočárek 2004). Podle dosavadních zjištění HPG méně neţ 2 % lidského jaderného genomu kóduje proteiny. Repetitivní sekvence tvoří přinejmenším 50 % lidského genomu. Přitom však 99,9 % nukleotidových bází je u všech lidí stejných (Human Genome Project Information XII-2007). Ke genetickým analýzám se dá pouţít jakékoli části genomu, jako výhodnější se ovšem jeví vyuţití nekódujících, resp. extragenových sekvencí (viz obr. 2), které obecně vykazují větší variabilitu neţ kódující (Brown 1999). Pro své první genetické analýzy Jeffreys pouţil tzv. minisatelity (Jeffreys et al a, b, c). Minisatelity spolu s mikrosatelity patří do skupiny tandemových repetitivních sekvencí extragenové DNA, které jsou tvořeny opakujícími se nukleotidovými motivy různého typu řazenými za sebou. Jejich variabilita spočívá v různém počtu opakování těchto motivů v daném lokusu u různých jedinců téhoţ druhu různé alely jsou tedy tvořeny různými počty opakování týchţ nukleotidových motivů. Dědičnost mini- i mikrosatelitů je mendelistická. Minisatelity dosahují délky aţ 20 kb, přičemţ opakující se jednotka můţe mít aţ 25 bází. Mikrosatelity se skládají z desetkrát aţ dvacetkrát opakovaných mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidových motivů (obr. 3). Koncem 80. let se DNA fingerprinting pomocí minisatelitů rozšířil po celém světě a stal se mezinárodním standardem pro genetické testování. Jeffreys si však uvědomoval limity této techniky - pokládal ji za pomalou, nepříliš citlivou a zastaralou. Proto svou pozornost zaměřil na mikrosatelity, které díky své délce kolem sta párů bází oproti několika tisícům párů bází minisatelitů poskytovaly dostatečně vari- 11

7 abilní lokusy, avšak snadněji amplifikovatelné a zároveň odolnější vůči degradaci (Zagorski 2006). I v této věci má Jeffreys světový primát, kdyţ jako první pouţil mikrosatelity k identifikaci ostatků nacistického lékaře Josefa Mengeleho (Jeffreys et al. 1992). Obr. 3: Schematické znázornění mikrosatelitu 1. chromozóm (1. alela) 5 3 CATCATCATCATCATCAT GTAGTAGTAGTAGTAGTA chromozóm (2. alela) 5 3 CATCATCAT GTAGTAGTA 3 5 (CAT)n = mikrosatelitní repetitivní motiv primery Po několika letech tato technika nahradila DNA fingerprinting pomocí minisatelitů a stala se novým standardem pro forenzní vědu (Zagorski 2006). Ačkoliv jsou mikrosatelity relativně krátké, vyskytují se v genomu hojně a jsou v něm více méně rovnoměrně rozprostřeny. Například u člověka mikrosatelity s motivem CA jako 5 - CACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGT-5 tvoří aţ 0,5 % genomu, celkem 15 Mb. 12

8 Mikrosatelity sloţené z jedné báze typu 5 - AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT-5 tvoří další 0,3 % (Brown 1999). Obecně v genomu savců bývá motiv (CA)n, resp. (AC)n zastoupen nejvíce. K dalším často se vyskytujícím motivům patří např. (GATA)n, (GACA)n, (CAC)n. U koní je jedním z nejrozšířenějších vysoce polymorfní motiv (TG)n, jehoţ podíl na celkové délce nukleární DNA je přibliţně 1 ku bp. (Hamanová, 2005). U koní se mikrosatelity označují velkými písmeny, přičemţ jednotlivá písmena označují určitou alelu (Burócziová et al., 2005). Funkce mikrosatelitů v genomu nebyla dosud uspokojivě objasněna, avšak z dosavadních studií vyplývá, ţe jejich distribuce patrně není náhodná. Vyskytují se např. u promotorů kódujících sekvencí, přičemţ tyto promotory slouţí také jako zesilovače (Zima et al., 2004). Předpokládá se, ţe některé z mikrosatelitů jsou schopny vázat specifické regulační proteiny. Podílejí se pravděpodobně na organizaci chromatinu, regulaci exprese genů, rekombinaci, replikaci a reparaci DNA a zřejmě téţ hrají nějakou roli v buněčném cyklu (Kraic, 2005). Délka mikrosatelitních repeticí můţe podle některých studií dokonce ovlivňovat fyziologii a ontogenezi uvádí se např. souvislost mezi extrémním zmnoţením repeticí a některými váţnými vývojovými poruchami, jako mentální retardace. (Zima et al., 2004). Mikrosatelity se široce vyuţívají téţ jako vysoce informativní genetické markery při analýzách populací, které umoţňují detekci případů porušení genetické rovnováhy v důsledku selekce, migrace, náhodného genetického driftu, stejně jako stanovení stupně inbreedingu (Dovc et al. 2006). Některé práce ukazují, ţe mikrosatelity mohou být pouţity ke zjištění příslušnosti jedince k jednotlivé populaci či subpopulaci (Rannala and Mountain, 1997; Cornuet et al., 1999). Ověřením této teorie pomocí porovnání analýzy mikrosatelitních markerů a analýzy na základě rodokmenových informací u simulované populace se zabývali Baumung and Sőlkner (2003). 13

9 Využití mikrosatelitní DNA v genetických studiích u koní U koní se polymorfismu mikrosatelitní DNA vyuţívá mj. k určování původu a příbuzenských vztahů jedinců i populací a k odhadům genetické diverzity. Např. Hořín et al. (1998) pouţil analýzy 12 mikrosatelitů (spolu s některými dalšími polymorfickými systémy) ke studiu polymorfismu, heterozygotnosti a genetických distancí u starokladrubských koní. Jednalo se o tyto lokusy: AHT4, AHT5, ASB2, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTGG, HTG4, HTG7, HTGl0 a VHL20. Zjistil, ţe vraníci a bělouši vykazují blízkou genetickou příbuznost, avšak průměrná genetická distance mezi nimi ţe je na úrovni dvou různých plemen. Heterozygotnost u lipicánů na základě analýzy 17 mikrosatelitních lokusů na 14 chromozómech (AHT4, AHT5, AHT21, HMS1, HMS2, HMS6, HMS7, HMS8, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, LEX053, UCDEQ405, UCDEQ437, UCDEQ505 a VHL20) sledovali Curik et al. (2003). Rozsáhlou studii genetické diverzity lipicánů provedli téţ Achmann et al. (2004). V rámci této studie byl vyhodnocen 561 lipický kůň ze 7 evropských zemí a 47 kladrubských koní. Na základě analýzy 22 mikrosatelitních lokusů na 16 chromosomech (AHT4, AHT5, AHT21, ASB2, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HMS8, HTG4, TG6, HTG7, HTG10, LEX053, LEX054, MPZ002, NVHEQ18, UCDEQ405, UCDEQ437, UCDEQ505 a VHL20) bylo stanoveno, ţe genetická diverzita u lipicánů je obdobná jako u jiných plemen a ţe mezi lipicány z různých hřebčínů existuje sice mírná, avšak zřetelná genetická odlišnost. Byly objeveny tři genetické skupiny: skupina tvořená subpopulacemi Rakouska, Slovinska a Itálie a reprezentující chov lipicánů v nejklasičtější podobě; skupina sloţená z chorvatské, slovenské a maďarské subpopulace a nakonec rumunská subpopulace, která tvoří zvláštní genetickou jednotku. Největší genetická odlišnost byla zaznamenána mezi rumunskou a italskou subpopulací. Genetická rozdílnost lipicánů a kladrubských koní je jasně patrná. Dále bylo zjištěno, ţe výsledky genetického rozboru odpovídají historickým faktům. Správnost chovatelské dokumentace byla potvrzena u 80,9%, resp. 91,1% lipických koní (v závislosti na tom, zda z dokumentace byla vyloučena zvířata získaná odjinud). 14

10 Azor et al. (2007) se zaměřili na španělské klusáky (Trotador Español), plemeno vzniklé kříţením klisen původních baleárských plemen s orlovskými, francouzskými a americkými klusáky. Bylo pouţito 16 mikrosatelitních markerů ke genetické analýze 40 vzájemně nepříbuzných španělských klusáků, 25 původních baleárských koní (Menorquina 11koní, Mallorquina 14 koní) a 32 andaluských koní. Bylo zjištěno, ţe průměrná heterozygotnost i průměrný počet alel na lokus je u španělských klusáků srovnatelný s hodnotami jiných plemen. Dále bylo potvrzeno, ţe příbuznost mezi španělskými klusáky a baleárskými plemeny je v současné době nízká, coţ znamená, ţe genofond současných španělských klusáků není zaloţen na původních populacích baleárských koní. Všechny zde citované práce konstatují, ţe dosaţených výsledků a závěrů lze velmi dobře vyuţít k vývoji chovatelských strategií zaměřených zejména na zachování genetické diverzity. 15

11 Mitochondriální DNA Obecná charakteristika Obr. 4: Zobrazení mtdna v elektronovém mikroskopu Cvrčková 1994, str. 428, in: Říha (2000) Mitochondrie Mitochondriální DNA se od jaderné DNA liší v mnoha ohledech. Především se dědí téměř výhradně maternálně (Hutchison et al. 1974), ojedinělé případy průniku mitochondrií ze spermie do vajíčka jsou pozorovány velmi vzácně (Kondo et al. 1990, Gyllensten et al. 1991, Avise 1991, Kaneda et al., 1995). Není vázána v komplexu s proteiny. Nemá schopnost rekombinací, takţe její genetická rozmanitost je vytvářena mutacemi (Brown 1985; Hagelberk et al., 1999; Hruban et al. 1999; Pesole et al. 1999). V mitochondrii se vyskytuje v několika identických exemplářích, někdy však dochází k tzv. heteroplazmii, kdy některá molekula mtdna zmutuje a v jednom organismu, případně i v jedné buňce či mitochondrii se pak mohou vyskytovat rozdílné molekuly mtdna (Hruban et al. 1999). Další významnou specifikou mtdna je genetický kód, který se liší nejen od jaderného, ale i mezi mitochondriemi jednotlivých druhů organismů, viz tab. 2 (Říha 2000). 16

12 Tab. 2: Odlišnosti mitochondriálního genetického kódu Kodón Jaderné geny prokaryí i Mitochondrie eukaryí, chloroplasty Savci Drosophila Neurospora Kvasinky Rostliny UGA Stop Trp Trp Trp Trp Stop AGA AGG Arg Stop Ser Arg Arg Arg AUA Ileu Met Met Ileu Met Ileu AUU Ileu Met Met Met Met Ileu CGG Arg Arg Arg Arg Arg Arg+Trp CUU CUC CUA CUG Leu Leu Leu Leu Thr Leu (Darnell et al.1990, str.690, in: Říha (2000) Mitochondrie) Mitochondriální genom má řadu pozoruhodných a odporujících si vlastností. Především je velmi rozmanitý. Jeho velikost se pohybuje od 6 kpb (prvoci Plasmodium sp., původci malárie) aţ po více neţ 2000 kpb u některých vyšších rostlin (Cucurbitae). U většiny eukariot však kolísá mezi kpb (Burger et al., 2003, Brown 1999, Říha 2000). Obsah mitochondriálního genomu se pohybuje od 100 genů u jakobid (Jakoba sp. bičíkovci, kteří by dle Edgcomb et al. (2001) a Burger et al. (2003) mohli představovat raná mitochondriální protista) aţ po pouhých pět u plasmodií (Burger et al. 2003). Dále je nutno zmínit velmi rozmanitou organizaci a podíl kódujících a nekódujících oblastí DNA. Např. u vláknité houby Podospora anserina se na celkové délce mtdna kódující sekvence podílejí 25 procenty, zatímco mitochondriální genom savců je velmi úsporný a kondenzovaný (některé geny se např. u koní dokonce překrývají, viz Xu and Árnason 1994) a podíl nekódujících sekvencí je menší neţ 10 % (Brown 1985, Říha 2000, Xu and Árnason 1994). Donedávna se mělo za to, ţe DNA se u většiny organismů v mitochondriích vyskytuje ve formě jednoho kruhového chromozómu, byť ve více identických kopiích (Boore 1999, Říha 2000) - s výjimkou heteroplasmie, coţ je jev, kdy v jednom organismu nebo dokonce i v jednotlivých buňkách se vyskytují mutované varianty DNA (Hruban et al. 1999, Říha 2000). V současné době však přibývají přesvědčivé důkazy, ţe značná část mtdna, pokud ne většina, se primárně vyskytuje ve formě lineárních 17

