Seminář izolačních technologií

Transkript

1 Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 ÚMFGZ MZLU v Brně Projekt FRVŠ 2385/2007 1

2 Strukturní typy NK Lineární molekuly jednořetězcové DNA a RNA dvouřetězcové DNA a RNA Kružnicové molekuly jednořetězcové DNA a RNA dvouřetězcové DNA a RNA Projekt FRVŠ 2385/2007 2

3 Lokalizace jaderné DNA Projekt FRVŠ 2385/2007 3

4 Struktura DNA ze dvou polydeoxyribonukleových řetězců komplementární antiparalelní 5-3 a 3-5 vodíkové můstky stabilní při ph 4-9,5 Projekt FRVŠ 2385/2007 4

5 16 20 kb 37 genů rrna trna geny CO (c-oxidáza) ND1 ND6 (NADHdehydrogenáza) geny pro ATPázy aj. mtdna Projekt FRVŠ 2385/2007 5

6 Informace - NK informace primárně obsažená v nukleotidové sekvenci (primárně proto, že jinde taková informace není) genetická proto, že se dědí GI je ve formě nukleotidů obvykle informace o prim. struktuře polypeptidů a prim. struktuře DNA nebo RNA v DNA nebo RNA je info o prim. str. proteinu DNA obs. info o prim. struktuře biologicky funkční RNA (trna, rrna, sirna aj.) RNA sekv. může obs. info o prim str. DNA Projekt FRVŠ 2385/2007 6

7 DNA : RNA genetický kód mtdna, chdna, jaderná DNA kóduje proteiny obsahuje SNPs může mutovat mikrosatelity v každé buňce stejná stabilní informace jaká RNA? v jaké tkáni? záleží na stáří mrna protein mrna = protein Projekt FRVŠ 2385/2007 7

8 RNA savčí buňka obsahuje cca 10-5 ug v eukariotické buňce je v jeden čas transkribováno cca 12tis. genů (tj. cca 500tis. mrna). rrna (28S,18S, 5S) 80-85% trna, snrna 15-20% mrna 1-5% 0.5kb 20kb ve 15-20tis. kopií a cca 200polyA délka prům. proteinu je aa Projekt FRVŠ 2385/2007 8

9 RNA RNA purine AG / pyrimidine CU rrna (5S, 18S, 28S) trna (struktura jetelového lístku, cca 80 aa) mrna 5 čepička 3 polya, mrnas zaujímá cca 1/100 celkové RNA half-life z několika min. (eukario. reg. proteins) až několik let (semena a spóry) heparin loops internal loops klubka snrna, sirna Projekt FRVŠ 2385/2007 9

10 Nestabilita NK přítomnost nukleáz v buňce zdroje interní při homogenizaci vzorku zdroje externí laboratoř a laboratorní pomůcky prachové částice (bakterie,plísně) lidská pokožka RNázy velmi stabilní (až 240 C/4 hod) nevyžadují kofaktory účinné v nízkých koncentracích obtížná inaktivace kontaminace RNázami Projekt FRVŠ 2385/

11 Stabilizace a uložení NK DNA dny při 4 C týdny měsíce při -20 C roky při -70 C stabilizace RNA ve vzorku při odběru v okamžiku odběru RNA se stává extrémně nestabilní redukce specifických i nespecifických druhů mrna enzymatická degradace NK (DNázy, RNázy) okamžité zmrazení v tekutém dusíku a uložit při -80 C stabilizační roztoky: RNAlater vzorky krve určené k izolaci DNA (RNA) odebrat do chelatačních roztoků (EDTA kyselina etylendiaminotetraoctová) skladovat obvykle 1-5 dní při 4-8 C (DNA) dlouhodobě lze odběry skladovat při -20 C vzorky určené k izolaci RNA zpracovat optimálně do 4 hodin Projekt FRVŠ 2385/

12 Homogenizace vzorku Mechanické zpracování mechanicky N 2 ultrazvukem rotační píst protláčení buněk malým otvorem mixováním Rozrušení buněčných stěn nebo virových nukleokapsidů působením enzymů (lysozym a celulázy) rozpuštění biomembrán a denaturace proteinů detergentem (např. Triton X-100 a laurylsíran sodný) + EDTA Enzymatické kroky pro odstranění kontaminant Proteináza K nebo pronáza E RNáza nebo DNáza Projekt FRVŠ 2385/

13 Odběr vzorků popis vzorků čerstvý vzorek (samovolný rozklad vzorku) mrna z jiných tkání (studium genové exprese) tkáně a orgány odběr více zvířat (AA + aa = Aa) forenzní odběr (odběr řadového policisty ) vystříhat se inhibitorů jednotlivé buňky (např. prokaryotických organizmů nebo kvasinek), laserové mikrodisekce virové částice purifikované centrifugačními technikami NK v elektroforetických gelech nebo produkty PCR Projekt FRVŠ 2385/