13 molekul. Z mnohobuněčných ţivočichů mají jednu lineární molekulu mtdna například některá Cnidaria (ţahavci), u řady organismů se však mtdna skládá z několika oddělených lineárních molekul. Jako naprosto extrémní případ se v tomto směru jeví prvok Amoeboidium parasiticum, jehoţ mtdna se skládá z několika set různých typů lineárních molekul (Lang et al. 2002). Co se týče ţivočichů vybavených cirkulární mtdna, i zde byly objeveny případy s několika různými molekulami např. u háďátka Globodera sp. a morulovce rodu Dicyema (Burger et al. 2003). Mitochondriální genom parazitických bičíkovců rodu Trypanosoma sestává dokonce z několika tuctů velkých maxikruţnic kódujících geny, a několika tisíců minikruţnic, které specifikují řídící RNA (guide RNA, grna), podílející se na editování mitochondriální mrna. Navzdory vysoké genetické plasticitě si však jsou všechny typy mitochondrií funkčně velmi podobné. Lze prohlásit, ţe často bizarní rozdíly ve struktuře a evoluční dynamice jejich genomů se na funkci mitochondrií neprojevují (Říha 2000). 18

14 Savčí mtdna Savčí mitochondriální DNA má naproti tomu poměrně jednotnou stavbu. Co se týče zastoupení bází, v kompletní molekule je pár G-C zastoupen 41 % a pár A-T 59%. Dva řetězce kruhového mitochondriálního chromosomu mají nerovnoměrný podíl G- a C- bází, coţ způsobuje rozdílné hmotnosti řetězců. Řetězec s převahou guaninu se nazývá těţký řetězec a označuje se H-strand (heavy strand), řetězec s převahou cytosinu je lehčí, nazývá se tedy lehký řetězec, neboli L-strand (light strand). V lehkém řetězci (L-strand) jsou jednotlivé báze zastoupeny v tomto poměru: A 32,2 %; C 28,5 %; G 13,4 %; T 25,9 % (MITOMAP 2007). Rozměr molekuly mtdna se pohybuje kolem16,5 kpb (Říha 2000), genom je úsporný a podíl nekódujících sekvencí je malý. Mitochondriální chromozóm je kruhový. Obsahuje vţdy těchto 37 genů: 2 pro rrna, 13 pro proteiny a 22 pro trna (Boore 1999, Brown 1985, Říha 2000, Xu and Árnason 1994, MITOMAP 2007; viz obr. 5 a tab. 3) Obr. 5: Stavba lidské mtdna. Transkripce vnějšího vlákna, H-strand (těžký řetězec), probíhá pouze ve směru hodinových ručiček; transkripce vnitřního, L-strand (lehký řetězec), proti směru. Pytlík 1996, str , in: Říha (2000) Mitochondrie 19

15 Nejproměnlivějším úsekem mtdna je její hlavní nekódující oblast, tzv. oblast D-smyčky (D-loop region) nebo téţ kontrolní oblast. Tento úsek obsahuje hlavní regulační prvky pro replikaci a expresi mitochondriálního genomu. Jeho název je odvozen od třívláknové struktury v podobě vytěsněné (displacement) smyčky, která se tvoří při replikaci nově vznikajícím těţkým řetězcem vytěsňujícím rodičovský H- strand. Struktura oblasti D-smyčky vykazuje výrazné mezidruhové rozdíly. Její délka kolísá mezi 800 aţ1400 pb, můţe se však ještě značně zvětšit díky repetitivním sekvencím, které se vyskytují u některých druhů (Sbisà et al. 1997). Frekvence nukleotidových substitucí se u mitochondriální DNA uvádí obvykle jako 5 aţ 10 krát vyšší neţ u jaderné DNA (Brown et al. 1979), to je však značně zjednodušující pohled. Frekvence nukleotidových substitucí je v různých úsecích mitochondriální DNA různá například v nekódující kontrolní oblasti (D-loop) je u člověka podle odhadu 2,8 aţ 5krát vyšší neţ ve zbytku mitochondriálního genomu (Aquadro and Greenberg, 1982, Cann et al. 1984). Některé úseky vykazují frekvence nukleotidových substitucí srovnatelné s jadernými, jiné však mutují 20 krát (např. lokus malé rrna), některé dokonce aţ 100 krát rychleji (trna) neţ jejich jaderné protějšky (Pesole et al. 1999). Ke genetickým studiím byla mitochondriální DNA poprvé vyuţita v polovině 80. let Mary Claire Kingovou v cause Abuelas de Plaza de Mayo. Jednalo se o prokázání biologické příbuznosti mezi osiřelými dětmi a jejich prarodiči. Pouţití jaderné DNA bylo v tomto případě problematické vzhledem k tomu, ţe na dítě přenáší od kaţdého rodiče jen 50 % jaderné DNA. Bylo by tedy nutné analyzovat DNA všech čtyř prarodičů, aby bylo moţno s jistotou určit původ dítěte. Pokud by jeden nebo dva z prarodičů nebyli k dispozici, identifikace dítěte by nemohla být jednoznačná. Proto Kingová dala přednost mitochondriální DNA. Pouţila úsek o 600 pb, jehoţ variabilita je tak vysoká, ţe určení příbuzenských vztahů dětí bylo nezpochybnitelné (Genetic Testing Methodologies, 2010). Analýza mitochondriální DNA se osvědčila i jako nástroj zkoumání vnitro- i mezidruhové variability, struktury plemen a populací a fylogeneze (Mirol et al., 2002). Variabilita D-loop oblasti se široce vyuţívá i při výzkumu původu a příbuzenských vztahů u koní (Ishida et al., 1994 a, b; Marklund et al., 1995; Dovc et al., 1996; Bowling et al., 2000; Kavar et al., 1999). 20

16 Charakteristika koňské mtdna Mitochondriální DNA koně domácího (Equus caballus) je tvořena zhruba pb včetně přibliţně 1200 pb dlouhé kontrolní oblasti, která obsahuje mj. různý počet opakujících se 8nt identických motivů. Díky tomu je délka kontrolních oblastí a potaţmo s tím i celých molekul mitochondriální DNA u různých zvířat různá (tab. 3). Xu a Árnason (1994) stanovili délku kontrolní oblasti u svého vzorku na 1192 pb, přičemţ v ní objevili souvislou řadu opakujícího se osminukleotidového motivu 5 -CTGCACCT-3 (Xu and Árnason 1994). Ishidova skupina provedla rozbor D- smyčky mtdna tří nepříbuzných anglických plnokrevníků a zjistila délku 1114 pb, 1115 pb a1146 pb. Repetitivní sekvence byly tvořeny různými počty tandemových repetic osminukleotidového motivu TGTGCACC, v případě prvních dvou vzorků jich bylo 18, v případě třetího vzorku 22 (Ishida et al. 1994a). V obou případech se potvrzuje Ishidovo zjištění, ţe jde o strukturu bohatou na G/C páry (Ishida et al. 1994a). Zastoupení jednotlivých bází v lehkém řetězci D-smyčky u koní udává Ishida et al. (1994a) takto: A (28,0 28,5 %); C (30,4 30,6 %); G (14,6 14,9 %); T (26,4 26,6 %). 21

17 Tab. 3: Lokalizace jednotlivých struktur v molekule mtdna koně (Equus caballus). (Xu and Árnason, 1994) Charakreristiky oblastí a od poloha b do trna - Phe S rrna trna - Val SrNA trna - Leu(UUR) NADH trna - Ile trna - Gln (L) trna - Met NADH trna - Trp trna - Ala (L) trna - Asn (L) Or.L-strand replication trna - Cys (L) trna - Tyr (L) Co I trna-ser(ucn) (L) trna - Asp Co II trna - Lys ATPasa ATPasa Co III trna - Gly NADH trna-arg NADH 4L NADH trna - His trna - Ser(AGY) trna - Leu(CUN) NADH NADH (L) trna - Glu (L) Cyt b trna - Thr trna - Pro (L) Control region (1192 pb) a Struktury zahrnují trna, rrna, geny kódující proteiny, lokus ori lehkého řetězce a kontrolní oblast. Antikodony dvou trna Leu a dvou trna Ser jsou v závorkách. b Pozice zahrnují i 5 a 3 nt kaţdé struktury. Pozice 1 je přiřazena 5 konci trna Phe. (L) značí lehký řetězec (L-strand). CO III, NADH3 a NADH4 nejsou zakončeny stop kodony. Molekula obsahuje 29 repetitivních motivů v kontrolní oblasti. Acession-No koňské mtdna je EMBL X7954 (Xu and Árnason, 1994). 22

18 Využití mtdna v genetických studiích u koní Rozsáhlá studie koňské mtdna byla iniciována sekvenční analýzou D-smyčky (Ishida et al. 1994a) a stanovením úplné sekvence mtdna (tab. 3, Xu and Árnason 1994). V současné době existují tisíce titulů zabývajících se touto problematikou, a proto v této práci budou citovány jenom některé studie nejbliţší jejímu zaměření. Marklund et al. (1995) odhalili pomocí analýzy mtdna u souboru 78 koní nepříbuzných po mateřské linii 15 různých vzorků SSCP a u 4 rodin, sledovaných po 5 generací od společné klisny zakladatelky, byla zjištěna přesná a stálá maternální dědičnost. Stálá dědičnost mitochondriálních haplotypů byla zjištěna i uvnitř rodin 49 lipických klisen, přičemţ zde nebyly pozorovány ţádné sekvence, jeţ by bylo moţno pokládat za mutace. Šestnáct rodin, reprezentovaných těmito klisnami, bylo na základě sekvenační analýzy seskupeno do 13 odlišných mitochondriálních haplotypů. Analýza SSCP u nich odhalila 3 různé skupiny vzorků SSCP (Kavar et al. 1999). Na tuto práci navázala sekvenační analýza kontrolní oblasti mtdna 212 lipicánů ze 7 hřebčínů. Bylo odhaleno 37 různých haplotypů. Ze srovnání sekvencí lipicánů se 136 sekvencemi domestikovaných a divokých koní uloţenými v GenBank vyplynulo, ţe lipické sekvence jsou přítomné ve většině haplotypových podskupin i jiných domácích koní. Zároveň bylo zjištěno, ţe většina ze 47 polymorfismů se vyskytuje na 5 konci kontrolní oblasti mtdna, zatímco na 3 konci jich bylo nalezeno jen 14. (Kavar et al. 2002). Bowling et al. (2000) pomocí srovnávací sekvenační analýzy hypervariabilní oblasti mtdna zkoumali matrilineární diverzitu 62 arabských koní chovaných v USA, kteří podle rodokmenů pocházeli z 34 originálních pouštních arabských klisen dovezených do USA v polovině 19. století. Bylo objeveno 27 haplotypů s celkovým počtem 31 substitucí v úseku o 397 pb, coţ podle odhadu činí 89 % veškerých haplotypů arabských koní registrovaných v USA. Byla téţ potvrzena spolehlivost záznamů o mateřských liniích v plemenných knihách. Studie dále demonstrovala vhodnost sekvenační analýzy mtdna pro řešení otázek sporné maternity a zpochybnila tradiční předpoklad, ţe arabští koně z téhoţ kmene nutně musí pocházet ze společné zakladatelky. 23

19 Analýzy 381 pb dlouhého úseku D-loop oblasti u 100 anglických plnokrevníků z 19 nejrozšířenějších rodin bylo pouţito k rekonstrukci populace klisen zakladatelek plemene (v období kolem let ). V rámci těchto 19 rodin bylo nalezeno 17 haplotypů. Pouţita byla metoda SSCP i přímá sekvenace. Bylo zjištěno, ţe téměř polovina samičích linií podle rodokmenů odvozovaných od některé z asi 30 historicky uznávaných zakladatelek obsahuje sekvence, které vylučují společný původ. Autoři to přičítají záměnám jednotlivých klisen v zakladatelském období (Hill et al. 2002). Luís et al. (2002) se zaměřili na srovnání kontrolních oblastí mtdna u dvou přeţívajících rodin původního španělského plemene Soraia. Nalezli dva haplotypy lišící se mezi sebou ve třech lokusech. Autoři konstatují, ţe takto extrémně nízký počet přeţívajících mateřských linií vyţaduje vytvoření plánu pro udrţovací šlechtění tohoto ohroţeného plemene. Stejný tým provedl v roce 2006 výzkum variability kontrolní oblasti mtdna iberských plemen a plemen Nového světa sekvenační analýzou, aby zjistil jejich příbuznost a aby ověřil historický původ koní Nového světa. Bylo testováno celkem 153 vzorků reprezentujících 30 iberských a amerických plemen. Bylo nalezeno 44 haplotypů sdruţených do sedmi skupin. Sníţená úroveň variability zaznamenaná u plemen Menorquina, Soraia a Sulphur Mustang je způsobena tzv. průchodem genetickým hrdlem láhve (bottleneck výrazné omezení genetické variability v důsledku velmi tvrdé selekce nebo jiného faktoru, který způsobí drastický pokles četnosti populace a díky tomu i její genetické diverzity), nebo malým počtem zakladatelů. Iberská plemena však podle všech indicií vykazují vyšší diverzitu neţ jihoamerická a severoamerická plemena. Ačkoliv se ukázalo, ţe iberská i novosvětská plemena jsou polyfyletického původu, práce poskytuje soubor genetických dat ukazující na zvýšený výskyt iberských haplotypů u plemen Nového světa, coţ koresponduje s historickými fakty (Luís et al. 2006). Cothran et al. (2005) sledovali genetickou variabilitu 421 bp dlouhého úseku kontrolní oblasti mtdna u silně ohroţeného původního litevského plemene Zemaitukai (Ţemaiču, pozn. aut.). V práci se zaměřili na posouzení validity rodokmenů, zjištění diverzity mtdna a zjištění příbuzenských vztahů k jiným plemenům. Ze závěrů vyplývá, ţe všech pět zbývajících rodin plemene má vzájemně odlišné haplotypy. Nebyla prokázána příbuznost plemene s jinými plemeny koní. Genetická variabilita 24

20 mtdna uvnitř plemene je vzhledem k jeho malému počtu překvapivě vysoká. Výsledků studie bude vyuţito při ochraně plemene Souběžné využití analýzy mikrosatelitní a mitochondriální DNA v genetických studiích u koní V některých studiích se objevují souběţně analýzy jak mikrosatelitní, tak mitochondriální DNA. Zatímco variability mikrosatelitů se vyuţívá ke stanovení genetické diverzity (zjištěná heterozygotnost, genová diverzita, průměrný počet alel na lokus, genetická rozdílnost), polymorfismus mtdna umoţňuje ověřovat příslušnost zvířat k daným rodinám, stanovovat genetické distance a odhadovat variabilitu mtd- NA zakladatelek rodin (Dovc et al. 2006). Kakoi et al. (2007) soudí, ţe porovnáním velkého počtu mitochondriálních haplotypů koní z celosvětových podkladů lze vytvořit haplotypové skupiny, coţ se můţe stát významným nástrojem pro správné přiřazování mateřských linií (rodin) k fylogenetickým skupinám koní, a tím pádem i pro objasnění geografického původu a charakterizaci rodin původních japonských koní. Co se mikrosatelitů týče, vysoká polymorfie příznačná pro tyto markery je činí velmi vhodnými pro výzkum genetické variability, struktury a příbuzenských vztahů u plemen koní v celosvětovém měřítku (Kakoi et al. 2007). 25

21 3. HYPOTÉZA 1. Variabilita mikrosatelitní DNA je vhodné kritérium pro zařazování kladrubských koní do subplemenných skupin (linií, rodin) 2. Variabilita mitochondriální DNA je vhodným kritériem pro zařazování kladrubských koní do rodin 4. CÍLE PRÁCE Ověření pracovní hypotézy, resp. nalezení vhodného kritéria pro zařazování zvířat do linií či rodin Ověření správnosti zařazení koní do rodin provedené dle existující dokumentace Určení míry příbuznosti mezi jednotlivými rodinami i zvířaty Získané údaje budou vyuţity ke zmapování matrilineární a patrilineární genetické rozmanitosti u kladrubských koní a k ověření správnosti jejich zařazení do rodin. Těchto informací pak bude moţno vyuţít pro sestavování vhodných, geneticky co nejméně příbuzných rodičovských párů. Dalším přínosem této práce pak bude moţnost pouţití jejich výsledků k ověřování totoţnosti a původu jednotlivých koní i k výzkumu původu a k rekonstrukci výstavby plemene jako takového zejména v těch obdobích, z nichţ chybějí chovatelské záznamy. 26

22 5. MATERIÁL A METODIKA 5.1. Zvířata Modelovou populací je stádo starokladrubských koní, běloušů i vraníků (obr. 6) v majetku Národního hřebčína Kladruby nad Labem a v malé míře i z dalších chovů. Obr. 6: Kladrubský vraník a bělouš v klusu Copyright 2003 NH Kladruby nad Labem. Všechna práva vyhrazena. 27

23 Původ a historie chovu starokladrubského koně Starokladrubský kůň je nejstarším kontinuálně chovaným a zároveň jediným autochtonním plemenem koní na území České republiky. Je světovým unikátem jak pro svůj původ, tak i jako ukázka úspěšné chovatelské práce, díky níţ se podařilo jednak udrţet bílé stádo přes jeho malou četnost bez známek inbrední deprese, a jednak zregenerovat vrané stádo z pouhých několika jedinců, kteří unikli likvidaci.rozsáhlý komplex Národního hřebčína Kladruby nad Labem byl i se starokladrubským koněm - běloušem v lednu 1995 prohlášen státní kulturní památkou. (Nár. hřebčín IV-2010, Jakubec et al. 2004). Krevní základna plemene se začala tvořit jiţ před čtyřmi staletími, kdy byl císařem Rudolfem II. Habsburským roku1579 zaloţen dvorní hřebčín v Kladrubech nad Labem a kdy se do něj začali dováţet koně starošpanělští a později staroitalští (Nár. hřebčín IV-2010). O samostatném stabilizovaném plemeni lze hovořit od přelomu 18. a 19. století (Jakubec et al., 2004). Od samého počátku to bylo plemeno málopočetné a zuţování jeho krevní základny se bránilo dalším přílivem italsko-španělské krve. Ten však ustal počátkem 19. století v důsledku zániku většiny starošpanělských a staroitalských chovů v Evropě a od té doby bylo kladrubské stádo chováno více méně čistokrevně. Poněvadţ pak jiţ nikde jinde koně italsko-španělského původu nebylo moţno získat, stal se název "kůň starokladrubský" novým názvem jejich plemene, pod kterým se uvádělo v příručkách hipologických i zootechnických (Nár. hřebčín IV-2010). Během 2. poloviny 19. století a v průběhu 20. stol. bylo v rámci snah o zlepšení exteriéru a uţitkových vlastností plemene a o rozšíření jeho krevní základny pouţito několika hřebců i klisen jiných plemen, ne všechny tyto akce se však setkaly s úspěchem, viz tab. 4 (Bílek 1957, Nár. hřebčín XII-2007). 28

24 Tab. 4: Přehled koní jiného než kladrubského plemene použitých v chovu v průběhu 19. a 20. stol. * Kůň pohl. Plemeno Nar. Původ Období využití Potomci zařazení Linie/rodina založ. koněm do chovu Angl.plno- 2.pol. 19. stol. a polokrevníci A1/1 a A1/2 - poč. 20.stol. 0 Shagya X Nonius XXXV arabský Radovec po I. sv. v. dcery polokrevník anglonorman 1950 Jugoslávie vnučky Favory lipicán 1938 Bábolna Rudolfo lusitano 1968 Portugalsko Siglavi Pakra lipicán 1946 Jugoslávie Bárta orlov.klusák 1953 Legion orlov.klusák 1950 Chrenovský 1958-? hřebčín 5 synů 9 dcer FAVORY (běl) L 1 syn 11 dcer RUDOLFO (běl)l 2 synové SIGL.PAKRA (vr.) 2 dcery lllllllllll L 1 syn 1 dcera BÁRTA R Algasovský hřebčín dcery 2 syno- Romke fríský kůň 1966 Holandsko vé ROMKE (vr) L 22 dcer Mikrob orlov.klusák 1972 Chrenovský hřebčín dcera * nejsou uvedeny klisny 1. generace pouţité při regeneraci kladrubského vraníka (pozn. aut.) L - linie, R - rodina Poslední dvě století se starokladrubský kůň chová ve dvou barevných variantách vraník a bělouš (obr. 6), ačkoliv do třicátých let 19. století zde bylo také stádo starokladrubských hnědáků. To však bylo znehodnoceno pokříţením holandskými hřebci a proto bylo odstraněno. Vrané stádo bylo v meziválečném období téměř zlikvidováno a jen díky úsilí profesora VŠZ v Praze Františka Bílka, DrSc. se na poslední chvíli podařilo zachránit několik posledních zvířat a v r přistoupit pod jeho vedením k regeneraci starokladrubského vraníka (Nár. hřebčín XII-2007, Volenec 1995). V roce 1992 konstatuje pokračovatel prof. Bílka Doc. Ing. Jaromír Dušek, 29

25 DrSc., ţe regenerační proces je zdárně završen a starokladrubský vraník je zachráněn (Dušek 1992). Původ starokladrubského koně po otcovské linii je moţno vysledovat zpět k zakladatelům kmenů (nověji linií) kteří jim dali jména (Generale, Generalissimus, Sacramoso, Solo, Favory, Siglavi Pakra, Romke, Rudolfo). Přehled zakladatelů kmenů celého plemene je uveden v tab. 5 (Nár. hřebčín IV-2010). Tab. 5: Kmeny starokladrubských hřebců (dle nového ŘPK 2005) Linie č. Zakladatel název linie Barva zakl. Barva linie Nar. zakl. Plemeno Původ L1 Generale Běl Běl 1787 Starokladr. Kopčany Gss XXIII L11 Generalissimus Běl Běl 1938 Starokladr. Kladruby n/l L13 Generalissimus Běl Běl 1797 Starokladr. Syn hřebce Generale kmen zanikl r L31 Solo Vr Vr 1927 Starokladr. Syn Sacramosa XXIX 1779 Starokladr. Kladruby n/l Lipica L2 Favory Plav. Běl 1938 Lipicán Bábolna Kl. n/l L21 Gss XXIX Generale- L3 Sacramoso Vr Vr/běl 1800 Starokladr. Kroměříţ Italskošpanělské kmen zanikl r. Řím L12 Napoleone Vr Vr Favory- Generalissimus Běl Běl 1965 Starokladr. Kladruby n/l L4 Siglavi Pakra Vr Vr 1946 Lipicán Dakovo (Chorvatsko) L5 Romke Vr Vr 1966 Fríský kůň Holandsko L6 Rudolfo Běl Běl 1968 Lusitano Portugalsko Kmen Napoleone zanikl v r Původní kmen Generalissimus (zkr. Gss) zaloţený hřebcem Generalissimus I narozeným r. 1797, zanikl v r úhynem hřebce Generalissimus XXII. Znovu byl obnoven alespoň podle jména v r jako kmen 30

26 Generale-Generalissimus hřebcem Generalissimus XXIII (nar. r po otci Generale XXIII z matky 407 Gss XXII). V r vznikl podobně kmen Favory- Generalissimus, jehoţ zakladatelem se stal hřebec Generalissimus XXIX nar. r po otci Favory IV z matky 817 Gss XXIII (Nár. hřebčín IV-2010). Kmen Favory byl zaloţen plavým hřebcem Favory narozeným r v Kladrubech nad Labem a převedeným do hřebčína Lipica, kde zaloţil stejnojmenný kmen lipicánů. V kladrubském chovu se neuplatnil. V r byl však za účelem rozšíření krevní základny do kladrubského chovu zařazen jeho potomek lipický hřebec 92 Favory narozený r v hřebčíně Bábolna, který tak zaloţil kmen Favory starokladrubských běloušů (Bílek 1957, Nár. hřebčín IV-2010). Po mateřské linii je původ starokladrubského koně moţno vysledovat zpět k 8 zakladatelkám čistokrevných klasických rodin a 7 zakladatelkám čistokrevných neklasických rodin, jejichţ přehled (dle nového Řádu plemenné knihy starokladrubského koně schváleného 2005) je uveden v tabulkách 6a a 6b (Nár. hřebčín IV-2010). Tab. 6a: Čistokrevné klasické rodiny (vyznačeny tučně): rodina č. rodina název rodina č. rodina název (rok naroz. zakladatelky) (rok naroz. zakladatelky) R18 -Maestosa (1740) R13a Deflorata-Plutona (1767 R20 Almerina (1769) R26Z Madar VI-Káča (1782) R21 Almerina-Albona R10 Ragusa (1888) R23 Almeria-Aluta R101 Ragusa-Raguza R8 Almerina-Campanella R17 Rava-Maga (1755) R22 Almerina-Egloga R25Z Rava-Ravana R12 Almerina-Formosa R9 Sardinia-Magura (1770) R11 Almerina-Maja R13 Sardinia-Neapolitana R19 Cariera (1894) R16 Sardinia-Septimia 31

27 Tab. 6b: Čistokrevné neklasické rodiny: rodina č. rodina název (rok naroz. zakladatelky) rodina č. rodina název (rok naroz. zakladatelky) R7 Narcis (1939) R27Z Favora (1963) R15 Xandra (1938) R28Z Dana (1969) R14 Bárta (1953) R29Z Gita (1974) R24Z Ritorna(1974) V současné době Plemenná kniha starokladrubského koně dle aktualizace provedené k eviduje 536 chovných starokladrubských koní (tab. 7). Koní nezařazených do chovu vč. koní bez původu je přibliţně 3200 (Nár. hřebčín IV- 2010). Tab. 7: Počty chovných starokladrubských koní k BĚLOUŠI VRANÍCI hř. kl. hř. kl. Celkem Nár. hřebčín Soukr. chovy Celkem Po celou dobu existence plemene se vzhledem k jeho omezené četnosti uplatňuje příbuzenská plemenitba, coţ na jedné straně vedlo k zachování jeho původního charakteru, na straně druhé to však sebou nese zvýšené riziko inbrední deprese se všemi jejími negativními dopady zejména na konstituci, ţivotaschopnost a reprodukční schopnosti. Aby se zjistilo, nakolik je plemeno ohroţeno inbrední depresí, byly mezi lety provedeny genetické analýzy plemene (Jakubec et al., 2004). Volenec et al. (1995) provedl studii stupně inbreedingu. Průměrný koeficient inbreedingu starokladrubských hřebců byl 7,2 %, přičemţ u běloušů činil 6,1 % a u vraníků 8,2 %. Průměrný koeficient inbreedingu dcer těchto plemeníků činil 7,75 % za celé plemeno, u dcer běloušů 7,29 % a u dcer vraníků 8,4 %. Průměrný koeficient inbreedingu pro klisny z hlediska jejich příslušnosti k mateřským liniím byl 7,53 % pro bělky a 7,91 % pro vranky (7,75 % pro celé plemeno). Vyšší hodnoty u černé 32