14 Typy metod pro izolaci nukleových kyselin Metody využívající rozdílné rozpustnosti fenolové extrakce a etanolové nebo izopropanolové precipitace (srážení) obecně rozšířené, široké aplikace vhodné pro vysokomolekulární genomové NK Metody adsorpční DNA se váže na křemičité sklo v přítomnosti chaotropní látky vhodné zejména pro rychlou purifikaci plazmidů a malýchfragmentů DNA Centrifugace v hustotním gradientu izopyknické centrifugace v gradientu CsCl vhodné při velkém množství a pro vysokou čistotu možnost frakcionace podle velikosti v sacharózových gradientech Projekt FRVŠ 2385/

15 Centrifugace Projekt FRVŠ 2385/

16 Adsorpční metody rychlá metoda vysoký výtěžek (malé fragmenty) vysoká čistota Oxid křemičitý (kolonky) chaotropní soli guanidin thiokyanát nebo guanidin hydrochlorid jodid sodný Síla vazby závisí na typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) iontové síle ph roztoku Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H 2 O Projekt FRVŠ 2385/

17 Mechanismus interakce DNA s kolonkou Projekt FRVŠ 2385/

18 Izolace mrna Klasické totalrna, separace na mrna, rrna a trna pomocí např. elektroforezy, centrifugace aj. Afinitní využívající afinitu poly(a) konce u mrna a biotinem značené oligo(dt) sondy sonda se v lyzátu selektivně váže na mrna hybridní molekuly biotinylované dta mrna jsou imobilizovány na pevném podkladu pokrytém streptavidinem Projekt FRVŠ 2385/

19 Afinitní izolace mrna Streptavidin (bakterie Streptomyces avidinii) nebo Avidin Projekt FRVŠ 2385/

20 Fenolová extrakce promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu (popř. směs fenolu a chloroformu) NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze (chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku) centrifugace oddělení spodní (organická fáze) tvořené fenolem a chloroformem mezifáze (denaturované proteiny a zbytky buněk) horní vodné fáze (rozpuštěné NK) vysrážení nukleových kyselin etanolem popř. izopropanolem shromáždění precipitátu nukleových kyselin centrifugací a rozpuštění získaného sedimentu ve vhodném roztoku Projekt FRVŠ 2385/

21 Analýza a kvantifikace NK SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA vhodné pro měření vzorků, které jsou dostatečně čisté nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm (ssdna má o 20-30% větší absorbanci než dsdna) z hodnot optické hustoty lze koncentraci a čistotu vzorku stanovit podle empirických vztahů stupeň čistoty NK se stanovuje z poměru abs. 260/280 nm při znečištění vzorku proteiny (280 nm), bude vypočtený poměr výrazně nižší a stanovení koncentrace NK nebude přesné 40xOD260 = koncentrace RNA (ug/ml) OD260 1 je 40ug/mL proteiny 260 nm polysacharidy 230 nm FLUORESCENČNÍ METODA vhodné u vzorků s nízkou koncentrací NK nebo znečištěných využívá se komplex etidiumbromidu/nk vzniká viditelné červenooranžové světlo o vlnové délce 590 nm Projekt FRVŠ 2385/

22 Projekt FRVŠ 2385/

23 Projekt FRVŠ 2385/

24 Izolační automaty -Automatizace Projekt FRVŠ 2385/

25 ??? z čeho izolujeme z krve z mléka z chlupu cena rutina Projekt FRVŠ 2385/

26 Děkuji Vám za pozornost Renčín

27 Použitá literatura a zdroje Rapley R., Manning D. L. (1998): RNA Isolation and Characterization Protocols. Publisher: Humana Press, Page Count: 280, ISBN: Stratagene, Brilliant SYBR Green SideStep QRT-PCR Master Mix, 2-Step (Instruction Manual - Catalog #400906) Ralf M.Zimmermann and Edward C.Cox (1994): DNA stretching on functionalized gold surfaces. Nucleic Acids Research, Vol. 22, No RNA Blue (návod), QIAGEN, QIAamp DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 2003, Marvan F. et al. (1998): Morfologie hospodářských zvířat. Brázda, Praha, 303 s. ISBN Chomczynski P. (1993) A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques 15, Essential Cell Biology: Bruce Alberts, Dennis Bray, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts + Peter Walter (1998): An Introduction to the Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., ISBN Projekt FRVŠ 2385/