28 variety korespondují s intenzivnějším inbreedingem pouţívaným při regeneračním procesu starokladrubského vraníka. V další práci (Jakubec et al. 1996) byly odhadnuty koeficienty inbreedingu pro všechny jedince a koeficienty příbuznosti pro všechny páry jedinců. Inbreeding a příbuznost byly sledovány zpětně aţ po 8. generaci předků. Všichni jedinci byli testováni pomocí 6 systémů krevních skupin a 10 systémů biochemického polymorfismu. Byly odhadnuty průměrné koeficienty inbreedingu otcovských skupin potomků, otcovských linií, obou barevných variant a celého plemene. Současně byly pro stejné genetické skupiny odhadnuty průměrná heterozygotnost a genetická distance. Pro celé plemeno byly odhadnuty tyto parametry: průměrný koeficient inbreedingu 6,72 %, průměrná heterozygotnost 36,65 %, průměrný koeficient příbuznosti 4,92 % a průměrná genetická distance 8,41. Z těchto hodnot vyplývá, ţe míra inbreedingu v plemeni není příliš vysoká. Hořín et al. (1998) provedli analýzu polymorfismu MHC (major histocompatibility complex oblast kódující několik skupin genů, které hrají zásadní roli při antigenové odpovědi a stejně tak i v některých neimunitních funkcích), polymorfismu krevních skupin, biochemického polymorfismu a polymorfismu mikrosatelitní DNA. Vyplynulo z ní, ţe genetický polymorfismus kladrubských koní nevykazuje redukci a je srovnatelný s genetickým polymorfismem jiných plemen koní. Práce Jakubce et al. (2004) se zaměřila na porovnání koeficientu inbreedingu v letech 1993 a 2003, a to u hřebců a klisen v rámci celého plemene, bílé a černé varianty a hřebčích linií uvnitř variant. Z práce vyplývá, ţe v sledovaném období poklesl průměrný koeficient inbreedingu všech hřebců plemene ze 7,16 % na 5,47 %, z toho běloušů z 6,06 % na 5,10 % a vraníků z 8,21 % na 5,94 %. U klisen poklesl ze 7,90 % na 5,05 % v rámci celého plemene, z toho u bělek ze 7,29 % na 4,17 % a u vranek z 8,40 % na 5,86 %. Dále byla posuzována plodnost klisen Národního hřebčína Kladruby nad Labem i soukromých chovů v letech 1995 aţ Plodnost kolísala kolem 65 % a nejevila známky poklesu. 33

29 Rodiny starokladrubského Nejstarší rodinou je rodina lipického původu AFRICA MAESTOSA E, zaloţená r Dle Bílka (1957) a Lercheho (1956) ovšem zakladatelka rodiny Africa pocházela Kladrub. Do kladrubského stáda se krev této rodiny dostala prostřednictvím vrané klisny 8 Maestosa, nar v Topolčiankách po Maestoso I. Její matkou byla 266 Neapolitano Gratia-4, po Neapolitano Gratia z 80 Napoleone, po Napoleone Amelia III. 8 Maestosa měla 25 % starokladrubské krve a 75 % lipické krve a byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. Druhou v pořadí co do stáří je rodina ALMERINA, téţ starokladrubského původu, jejíţ zakladatelkou je klisna Almerina narozená r (Bílek 1957). Tato rodina se dělí na 6 podrodin (tab. 6a, příloha č. I). Almerina Albona - v elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) je nejstarší představitelkou a zároveň společným předkem z mateřské strany všech příslušníků této rodiny klisna 334 Shagya (29 Idea) nar Její bábou byla 89 Gss Albona (nar. r. 1903), která je potomkem generace F11 klisny Almerina. Bábou 89 Gss Albony byla Albona nar. r (F9. generace od klisny Almerina) po Gss (nar. 1867), z Alba VIII (F8, nar. 1861) po G. Arioste (1850). Alba VIII je přímým potomkem klisny Albania I (nar. 1803) po Generale I (nar. 1796) z kopčanské klisny Ameny (nar. 1790). Albania I je starší ze dvou pravnuček Almeriny (Bílek 1957). Almerina-Aluta P v elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) je nejstarší představitelkou a zároveň společným předkem z mateřské strany všech příslušníků této rodiny klisna 276 Shagya I (nar. 1922), F12 gen. po klisně Almerina. Její bába Aluta nar po G 1887 (F10), dcera klisny Algebra (F9) nar po Gss 1867, z Alba VIII, tj. pochází v přímé linii téţ z klisny Albania I narozené r (Bílek 1957). Almerina-Campanella zakladatelkou je klisna 43 Campanella, černá hnědka nar v Kladrubech n/l po hřebci Sacramoso XXX (nar. 1927). Její matkou byla 34

30 klisna 438 Shagya I z 265 Generale XXX (nar. 1921) po Shagya I Radovecký. Patřila tedy ve skutečnosti do rodiny Almerina Aluta P, takţe rodina Almerina- Campanella je v podstatě formální. 43 Campanella měla 62,5 % stkl., 25 % arabské a 12,5 % lipické krve. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. (Nár. hřebčín IV-2010, Bílek 1957). Almerina-Egloga zakladatelkou je 116 Generale XXIX (Egloga) generace F13 nar v Kladrubech n/l po Generale Isalka z Eglantine (1896) po Gss Rava (1889). Prabábou Eglantine je klisna Alba XI (1870) po Gss Forbice (1897) z Alba VIII, tj. i tato rodina se odvozuje od Albanie I. Almerina-Formosa zakladatelkou je klisna 35 Formosa (475 Furioso VII), nar ve Slatiňanech po Furioso VII; z 265 Generale XXX, která patřila do rodiny Almerina Aluta P. 35 Formosa byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. Měla 43.75% stkl. krve a 56.25% krve angl. polokrevníka. Almerina Maja zakladatelkou je vraná klisna 1 Maja, (F13) nar (dle elektronické Plemenné knihy NHK v Kladrubech n/l, dle dokumentu Regenerační proces v chovu starokladrubského vraníka v Nových Dvorech u Opavy, viz Nár. hřebčín IV-2010) po Maestoso Radovecký (nar. 1911); z 301 Napoleone (nar ). Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. Měla 50% stkl. krve a 50% lipic. krve. Maja je přímým potomkem klisny Abocca (nar. 1800) po Principe z kopčanské klisny Ameny (nar. 1790). Abocca je starší ze dvou pravnuček Almeriny. BÁRTA zakladatelkou je vraná klisna orlovského klusáka 154 Bárta, nar v Chrenovském hřebčíně (SSSR), po hřebci Bars. Její matkou byla klisna Utrata, po 5878 Suchovoj z Ulybka, po 2300 Balans. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. CARIERA - zaloţená r V elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) je nejstarší představitelkou a zároveň společným předkem z mateřské strany všech příslušníků této rodiny klisna 119 Generalissimus XIX (Carpeta), narozená

31 DANA "G" (1969) zakladatelkou je Č 3934 Dana nar po Favory IV K ze zemské klisny po Sacramoso XXXIII. Šedá bělka. DEFLORATA-PLUTONA zakladatelkou je 60 Plutona, lipická klisna nar v Topoľčiankách, po Pluto I. Její matkou byla klisna 451 Maestoso I, po Maestoso I z 234 Neapolitano Gratia, po Neapolitano Gratia. Hnědě tečkovaná bělka. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. FAVORA zakladatelkou je klisna Č 3912 Favora nar. r po Favory VI K ze zemské klisny po Generale XXXVI. Šedá bělka. MADAR VI-KÁČA "F" (1782) zakladatelkou je lipická klisna Č 1056 Káča nar v maďarském hřebčíně Bábolna, po hřebci Incitato X. Její matkou byla 117 Conversano XX po Favory XX Bábolenský z 566 Pluto XXIII. Šedá bělka. NARCIS I zakladatelkou je 15 Narcis, nar v Chrástu u Chrudimi, po 530 Sacr. XXIX-3 Avara. Její matkou byla zemská klisna Líza po Sacramoso Aja XXVII ze zem. klisny č. 23, po 145 Lord Willibald. Vranka s odznaky, s podílem 75% stkl. krve a 25% krve č. teplokrevníka. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. RAGUSA zaloţená r V elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) je nejstarší představitelkou a zároveň společným předkem z mateřské strany všech příslušníků této rodiny klisna 85 Napoleone (Ragusa), po Napoleone Generale III. RAGUSA-RAGUZA zakladatelkou je 32 Raguza (z rodiny Ragusa), nar v Kladrubech n/l.,po Generale XXXIII z 416 Shagya I, po Shagya I z 85 Napoleone (Ragusa), po Napoleone Generale III. Smíš. bělka s podílem 75 % starokladrubské a 25 % arabské krve. Do chovu byla zařazena v Kladrubech n/l. pod č. 531 Generale XXXIII, v r byla předána do hřebčína Slatiňany, kde nadále působila v chovu jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. RAVA-MAGA (1755) - zakladatelkou je lipická klisna 7 Maga, nar v Topoľčiankách, po Maestoso I. Její matkou byla klisna 101 Pluto XVII, po 4 Pluto XVII 36

32 z 30 Rigoletta, po Conversano Austria. Šedě tečkovaná bělka. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. RAVA-RAVANA (1755) - nejstarší představitelkou a zároveň společným předkem z mateřské strany všech příslušníků této rodiny uvedeným elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) je lipická klisna 615 Rava, bělka, nar v Topolčiankách po Maestoso I. Pravnučkou této klisny byla bělka 275 Ravana nar v Topolčiankách po Neapolitano VII Perletta- Piberský. 275 Ravana měla dceru. Č 1128 Ravana, červeně tečkovanou bělku po Maestoso IX-7, narozenou v Topolčiankách, která se stala zakladatelkou této rodiny. RITORNA (1974) zakladatelkou je klisna 292 Ritorna, vranka, nar v hřebčíně Slatiňany, po Solo Narcis IV z české teplokrevné klisny 254 Rita, nar , která je nejstarším v elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) zaznamenaným předkem této rodiny. Byla pouţita v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. SARDINIA-MAGURA zakladatelkou je 3 Magura, nar v Topolčiankách, po Maestoso I. Její matkou byla klisna 274 Sacramoso XXIX-1, po Sacramoso XXIX z 31 Virtuosa, po Pluto Slatina III, vranka s podílem 25 % starokladrubské a 75 % lipické krve. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. SARDINIA-NEAPOLITANA zakladatelkou je lipická klisna 9 Neapolitana, nar v Topolčiankách, po Neapolitano Gratia I. Její matkou byla klisna 16 Malaga, po Pluto Slatina III z Malaga, po Maestoso Slavina II. Tmavá hnědka. Do chovu byla zařazena v r. 1942, kdy byla zakoupena spolu se svou dcerou 44 Capriolina, nar (po Sigl. Capriola I). Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. Její dcera 44 Capriolina byla později téţ zařazena do chovu. SARDINIA-SEPTIMIA zakladatelkou je 121 Septimia, nar v Zahrádkách u České Lípy, po 411 Generale XXXIII-1. Její matkou byla klisna Spaniola po Pluto Presciana ze Sardina, po Maestoso Gratia. Byla to šedá bělka s podílem % sta- 37

33 rokladrubské, 50 % lipické a % arabské krve. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. XANDRA zakladatelkou je černě tečkovaná bělka 67 Xandra, nar. 1938, slezská zemská klisna s oţehem, bez původu (v teplokrevném typu). Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. (in: Plemenná kniha NHK v Kladrubech n/l a dokument Regenerační proces v chovu starokladrubského vraníka; Nár. hřebčín IV-2010) 38

34 5.2. Metodika Mikrosatelity Cílem analýzy mikrosatelitů bylo zjistit, zda jsou vhodným kritériem pro zařazování kladrubských koní do linií a rodin a případně stanovit mezi nimi příbuznost. Genotypováno bylo 16 mikrosatelitních lokusů (tab. 8) rozptýlených na 10 chromozómech. Laboratorní analýza mikrosatelitů byla provedena ve Výzkumném ústavu ţivočišné výroby v Praze Uhříněvsi. Vycházela z metod pouţívaných ve Výzkumném ústavu, modifikovaných pro koňskou DNA (Jandurová et al. 2004, Jandurová et al. 2005). Krevní vzorky byly náhodně odebrány 324 starokladrubským koním v rozmezí 10 let (1990 aţ 2000), vţdy cca u 10 % jedinců z kaţdé linie. DNA byla izolována z celé krve pomocí kitu NucleoSpin Blood Kit (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA). K amplifikaci byla pouţita mnohonásobná PCR (multiplex PCR). Reakční směs o objemu 7,5 μl obsahovala ng templátové DNA, 1,25 μl reakčního pufru (10x Stockmarks Buffer), 2 μl směsi dntp (1.25 mmol/l), 2 μl směsi primerů Primer mix (20 nmol/l) a 1,25 U Taq Gold polymerázy. Všechny tyto komponenty pocházejí z kitu StockMarks for Horses Equine Genotyping Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Reakce byla provedena v termocykléru TGradient 96 thermal cycler (Whatman Biometra, Goettingen, Germany). Počáteční denaturace při 95 C trvala 10 min., pak následovalo 31 cyklů: 30 s 95 C, 30 s 60 C a 60 s. 72 C. Při posledním cyklu byla reakční směs vystavena teplotě 72 C po dobu 60 min. Produkty PCR byly rozpuštěny v 7,5 μl vody. Analýza PCR produktů a výpočet délky alel byl proveden pomocí sekvenátoru ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) a analytického software GeneScan. 39

35 Tab. 8: Specifické lokusy koní Lokus Barvivo Barva očekávaná velikost (pb) AHT4 6-FAM Blue AHT5 VIC Green ASB17 PET Red ASB2 VIC Green ASB23 VIC Green CA425 PET Red HMS1 PET Red HMS2 NED Yellow HMS3 NED Yellow HMS6 VIC Green HMS7 6-FAM Blue HTG4 6-FAM Blue HTG6 VIC Green HTG7 NED Yellow LEX3 PET Red VHL20 6-FAM TM Blue

36 mtdna Cílem analýzy mtdna bylo zjistit, zda je vhodným kritériem pro zařazování kladrubských koní do rodin, ověřit zařazení do rodin podle rodokmenů a případně zjistit příbuzenské vztahy mezi rodinami Laboratorní analýza mtdna se téţ prováděla ve Výzkumném ústavu ţivočišné výroby. Zkoumaný soubor tvořilo170 zvířat z 23 rodin, z nichţ 166 je genovými rezervami. Pracovní postup při analýze mtdna je následující: 1. izolace mtdna 2. amplifikace příslušného úseku mtdna 3. zjištění polymorfismů příslušného úseku mtdna 4. statisticko-matematické zpracování získaných údajů, interpretace výsledků Izolace mtdna Izolaci mtdna lze provádět z celé (tj. nefrakcionované) čerstvé či mraţené krve, tkání, slin, případně z vlasových folikulů. Tkáně se jako zdroj DNA pouţívaly zejména ve starších pracích (játra a srdce Hutchison et al. 1974, ledviny - Árnason et al. 1991, Xu et al. 1996, játra -Ishida et al. 1994a, ledviny - Xu and Árnason 1994). Skupina soustředěná kolem prof. Dovče pouţívá standardní postup dle Whitea and Densmorea (White and Densmore 1992, Kavar et al. 1999, Kavar et al. 2002, Ivankovic et al. 2002,). V této práci byla zdrojem mtdna celá zmrazená krev genových rezerv uchovávaná v genetické bance, vedené ve Výzkumném ústavu ţivočišné výroby (166 vzorků), a sliny získané výtěrem dutiny tlamní vatovými tampony (4 vz., koně v majetku hřebčín Favory s. r. o., Benice). Izolace a purifikace se prováděla jednak na přístroji Applied Biosystem AbiPrism 6100 Nucleic Acid PrepStation(vakuum) dle protokolu (160 vz.), jednak pomocí techniky magnetických partikulí (Magnetic Par- 41

37 ticle Technology) dle protokolu (10 vz., z toho 4 vz. slin a 6 vz. krve). za pouţití kitu MagMAX -96 DNA Multi-Sample Kit (Applied Biosystems). Izolace DNA pomocí Applied Biosystem AbiPrism 6100 Nucleic Acid Prep- Station(vakuum) Izolace DNA se skládá ze dvou kroků z lyzace a z vlastní izolace. Lyzační reakce se provádí v mikrozkumavkách o objemu 1,5 ml, do nichţ se nejprve napipetuje 25 μl proteinázy K (Proteinase K Solution, 20 mg/ml), dále 85 μl pufru BloodPrep DNAPK Digestion Buffer a 75 μl rozmraţené krve. Směs se promíchá a inkubuje 20 minut při teplotě 58 ºC; během lyzace se vzorky silně vortexují. Poté se směs nechá zchladnout na laboratorní teplotu. Pak se k ní přidá 650 μl roztoku BloodPrep DNA Purification Solution, zahřátým na 37 ºC, a směs se opatrně promíchá pipetou (5x nasát celý objem do pipety a vypustit). Vlastní izolace: Vzorky lyzované krve se napipetují do kolonek přístroje 6100 Nucleic Acid PrepStation (650 μl). Po odsátí roztoku následují tyto kroky: μl Purification Solution ke kaţdému vzorku odsátí pomocí vakua μl Wash Solution odsátí μl Wash Solution odsátí. 4. Předvymývací vakuum, ţádný roztok. 5. Na dno jamek přidat eluční destičku μl Elution Solution 1 inkubace 3 min., odsátí. DNA se zachytí na eluční destičce μl Elution Solution 2 (úprava ph vyizolované DNA pufrem). Pufr se pomocí vakua odsaje do destičky s DNA Amplifikace mtdna 42

38 Izolace DNA pomocí techniky magnetických partikulí (Magnetic Particle Technology) A) Z krve: Lyzace: 1. Předehřát vyhřívací blok na ºC 2. Připravit PK buffer/enzyme Mix 3. Do kaţdé mikrozkumavky napipetovat 50 μl PK buffer/enzyme Mix a 50 μl celé krve, promíchat nasátím do pipety 5 7 x nebo opatrným vortexováním. 4. Utěsnit, inkubovat 20 min při ºC 5. Přidat 200 μl Multi-Sample DNA Lysis Buffer ke kaţdému vzorku, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 7 Extrakce: 1. Ke kaţdému vzorku přidat 20 μl směsi DNA vázajících magnetických partikulí, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 6 2. Ke kaţdému vzorku přidat 240 μl 100 % isopropanolu, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 3 aţ 4 3. Umístit na magnetický stojan na 5 min 4. Odstranit supernatant ze vzorků, dokud jsou na magnetickém stojanu 5. Promýt kaţdý vzorek 150 μl promývacího roztoku 1 (Wash Solution 1): a) Do kaţdého vz. přidat 150 μl promývacího roztoku 1, utěsnit, protřepávat 1 min při rychlosti 7 b) Umístit na magnetický stojan na 1 min c) Odstranit supernatant ještě na stojanu 6. Opakovat krok 5 dvakrát za pouţití 150 μl promývacího roztoku 2 (Wash Solution 2) 7. Protřepávat odkryté vzorky 2 min při rychlosti 9 Eluce: 1. Ke kaţdému vz. přidat 50 μl DNA vymývacího pufru 1 (DNA Elution Buffer 1) 2. Inkubovat při 70 ºC po dobu 5 min 3. Ke kaţdému vz. přidat 50 μl DNA vymývacího pufru 2 (DNA Elution Buffer 2), promíchat 10 krát nasátím do pipety, utěsnit a protřepávat 5 min rychlostí 7 4. Umístit na 5 min na magnetický stojan 43

39 5. Přenést eluáty ze vzorků na magnetickém stojanu na eluční destičku, utěsnit. Purifikované vzorky, které nebyly ihned pouţity k dalšímu zpracování, byly ponechány na eluční destičce. Do 24 hod byly uchovávány při 2 4 ºC, v případně uskladnění po delší dobu pak při teplotě alespoň. -20 ºC. B) Ze slin: Postup se v detailech lišil. Vlastní extrakci předcházelo rozrušení vzorků: 1. Napipetovat do kaţdé zkumavky 400 μl lyzačního pufru (Multi-Sample DNA Lysis Buffer) 2. Tampóny bez špejlí dát do zkumavek s lyzačním pufrem 3. Protřepávat odkryté zkumavky 3 min při rychlosti 7 4. Odstranit tampóny tak, aby ve zkumavkách zůstalo co moţná nejvíce pufru (cca 200 μl) 5. Přidat 160 μl 100 % isopropanolu ke kaţdému vzorku, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 7 Extrakce: 1. Ke kaţdému vzorku přidat 20 μl směsi DNA vázajících magnetických partikulí, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 7 2. Umístit na 5 min na magnetický stojan 3. Vymýt magnetické partikule: a) Odstranit ze vzorků supernatant, dokud jsou na magnetickém stojanu b) Do kaţdého vz. přidat 150 μl promývacího roztoku 1 (Wash Solution 1), utěsnit, protřepávat 1 min při rychlosti 7 c) Umístit na magnetický stojan na 1 min 4. Zopakovat krok 3 za pouţití 150 μl promývacího roztoku 2 (Wash Solution 2) 5. Vzorky odkrýt a odstranit z nich supernatant, dokud jsou na magnetickém stojanu. Odkryté protřepávat 2 min při rychlosti 9 6. Zatímco vzorky schnou, připravit RNase A mix 7. Přidat 100 μl RNase A mix do kaţdého vzorku, utěsnit, protřepávat 2 min při rychlosti 7 44

40 8. Přidat 100 μl pufru Multi-Sample DNA Lysis Buffer a 120 μl 100 % isopropanolu ke kaţdému vzorku, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 7 9. Umístit na 1 min na magnetický stojan 10. Třikrát zopakovat krok 3; pouţít 150 μl promývacího roztoku 2 (Wash Solution 2) 11. Vzorky odkrýt a odstranit supernatant, dokud jsou na magnetickém stojanu 12. Vzorky sušit odkryté protřepávat 2 min rychlostí 9 Eluce: 1. Ke kaţdému vz. přidat 50 μl DNA vymývacího pufru 1 (DNA Elution Buffer 1) 2. Inkubovat při 70 ºC po dobu 5 min 3. Ke kaţdému vz. přidat 50 μl DNA vymývacího pufru 2 (DNA Elution Buffer 2), utěsnit a protřepávat 2 min rychlostí 7 4. Umístit na 3 min na magnetický stojan 5. Přenést eluáty ze vzorků, zatímco jsou na magnetickém stojanu, na eluční destičku, utěsnit. Pro uchování vzorků platí totéţ, co pro vzorky získané z celé krve Amplifikace mtdna K amplifikaci se pouţívá buď celá oblast D smyčky, nebo její upstream oblast, případně upstream i downstream oblast pomocí specifických primerů. Pouţívají se primery navrţené na základě genů trna Thr a trna Phe v evolučně konzervativní oblasti mtdna, které jsou společné pro mnohé ţivočišné druhy (Anderson et al. 1981, Anderson et al. 1982, Bibb et al. 1981; in: Ishida et al. 1994a). V této práci byla amplifikována upstream část kontrolní oblasti D smyčky o 384 pb (nt nt 15834) pomocí primerů pouţitých např. v práci T. Kavar et al. (2002): HDF: 5 -AGTCTCACCATCAACACCCAAAGC-3 HF: 5 -CCTGAAGTAGGAACCAGATG- 3 45

41 Reakční směs o objemu 20 μl obsahovala 3 μl templátové DNA o koncentraci 10 pmol/μl, 0,5 μl kaţdého primeru, 6 μl vody a 10 μl dvakrát koncentrovaného roztoku PPP Master Mix, který představuje vyváţenou směs jednotlivých komponentů (polymeráza, nukleotidy, pufr, MgCl2 aj.). Amplifikace se prováděla v termocykléru Biometra T Gradient v těchto krocích: I) 1. cyklus: 95 C 5 min. denaturace II) 95 C 10 s denaturace 62 C 20 s anelace 72 C 30 s elongace? x III) 72 C 5 min. elongace.4 C chlazení Přítomnost DNA v jednotlivých vzorcích se zjišťovala pomocí gelové elektroforézy na 3% agarosovém gelu. Vzorky obsahující amplifikovaný úsek DNA v dostatečném mnoţství pak byly purifikovány pomocí sady Min-Elute dle protokolu (na 5 μl PCR produktu 1,67 μl SAP (c = 1 U/μl) a 0,33 μl exonukleázy EXO I (c = 20 U/μl), obojí od firmy FERMENTAS. Následovala inkubace 60 min. při 37 C a denaturace enzymů při 75 C 15 min. 46

42 Zjištění polymorfismu mtdna Byla pouţita metoda přímé sekvenace, tak jako v jiných podobných pracích (Cothran et al. 2005, Kakoi et al. 2007, Kavar et al. 2002, Luís et al. 2002, Luís et al. 2006, Royo et al a další), v sekvenátoru Applied Biosystems (Hitachi) 3100-A. Pouţíval se BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Sekvenční PCR předcházela purifikace. Pouţilo se 5 µl PCR směsi (4µl na 15 µl), 1,67 µl alkalické fosfatázy SAP (Shrimp Alcalic Phosphatase), 0,33 µl endonukleázy EXO I. Směs se odstředila při 2000 ot/min. za laboratorní teploty, inkubovala se 1 hod. při 37 C, poté se promíchala a denaturovala pomocí exonukleázy po dobu 15 min. při 75 C. Pro sekvenační PCR se pouţil 1 µl premixu, 0,5 µl sekvenačního pufru, který je součástí kitu BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, 0,08 µl primeru (pro kaţdý primer byla provedena sekvenační PCR zvlášť) a 1 µl přečišťeného produktu předchozí PCR. Reakční směs se doplnila destilovanou vodou do 5 µl. Sekvenační PCR: I) denaturace 95 C 1 min II) denaturace 95 C 10 s anelace a elongace 55 C 10 s 60 C 4 min x II) chlazení 4 C Produkt sekvenační PCR byl přečištěn pomocí BigDye Exterminator purifikačního kitu (Applied Biosystem). Pouţilo se 25 µl PCR produktu, 20 µl roztoku SAM a 5 µl exterminatoru (suspense). Reakční směs byla protřepávána po dobu 30 min. a odstředěna při 1000 otáčkách za minutu. K vlastní sekvenaci bylo pouţito 10 µl supernatantu. 47

43 Zpracování dat Analýza mikrosatelitů Curik et al. (2003) hodnotil heterozygotnost u lipicánů na základě analýzy 17 mikrosatelitních lokusů na 14 chromozómech pomocí programového balíčku SAS statistical package (SAS Institute ). Achmann et al. (2004) provedl studii 22 mikrosatelitních lokusů na 16 chromosomech u 561 lipicána a 47 kladrubských koní. Hodnotil tyto charakteristiky: frekvence alel, počet alel, pozorovaná heterozygotnost a genetická diverzita (vs. očekávaná heterozygotnost podle Hardyho-Weinbergova zákona) počítaná pro jednotlivé lokusy a/nebo subpopulace programový balíček SAS statistical package (SAS Institute ). Testy odchylky od Hardyho-Weinbergova zákona (HWZ) byly provedeny pomocí softwarového balíčku GENEPOP v. 3.3 (březen 2001); dostupný na ftp://ftp.cefe.cnrs-mop.fr/genepop/ Genetická struktura lipického koně byla analyzována pomocí Wrightova koeficientu F (Wright 1951) Koeficienty fixace (F ST, F IS a F IT ) byly spočítány podle Weir and Cockerham (1984) s pouţitím softwarového balíčku GENETIX 4.04 (leden 2003, Belkhir et al. 2002; dostupný na Počet efektivních migrantů za generaci (Nm, kde N je celkový efektivní počet koní a m je míra migrace) je zaloţen na odhadech F ST (Weir and Cockerham 1984) a byl spočítán podle vzorce Nm = (1 - F ST )/4 F ST, odvozeného Wrightem (1969). 48

44 Vztah mezi odhady Nm jednotlivých hřebčínů získanými z genetické analýzy 561 koně a poměrem migrujících koní mezi dvojicemi hřebčínů (součet emigrujících a imigrujících koní dělený celkovým počtem koní v dané dvojici hřebčínů) byl analyzován pomocí regresní lineární analýzy. Molekulárně genetická příbuznost mezi subpopulacemi byla odvozena pomocí distance D AS sdílených alel (Chakraborty and Jin 1993). Distanční matice byly spočítány pomocí softwarového balíčku POPULATION v (Olivier Langella; dostupný na Fylogenetické stromy (dendrogramy) byly sestrojeny za pomoci algoritmu UPGMA (Sneath and Sokal 1973). Dendrogramy byly vyhotoveny pomocí softwarového balíčku TREEVIEW v (2001), Page 1996; dostupný na D AS distance mezi subpopulacemi a rovněţ sdílení alel mezi jedinci byly uţity při analýze hlavních komponent (principal component analyses - PCA). K analýze a grafickému zobrazení bylo vyuţito softwaru SAS (SAS Institute ). Zařazení jednotlivých koní do nejpravděpodobnějších subpopulací bylo provedeno pomocí softwarového balíčku GENECLASS v (Cornuet et al. 1999); dostupný na V této práci byla hodnocena: Frekvence alel, pozorovaná heterozygotnost, genetická diverzita (očekávaná heterozygotnost za předpokladu Hardyho - Weinbergovy rovnováhy - HWE) 49

45 Test HWE a genetické vzdálenosti. Tyto charakteristiky byly odhadnuty napříč rozdílnými lokusy a liniemi s vyuţitím softwarového balíku TFPGA 1.3 (Miller, 1997), který vytváří standardizovanou matici genetických distancí s korekcí na malé vzorky (Nei, 1978). Shluková analýza. Byla provedena diskriminační metodou UPGMA, a vyjádřena jako dendrogram s vyuţitím analýzy bootstrap. Robustnost dendrogramu byla testována 1000 bootsrapovými vzorky. Algoritmus UPGMA byl pouţit, protoţe je vhodnější v porovnání s algoritmem Neighbour-Join v přítomnosti migrace jedinců mezi liniemi či rodinami (Achmann et al., 2004). Genetické diference uvnitř a mezi sledovanými liniemi. Byly zjištěny pomocí koeficientů fixace (F IS, F IT a F ST ) odhadnutých programem FSTAT (Gaudet, 2001) podle Weir and Cockerham (1984): F IS H S H S H I 2 a 2 a 2 b 2 b 2 w F ST H T H T H S 2 a 2 a 2 b 2 w F IT H T H T H I 2 b 2 b 2 w kde: H I heterozygotnost jedince v populaci, H S očekávaná heterozygotnost jedince uvnitř subpopulace, H T očekávaná heterozygotnost jedince v celé populaci, σ 2 a proměnlivost mezi subpopulacemi, σ 2 b proměnlivost mezi jedinci uvnitř subpopulace, σ 2 w proměnlivost mezi všemi jedinci. Počty migrantů za populaci (Nm). Byly odhadnuty ze vztahu (Wright, 1969) Nm 1 F 4F ST ST. 50

46 Vhodnost vyuţití mikrosatelitů k zařazení jedince do příslušné linie. Byla posuzována pomocí přiřazovacího testu, provedeného simulační metodou podle Rannala and Mountain (1997). Tato metoda hodnotí Bayesovským přístupem pravděpodobnost správného zařazení (P-hodnota) kaţdého jedince do linie. Pro přiřazovací test byl pouţit program GENECLASS 2 (Piry, 2004). Správnost zařazení jedince do linie byla ověřena analýzou hlavních komponent (principal component analysis - PCA), k čemuţ byl pouţit softwarový balík GENETIX (Belkhir et al., 2002) Linie starokladrubského koně a jejich zakladatelé jsou uvedeni v tab. 5. Pro srovnání byly stanoveny genetické příbuznosti mezi liniemi pomocí informací z rodokmene. Soubor rodokmenů 324 jedinců zahrnutých do analýzy zahrnoval 5 generací předků. Rodokmenové informace byly vyuţity k odhadu koeficientu inbreedingu (F X ) a koeficientu příbuznosti (R XY ). Úplnost rodokmenu, který má vysoký význam pro odhad komponent F X a R XY, byla hodnocena dle Cassell et al. (2003): cp a k g i 1 i 2 kde: cp je koeficient úplnosti rodokmenu, a k je počet známých předků v g generacích. Z rodokmene byla matice příbuznosti mezi jednotlivými jedinci sestavena od nejstarších jedinců po nejmladší. Koeficient inbreedingu jedince (F X ) byl odhadnut jako původový koeficient (coancestry coefficient) dle Falconer and Mackay (1996). F X = f ZY = 0,25 (f AC + f AD + f BC + f BD) kde: f je původový koeficient mezi dvěma jedinci, např. X a Y přičemţ A a B představují rodiče jedince X; zatímco C a D představují rodiče jedince Y. 51

47 Podobně jako u koeficientu inbreedingu byl odhadnut i koeficient příbuznosti mezi dvěma jedinci (R XY ) opět dle Falconer and Mackay (1996): R XY = 2f XY Pro odhad koeficientů inbreedingu a koeficientu příbuznosti byla vyuţita procedura INBREED programového balíku SAS (SAS, 2005). Míra genetické podobnosti na základě informací z rodokmene byla posouzena metodou shlukové analýzy za vyuţití procedury VARCLUS programového balíku SAS (SAS, 2005). Vstupní data tvořila průměrná hodnota koeficientu příbuznosti mezi liniemi Analýza mtdna Kavar et al. (1999) pouţili pro analýzu sekvencí mtdna programových balíčků ClustalW a PHYLIP (Felsenstein J. 1993). Stejného programového vybavení bylo pouţito v práci Kavar et al. (2002). Sekvence 385 pb dlouhého fragmentu upstream části a 310 pb dlouhého fragmentu downstream části kontrolní oblasti mtdna lipicánů byly porovnány se sekvencemi různých plemen domácího koně, sekvencemi koně Przewalského a pozdně pleistocénních koní z Aljašky za pouţití programu ClustalW. Dendrogram byl sestrojen pomocí programu PHYLIP. Graficky byl dendrogram znázorněn pomocí programu TreeView (Kavar et al. 2002). Ve studii zaměřené na variabilitu mtdna ve vztahu k původům arabských koní chovaných v USA byl k sestrojení dendrogramu taktéţ pouţit PHYLIP (Bowling et al. 2000). ClustalX Multiple Sequence Alingment Program (verze 1.81, Thompson et al. 1997) byl pouţit pro srovnání sekvencí u anglických plnokrevníků (Hill et al. 2002). Fylogenetický strom byl vizualizován pomocí TreeView. Pravděpodobnost identity (PI), tj. pravděpodobnost, ţe dva jedinci v populaci sdílejí identický haplotyp, byla vypočítána jako součet druhých mocnin frekvencí kaţdého haplotypu v dané populaci (PI = a 2 k, kde a je frekvence k-tého haplotypu, Bowling et al. 2000). 52

48 Ostatní statistiky diverzity byly spočítány pomocí programu Arlequin, verze 2.0 (Schneider et al. 2000, in: Hill et al. 2002). Royo et al. (2005) pouţili pro sekvenční analýzu program PILEUP (Feng and Doolittle 1987) z programového balíčku Winsconsin Package 10.2 (Genetics Computer Group, Madison, WI). Fylogenetická analýza byla provedena pomocí Arlequin 2.0 software package (Schneider et al. 2000) a NETWORK (Royo et al. 2005). Luís et al. (2006) provedli rozbor nukleotidové a haplotypové diverzity díky programu DNASP software a ARLEQUIN 2000 software a NETWORK software. Cothran et al. (2005) pouţili software MEGA verze 2.1. V práci zaměřené na původní japonská plemena bylo pouţito programu Genetyx Mac v (Software Development, Tokyo, Japan, in Kakoi et al. 2007). V této práci byl ke grafickému zobrazení výstupu ze sekvenátoru a jeho převedení do textového souboru ve formátu FASTA byl pouţit program SeqSkape. Mnohočetné přiřazení (multiply alignment) bylo provedeno manuální metodou pomocí volně distribuovaného programového balíčku BioEdit (Hall, 1999) s navazující fylogenetickou analýzu programem ClustalW, včleněným do programu BioEdit. Pro srovnání byla provedena fylogenetická analýza včetně mnohočetného přiřazení pomocí freewarových balíčků, resp. webové sluţby Phylogeny.fr dostupné na adrese (Dereeper A. et al. 2008), která nabízí různé postupy, skládající se z řetězce vloţených programů pro jednotlivé kroky plně automatické fylogenetické analýzy. Byly vybrány programové řetězce One Click Mode, kde jsou vloţené programy pro jednotlivé kroky analýzy předvoleny, a A la Carte Mode, kde si uţivatel tyto programy pro kaţdý krok volí sám z uvedené nabídky. V této práci byla pouţita tato kombinace: 1. krok mnohočetné přiřazení - program T-Coffee 2. krok zpřesnění ( pročištění ) alignmentu program Gblocks 0.91b 3. krok odhad fylogeneze program MrBayes krok grafické zobrazení dendrogramu TreeDyn nebo DrawGram 53

49 6. Výsledky 6.1. Analýza mikrosatelitní DNA Celkový počet alel nalezených na 16 mikrosatelitních lokusech u starokladrubského koně byl 132. Průměrný počet alel na mikrosatelitní lokus byl 8,25 s rozsahem 4 aţ 14. Pro pozorovanou heterozygotnost napříč všemi mikrosatelitními lokusy byla v průměru odhadnuta hodnota 0,637 a hodnota genetické diverzity 0,678. Pozorovaná heterozygotnost jednotlivých mikrosatelitů se pohybovala v rozmezí od 0,374 u mikrosatelitu HTG6 do 0,827 u mikrosatelitu AHT4. Podobně jako u heterozygotnosti byla nejniţší hodnota genetické diverzity zjištěna u mikrosatelitu HTG6 (0,406). Nejvyšší hodnota genetické diverzity však byla zjištěna u mikrosatelitu VHL20 (0,835). Celkové informace o odlišnostech a souhrnných statistikách jsou v tab. 9. Statisticky průkazná odchylka od HWE byla zjištěna u lokusů ASB23 (P < 0,01), HMS3 (P < 0,01), HMS7 (P < 0,01), HTG7 (P < 0,01) a VHL20 (P< 0,01). Podobné hodnoty pozorované heterozygotnosti a genetické diverzity byly také zjištěny u španělských keltských koní (Cañon et al., 2000), u lipicánů (Achmann et al., 2004), u německých taţných koní (Aberle et al., 2004) a u biłgorajského koně (Ząbek et al., 2005). Naopak Iwańczyk et al. (2006) uvádí hodnoty heterozygotnosti a genetické diverzity pro polské chladnokrevné koně výrazně niţší. Popisné statistiky mikrosatelitů napříč liniemi, tj. počet jedinců, průměrný počet alel, pozorovaná heterozygnost a genetická diverzita jsou uvedeny v tab. 10. Pozorovaná heterozygotnost a genetická diverzita vykazovaly pro všechny linie podobné hodnoty. Nejniţší hodnota heterozygotnosti byla zjištěna u linie Generale (0,569) a nejvyšší hodnota u linie Favory (0,680). Také u genetické diverzity vykazovala nejvyšší hodnotu linie Favory (0,677). Naopak nejniţší hodnotu genetické diverzity vykazovala linie Rudolfo (0,547). Nízká hodnota genetické diverzity u linie Rudolfo však můţe být způsobena zahrnutím nízkého počtu jedinců této linie do analýzy. Hodnoty pozorované heterozygotnosti a genetické diverzity jsou ovlivněny počtem alel. 54

50 Tab. 9: Charakteristiky a souhrnné statistiky pro mikrosatelitní lokusy analyzované u populace starokladrubského koně Lokus Počet alel Rozmezí Pozorovaná heterozygotnost Genet. diverzita Lokace na chromozomu Genet. odlišnost (G ST ) AHT ,827 0, ,076 AHT ,716 0, ,081 ASB ,821 0, ,060 ASB ,784 0, ,085 ASB ,534 0, ,073 CA ,651 0, ,029 HMS ,519 0, ,063 HMS ,725 0, ,044 HMS ,509 0, ,070 HMS ,685 0, ,075 HMS ,549 0, ,076 HTG ,682 0, ,106 HTG ,374 0, ,114 HTG ,556 0, ,162 LEX ,497 0,561 X 0,044 VHL ,765 0, ,115 Průměr ,637 0,678-0,081 Z tab. 10 je zřejmé, ţe s výjimkou linií Generale a Sacramoso dosahovala pozorovaná heterozygotnost vyšší hodnoty neţ genetická diverzita. To naznačuje pokles variability u zmíněných linií. Při poklesu efektivní velikosti populace (Ne) a poklesu variability dochází ke ztrátě vzácných alel z genového poolu a dochází ke sníţení genetické diverzity pod hodnotu pozorované heterozygotnosti, neboť vzácné alely přispívají k hodnotě heterozygotnosti pouze nepatrně (Cunningham et al. 2001). Vyšší hodnoty pozorované heterozygotnosti neţ genetické diverzity pozoroval u ohroţené 55

51 populace asturonských poníků Cañon et al. (2000) a u malé populace biłgorajských koní také Ząbek et al. (2005). Genetická variabilita u starokladrubského koně se udrţuje pomocí připařovacích plánů, kdy se rodičovské páry sestavují z co moţná nejméně příbuzných jedinců. Díky tomu došlo k sníţení koeficientu inbreedingu v celkové populaci o 2,87% z hodnoty 7,75% u koní narozených v roce 1993 na hodnotu 4,88% u koní narozených v roce 2003 (Jakubec et al. 2009). Hodnoty genetické odlišnosti (G ST ) vykazovaly celkovou odlišnost 8,1%. Tato hodnota je ve shodě s hodnotami publikovanými Cañon et al. (2000) pro španělské keltské koně. Naopak je v rozporu s hodnotami, které uvádí Bjørnstad et al. (2000) pro norské koně (12%) nebo například pro plemena španělských oslů (3.6%) publikované Aranguren-Méndez et al. (2001). Tab. 10: Charakteristiky a souhrnné statistiky pro mikrosatelitní lokusy analyzované u linií starokladrubského koně Linie N Průměr počtu alel Pozorovaná heterozygotnost Genetická diverzita Generale 40 4,38 0,569 0,575 Generale-Generalissimus 60 5,50 0,623 0,600 Favory 80 6,06 0,680 0,677 Favory-Generalissimus 68 5,69 0,656 0,622 Sacramoso 198 6,75 0,637 0,660 Solo 120 5,44 0,624 0,618 Siglavi Pakra 28 4,25 0,647 0,604 Romke 32 4,63 0,630 0,605 Rudolfo 22 3,94 0,659 0,547 Hodnoty F statistiky jsou uvedené v tab. 11. Hodnoty F ST jsou si velmi podobné v rozsahu od 0,024 do 0,123. Z celkové hodnoty F ST multilokusů je zřejmé, ţe na celkové genetické proměnlivosti se rozdíly mezi liniemi podílejí jen 7%. Zbylých 56

52 93% je způsobeno rozdílností mezi jedinci. V průměru má kaţdá linie sníţený podíl heterozygotnosti pod 1%. Celková populace má sníţený podíl heterozygotnosti o 7,3%. Podobné hodnoty také zjistil při porovnání španělských keltských koní Cañon et al. (2000). Vysoké hodnoty F IS pro lokusy ASB23 a HMS3 odpovídají převaze jedinců homozygotních v těchto lokusech. Celková hodnota F IT udává průměrnou míru koeficientu inbreedingu v populaci. Tato hodnota (7,3%) se shoduje s hodnotou, kterou odhadl pro ţijící populaci v roce 1993 Jakubec et al. (2004). Statistické odchylky hodnoty F IS od 0 byly zjištěny u lokusu ASB23 u linií Generale, Generale-Generalissimus, Favory, Favory-Generalissimus, Sacramoso a Solo; u lokusu HMS3 u linií Favory, Generale a Generale-Generalissimus; u lokusu HMS7 u linií Sacramoso a Siglavi Pakra; u lokusu LEX3 u linií Favory-Generalissimus a Romke a u lokusu VHL20 u linie Sacramoso. U těchto mikrosatelitních lokusů a linií dochází k sníţení heterozygotnosti a to můţe mít za následek inbrední depresi. Zvýšení hodnoty F IS však můţe být zapříčiněno Wahlundovým efektem, způsobujícím pokles heterozygotnosti v populaci v důsledku jejího rozdělení na subpopulace, a nikoliv pouze nárůstem koeficientu inbreedingu. Naopak u linií Generale a Solo bylo zjištěno u mikrosatelitního lokusu HMS3, respektive ASB23 zvýšení heterozygotnosti. Statistické odchylky hodnoty F IS od 0 u lokusů ASB23, HMS3, HMS7, LEX3 a VHL20 odpovídají odchylkám těchto lokusů od HWE. Signifikantní odchylka F IS od 0 pro průměrné hodnoty byla zjištěna pouze u linie Favory-Generalissimus. U ostatních linií nebylo zjištěno odchýlení od 0, coţ ukazuje na stabilizaci genetické variability. Statistické sníţení hodnoty F IS u linie Sacramoso vykazuje ţádoucí nárůst genetické variability. 57

53 Tab. 11: Odhady F IT, F IS celá populace (F IS total), uvnitř liniové F IS a F ST G-Gss = Generale-Generalissimus, F-Gss = Favory-Generalissimus, Sigl.Pakra = Siglavi Pakra * P < 0,05, ** P < 0,01 58

54 Standardní genetické vzdálenosti (D) mezi liniemi podle Nei (1978) a genetické odlišnosti (diference) stanovené pomocí párového koeficientu F ST jsou uvedené v tab. 12. Nejniţší hodnota standardní genetické vzdálenosti podle Nei (1978) byla zjištěna mezi liniemi Sacramoso a Solo (0,049) a nejvyšší mezi liniemi Romke a Rudolfo (0,429). Lze to vysvětlit faktem, ţe Sacramoso a Solo fakticky tvoří jednu linii (zakladatel linie Solo byl z linie Sacramoso), zatímco zakladatelé linií Romke a Rudolfo byli různých plemen, byť společného starošpanělského původu, přičemţ Romke se pouţíval výhradně ve vraném, zatímco Rudolfo pouze v bílém stádě. Podobné hodnoty genetické diverzity publikoval Ząbek et al. (2005) při porovnání malé populace biłgorajských koní s běţnými plemeny koní. Párové (pairwise) koeficienty F ST vykazovaly u většiny párů linií střední hodnoty. Pouze mezi liniemi Generale vs. Solo, Generale vs. Siglavi Pakra, Generale vs. Romke, Generale-Generalissimus vs. Siglavi Pakra, Generale-Generalissimus vs. Romke a Siglavi Pakra vs. Rudolfo byla zjištěny vysoké hodnoty F ST., coţ ukazuje na vyšší genetickou distanci mezi zmíněnými liniemi. Na druhé straně mezi liniemi Sacramoso vs. Solo či Sacramoso vs. Romke byly odhadnuty hodnoty F ST nízké. Z hodnot párového koeficientu F ST je zřejmé, ţe od 2 do 17,4% je moţné mikrosatelitní variabilitu u starokladrubského koně vysvětlit rozdělením populace na černé a bílé stádo, které se po dlouhou dobu chovaly odděleně, tj. nedocházelo mezi nimi k výměně ani plemeníků, ani plemenic. Hodnoty F ST odpovídají hodnotám genetické vzdálenosti (D). Odhad toku genů (gene flow) je znázorněn jako průměrný počet migrantů za populaci (Nm), viz tab. 12. Největší poměr migrantů byl zjištěn mezi liniemi Sacramoso vs. Solo (12,1) a naopak nejniţší mezi liniemi Siglavi Pakra vs. Rudolfo (1,1). Tuto skutečnost je opět moţno vysvětlit rozdělením plemene na dvě více-méně nezávislé populace. Sacramoso a Solo jsou vrané linie, mezi kterými docházelo k intenzivní výměně chovného materiálu obojího pohlaví, zatímco linie Siglavi Pakra je vraná a linie Rudolfo bílá, tj. byly chovány jedna od druhé odděleně. Počty migrantů za populaci (Nm) jsou ve shodě s hodnotami genetické vzdálenosti (D) a párového koeficientu F ST. Vyšší počet migrantů je důsledkem snahy o připařování co nejméně příbuzných jedinců i mezi jednotlivými liniemi, čímţ se zamezuje blízké příbuzenské plemenitbě. 59

55 Tab. 12: Genetické vzdálenosti D podle Nei (1978) - nad diagonálou F ST ( pod diagonálou) spolu s počtem efektivních migrantů za populaci (v závorce) G-Gss = Generale-Generalissimus, F-Gss = Favory-Generalissimus Sigl. Pakra = Siglavi Pakra 60

56 Z UPGMA dendrogramu (obr. 7) je zřejmé, ţe linie byly rozděleny do dvou základních shluků. Tyto shluky představují rozdělení linií podle barevné varianty. Linie Solo, Romke, Siglavi Pakra a původně i Sacramoso jsou vrané; linie Generale, Generale-Generalissimus, Favory, Favory Generalissimus a Rudolfo představují zástupce běloušů. Jedinci linie Sacramoso se v poslední době vyskytuji v obou barevných variantách. Z prvního shluku jsou si nejvíce podobné linie Sacramoso a Solo. Tyto dvě linie jsou fakticky totoţné, neboť zakladatelem linie Solo byl hřebec Sacramoso XXXI, který byl v rámci regenerace starokladrubských vraníků přejmenován na Solo I a podílel se tak rozhodujícím způsobem na regeneračním procesu kladrubského vraníka. K těmto dvěma liniím je také v úzkém vztahu linie Romke. Tyto tři linie vykazovaly nejvyšší podobnost mikrosatelitních lokusů z celé populace. Tomu odpovídá i průměrný počet migrujících jedinců (Nm) mezi těmito třemi liniemi (tab. 12). Linie Siglavi Pakra vykazovala od vyjmenovaných linií výraznou genetickou vzdálenost. Toto zjištění však neodpovídá obecně známým faktům ani plemenářským záznamům. Zakladatel linie Siglavi Pakra byl lipický hřebec, tj. plemene nejblíţe příbuzného kladrubskému a mezi oběma plemeny docházelo v minulosti k poměrně časté výměně chovného materiálu (Bílek, 1957). Naproti tomu Romke byl fríský hřebec, coţ je plemeno přes společný starošpanělský původ dosti vzdálené a v chovu starokladrubského koně se aţ na zmíněného hřebce Romke neuplatnilo. Linie Generale Generalissimus a Favory Generalissimus vykazovaly nejvyšší genetickou podobnost. Ovšem jak vyplývá z plemenářské dokumentace, linie Generale Generalissimus je de facto linií Generale, zatímco linie Favory-Generalissimus je ve skutečnosti linií Favory. Není tedy logické, aby linie Generale Generalissimus (tj. Generale) byla vzdálenější linii Generale, neţ linii Favory Generalissimus (tj. Favory). Stejně tak neodpovídá známým historickým faktům, aby linii Favory-Generalissimus byla bliţší linie Generale Generalissimus neţ vlastní Favory. Linie Generale, která sice patří mezi linie nejstarší a současně se podílela, podobně jako linie Favory, na obnovení linie Generalissimus, vykazovala k těmto třem liniím uvnitř druhého shluku největší vzdálenost. Jak uţ bylo zmíněno výše, tato vyšší vzdálenost byla ovlivněna počty migrantů za populaci mezi zmíněnými liniemi. Podle svého původu by totiţ největší vzdálenost vůči ostatním měla vykazovat linie zaloţená poměrně nedávno lusitánským hřebcem Rudolfo, zatímco původní starokladrubská linie Generale a lipická linie Favory by si měly být bliţší. Z hlediska známých původů linií by tedy měly být na jedné 61

57 větvi linie Generale a Generale Generalissimus, na sousední větvi Favory a Favory Generalissimus a na nejvzdálenější větvi Rudolfo. Z obr. 7 dále vyplývá, ţe druhý shluk je charakterizován niţší robustností, neţ první, neboť vykazuje relativně niţší hodnoty bootstrappingu pro jednotlivé větve. Obr. 7: UPGMA dendrogram zkonstruovaný z genetických vzdáleností podle Nei (1978). Červená čísla u jednotlivých větví udávají hodnotu bootstrapingu Obr. 8 a téţ. příloha č. IV, znázorňují výsledky PCA analýzy linií na základě 16 mikrosatelitů. S výjimkou několika málo jedinců rozděluje osa 1 na jedince černé a bílé varianty. U osy 2, která by měla ukázat rozdělení na jednotlivé linie, uţ však k ţádné významné diferenciaci nedošlo. Z grafického znázornění je patrné, ţe jednotlivé linie se mezi sebou navzájem překrývají. U pravého shluku, který zahrnuje jedince linií vrané varianty: Sacramoso, Solo a Romke, je překryv větší. U levého shluku sice nedochází k tak výraznému nahloučení jedinců, ale linie jsou přesto promíchány mezi sebou v celém rozsahu. To je způsobeno nízkou četností populací a snahou o připařování co nejméně příbuzných jedinců metodou střídavého, resp. rotačního připařování. 62

58 Z výsledků přiřazovacího testu jedinců od příslušných linií bylo zjištěno, ţe na hladině významnosti P < 0,05 a P < 0,01 ( simulovaných jedinců) bylo správně zahrnuto pouze 53,70 % jedinců. Z výsledků hodnot bootstrappingu metody PCA zaloţené na 16 mikrosatelitech a z výsledků přiřazovacího testu vyplývá, ţe rozdílnost mezi jednotlivými liniemi není zřejmá. Z tohoto důvodu vyuţití pouze mikrosatelitních markerů pro přesné zařazení jedinců do linie u plemene starokladrubský kůň není vhodné. Obr. 8: Bodový graf relativních pozic 324 jedinců definovaný metodou hlavních komponent založený na korelační matici alel na 16 mikrosatelitních markerech. Pro srovnání byla stanovena genetická příbuznost mezi liniemi pomocí informací z rodokmene. U všech testovaných jedinců byl aţ do páté generace zjištěn úplný rodokmen (cp = 1). Popisné statistiky pro hodnoty koeficientu inbreedingu jedinců v jednotlivých liniích jsou uvedeny v tab. 13. Z tab. 13 vyplývá, ţe pro jednotlivé linie se průměrný koeficient inbreedingu pohyboval v rozmezí od 0,048 (Favory) po 0,096 (Generale). Nejvyšší míra variability v hodnotách koeficientu inbreedingu byla odhadnuta u linie Siglavi Pakra (SD = 0,050) a naopak nejniţší u linie Generale Generalissimus (SD = 0,019). Celková průměrná hodnota koeficientu inbreedingu přes všechny linie dosahovala hodnoty F x = 0,076 (SD = 0,038). Tato odhadnutá 63

59 průměrná hodnota koeficientu inbreedingu odpovídá odhadnuté hodnotě F IT v molekulární části analýzy (tab. 11, F IT = 0,073) a také hodnotě, kterou publikovali Jakubec et al. (2009) v analýze zahrnující všechny jedince populace starokladrubského koně narozené v roce 1993 (F x = 0,0775). Tab. 13: Popisné statistiky koeficientu inbreedingu (F x ) v liniích Linie Průměr F x SD Min Max Generale 0,096 0,022 0,062 0,139 Generale-Generalissimus 0,078 0,019 0,042 0,128 Favory 0,048 0,029 0,003 0,155 Favory-Generalissimus 0,049 0,030 0,005 0,096 Sacramoso 0,091 0,040 0,006 0,222 Solo 0,080 0,035 0,003 0,207 Siglavi Pakra 0,082 0,050 0,011 0,177 Romke 0,084 0,043 0,004 0,151 Rudolfo 0,051 0,025 0,011 0,085 Vše 0,076 0,038 0,003 0,222 F x = koeficient inbreedingu, SD = míra variability v hodnotách koeficientu inbreedingu Odhadnuté průměrné hodnoty koeficientu příbuznosti uvnitř a mezi jednotlivými liniemi jsou uvedeny v tab. 14. Průměrné hodnoty koeficientu příbuznosti uvnitř linií se pohybovaly v rozmezí od 0,179 (Favory a Sacramoso) aţ 0,304 (Generale Generalissimus). Průměrné hodnoty koeficientu příbuznosti mezi jednotlivými liniemi se pohybovaly od 0,040 (Generale Generalissimus Sacramoso) do 0,214 (Generale Generale Generalissimus). Vyšší průměrné hodnoty koeficientu příbuznosti svědčí o vyšší příbuznosti (provázanosti) jedinců linií. Celkově nízké hodnoty byly zjištěny mezi liniemi barevných variant (vraníci bělouši). Naopak uvnitř barevné varianty byla zjištěna vyšší průměrná hodnota koeficientu příbuznosti neţ mezi lini- 64

60 emi. To lze opět vysvětlit sestavováním rodičovských pádů z jedinců stejné barevné varianty. K připařování jedinců různých barevných variant dosud docházelo pouze v malé míře. Tab. 14: Průměrné hodnoty koeficientu příbuznosti uvnitř (na diagonále) a mezi liniemi (nad diagonálou) Linie G G-Gss Favory F-Gss Sacr. Solo SP Romke Ru Generale 0,301 0,214 0,152 0,173 0,085 0,039 0,056 0,042 0,198 G_Gss 0,304 0,153 0,176 0,087 0,040 0,045 0,043 0,176 Favory. 0,179 0,126 0,107 0,080 0,073 0,082 0,132 F_Gss 0,231 0,111 0,086 0,090 0,099 0,146 Sacramoso 0,179 0,176 0,159 0,162 0,091 Solo 0,257 0,195 0,212 0,052 Sigl. Pakra 0,279 0,185 0,064 Romke 0,215 0,065 Rudolfo 0,256 G = Generale, G-Gss = Generale-Generalissimus, F-Gss = Favory-Generalissimus, Sacr. = Sacramoso, SP = Siglavi Pakra, Ru = Rudolfo Z průměrných hodnot koeficientů příbuznosti mezi liniemi v tab. 14 byl sestaven graf shlukové analýzy (obr. 9). Tuto metodu pro zjištění podobnosti mezi jedinci plemene starokladrubského koně jiţ dříve pouţil Přibyl et al. (1997). Na základě informací z rodokmene byly linie, podobně jako na základě mikrosatelitních markerů, rozděleny do dvou základních shluků dle barevné varianty. Uvnitř těchto shluků dochází ve srovnání se shluky dle mikrosatelitních markerů k mírným změnám. U černé varianty vykazovaly nejvyšší příbuznost linie Solo a Romke. K těmto dvěma liniím je také v úzkém příbuzenském vztahu linie Sacramoso. Ani tyto výsledky však nejsou ve shodě s vývojovou příbuzností linií, neboť linie Solo vznikla formálním odštěpením od linie Sacramoso, a tedy jsou fakticky totoţné. Proto by z tohoto hlediska nejvyšší příbuznost měly vykazovat tyto dvě linie, další v pořadí by měla být linie Siglavi Pakra a nejvzdálenější by měla být linie Romke. 65

61 U linií bílé barvy byly při stanovení genetické příbuznosti touto metodou v nejbliţším příbuzenském vztahu linie Generale a Rudolfo, dále Favory a Favory Generalissimus. Uţší příbuzenský vztah mezi liniemi Favory a Favory Generalissimus lze vysvětlit jiţ zmíněnou regenerací linie Generalissimus linií Favory, avšak blízký příbuzenský vztah mezi Generale a Rudolfo nemá opodstatnění. Obr. 9: Shluková analýza zkonstruovaná z průměrných koeficientů příbuznosti mezi liniemi F F-Gss G-Gss G Ru Solo Ro Sacr SP G = Generale, G-Gss = Generale-Generalissimus, F = Favory, F-Gss = Favory-Generalissimus, Sacr = Sacramoso, Solo = Solo, SP = Siglavi Pakra, Ro = Romke, Ru = Rudolfo Při porovnání odhadnutých hodnot na základě mikrosatelitních markerů a rodokmenových informací jsou patrné jisté rozdíly pouze v utváření shluků uvnitř barevných variant (obr. 8). Je zřejmé, ţe zařazení jedince do linie u plemene starokladrubský kůň pouze na základě analýzy 16 mikrosatelitních lokusů rozptýlených na 10 chromozómech není spolehlivé. Avšak ani genetická příbuznost mezi liniemi stanovená pomocí informací z rodokmene neodpovídá známým faktům jejich vzniku a vývoji. 66

62 6.2. Analýza mtdna Byla provedena analýza 293 nukleotidového úseku D smyčky mtdna u 170 kladrubských koní z 23 rodin (tab. 15). Tab. 15: Seznam sledovaných rodin a používané zkratky RODINA ZKRATKA Barva počet zv. Pozn. Africa - Maestosa "E" (1740) AFM vr-běl 7 reg Almerina - Albona (1769) ALA běl 15 Almerina - Aluta "P" (1769) ALU běl 4 Almerina - Campanella (1769) ALC vr-běl 8 reg Almerina - Egloga (1769) ALE běl* 12 Almerina - Formosa (1769) ALF vr 6 reg Almerina - Maja (1769) ALM vr-běl 7 reg Bárta (1953) B vr-běl 9 reg Cariera (1894) C běl* 12 Dana "G" (1969) DA běl 4 Deflorata - Plutona (1767) DEP vr 2 reg Favora (1963) F běl 9 Madar VI - Káča "F" (1782) M běl 3 Narcis "I" (1939) N vr-běl 7 reg Ragusa (1888) RS běl 13 Ragusa-Raguza (1888) RSR vr-běl 5 reg Rava - Maga(1755) RVM vr-běl 4 reg Rava - Ravana (1755) RVR běl 5 Ritorna (1974) RIT vr 5 Sardinia - Magura (1970) SAM vr 10 reg Sardinia - Neapolitana "C" (1770) SAN vr-běl 7 reg Sardinia - Septimia (1770) SAS vr-běl 7 reg Xandra (1938) X vr-běl 9 reg *) - ve zkoumaném vzorku zvířat z této rodiny se vyskytla 1 hnědka reg = rodiny zaloţené v rámci regeneračního procesu kladrubského vraníka 67

63 Do souboru byly zahrnuty téţ příslušné části DNA dvou jedinců osla domácího (Equus asinus accession DQ368596, verze DQ , GI: , Equus asinus accession NC001788, verze NC_ , GI: ) a andaluského koně (Pura Raza - PRE; accession EU256622, verze EU , GI: ) z nukleotidové databáze GenBank. Jako referenční (outgroop) sekvence byla pouţita sekvence GI: (GenBank). V tomto souboru bylo identifikováno 16 (resp. 17 při zahrnutí sekvence PRE do souboru) různých haplotypů. Oproti referenční sekvenci bylo nalezeno 48 (resp. 49 včetně PRE) polymorfních lokusů (příloha č. II). Průměrný počet polymorfismů na jeden haplotyp je 33,29; včetně PRE pak 33,39. Nejniţší počet rozdílů oproti referenční sekvenci byl 31, nejvíce 38 (bez PRE i vč. PRE). Počet polymorfních lokusů pouze v souboru kladrubských koní (tj. bez outgroop sekvence i bez sekvence PRE) činil 20, při zahrnutí sekvence PRE do souboru pak 21 (tab. 16). Jednotlivé kladrubské sekvence se od sebe navzájem lišily v rozmezí od 1 po 12 rozdílných lokusů. V rámci fylogenetické analýzy byly potvrzeny tyto rodiny (seznam rodin a zkratek viz tab. 15): Bárta (B), Dana G (DA), Madar VI Káča F (M), Rava Maga (RVM), Rava-Ravana (RVR), Ritorna (RIT), Sardinia Magura (SAM), Sardinia Neapolitana C (SAN), Sardinia Septimia (SAS.ost.), které tvoří samostatné clustery. Z rodiny SAS se vyčleňují 2 zvířata: 962 Santana (číslo genobanky A2575, rodina SAS), jejíţ haplotyp se od haplotypu ostatních příslušníků rodiny liší na lokusu 144 (substituce A/G- Santana/SAS), 121 (G/A) a 288 (T/C) 405 Sorga (A2601SAS) se substitucemi T/G (Sorga/SAS) na 114. lokusu a T/C na 288. lokusu. 68

64 Tab. 16: Polymorfní lokusy kladrubských rodin Afr-Rag = Africa Maestosa E, Ragusa, Ragusa-Raguza SDFN = 390 Caprida (A2605SAN), Deflorata-Plutona, Favora, Narcis I SAS A2575 = 962 Santana (č. genobanky A2575, rodina Sardinia- Septimia) SAS A2601 = 405 Sorga (č. genobanky A2601, rodina Sardinia- Septimia) 69