Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava

Transkript

1 Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava Chov prasat 2016, SCHP, Tři věžičky, 3. listopadu 2015

2 Možnosti virologické a sérologické diagnostiky ze slin prasat 1) Úvod co to jsou sliny resp. orální tekutiny 2) Možnosti a limity testování ze slin 3) Diagnostické metody a interpretace lab. výsledků 4) Postup při odběrů vzorků a strategie vzorkování 5) Trouble-shooting-doporučení 6) Jak zacházet se vzorkem slin 7) Strategie vzorkování / počet vzorků 8) Závěrečné shrnutí

3 Úvod Co jsou to orální tekutiny? ORAL FLUIDS = OF OT = sliny + slizniční transudát + cervikální gingivální tekutina +sérové či lokální patogeny a protilátky (IgM, IgA, IgG) : lokální Ab ze slinných žláz (B buňky) a lymfoidní tkáně (B buňky MALT/DALT); patogeny z tonsil (např. virus KMP) sérové slizničního transudát protilátky i patogeny + buněčný detritus, zbytky potravy, enzymy, antibakteriální látky, léky apod.

4 Historie Sliny humánní diagnostické testy: přítomnost protilátek poprvé prokázána již v roce 1909 (Maltská horečka B. melitensis) nyní jsou široce využívány testy ze slin např.: spalničky, HIV, Epstein-Barr virus, hepatitida (A, B, C), příušnice, zarděnky, M. tuberculosis, SARS, parvovirus, herpesvirus a další vývoj rychlých testů (20 min.)

5 Slinné biomarkery a možnosti jejich využití Biomarkery sliny/ot DNA RNA proteiny muciny/glykoproteiny možnosti jejich využití standardní genotypizace bakteriální infekce diagnostika karcinomů hlavy a krku forenzní hledisko virová/bakteriální identifikace karcinomy hlavy a krku diagnostika periodontitis diagnostika karcinomů hlavy a krku detekce zubního kazu diagnostika karcinomů hlavy a krku detekce zubního kazu imunoglobuliny diagnostika virů (HIV, hepatitis B a C) metabolity drogy a jejich metabolity viry, bakterie buněčný materiál diagnostika periodontitis monitoring drog detekce drogy v těle Epstein-Barr virus -reaktivace (mononukleóza), HIV, Hepatitida A,B, C, atd. diagnostika karcinomů hlavy a krku

6 Sliny jako diagnostický vzorek ve veterinární medicíně: historie donedávna velmi málo využívané např. na: detekci Escherichia coli O157:H7 a Salmonellasp. ve výkrmu skotu diagnostika viru kočičí leukémie vsouvislosti s možným přenosem např. virus vztekliny uprasat virus ACH, virus vezikulární stomatitidy, virus SLAK apod. výskyt specifických protilátek ve slinách prasat prokázán: u APP (1993), Streptococcussk. E (1973) a podjednotka B choleratoxinu (2004).

7 Současnost Výzkum diagnostiky ze slin pro veterinární praxi ( ): Veterinary Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University,Ames, IA Jeff Zimmerman, John Pricketta další

8 EUROPEAN LAB NETWORK FOR ORAL FLUID DIAGNOSIS IN PIGS ( )

9 Možnosti a limity testování ze slin u prasat Detekce specifických protilátek: PCV2, PRRSV, SIV, Actinobacillus pleuropneumoniae,erysipelothrixrhusiopathiae Detekce patogenů (genom, NK): PCV-2, PRRSV, SIV, virus KMP, Mycoplasma hyopneumoniae, virus SLAK, BVDV,virus Aujeszkyho choroby, virus vezikulární stomatitidy, Erysipelothrix rhusiopathiae, apod. ALE NEVŽDY IDEÁLNÍ,např.: Mycoplasma hyopneumoniae interpretace PCR?- falešně negativní? (spíše hlubokévýtěry zprůdušnicealaváže, výťěry zbronchů,změněnáplicní tkáň,sérologie párovévzorky) Actinobacillus pleuropneumoniae PCR pozitivní jen 1-7 den po infekci (CostaG.,etal. 2012) Další probíhající výzkum využití slin v diagnostice: např. M. hyorhinis, Lawsonia intracellularis, virus AMP, Salmonella spp., virus PED, Haemophilusparasuis, apod. ale také ATB (byly podány ATB?, dostatečné množství?, odbourávání ATB? apod.) adetekce proteinů akutní fáze apod.

10 Současné praktické využití slin jako diagnostického vzorku PATOGEN porcinní reprodukční a respiratorní syndrom (PRRS) DETEKCE PROTILÁTEK ELISA ANO DETEKCE VIRU (NK) PCR ANO virus chřipky (SIV) ANO ANO porcinní cirkovirus 2(PCV2) ANO ANO Mycoplasma hyopneumoniae ANO NE

11 Patogen PRRSV PCV2 SIV Dostupné diagnostické testy Diagnostický test RT PCR and nested PCR (diferenciaceeu a AM kmene) q Real-time RT PCR ELISA Oral Fluid IDEXX qpcr ELISA IgM, IgG Semikvantitativní ELISA (Synbiotics Merial/LDA22) RT PCR M. hyop. PCR blokovací ELISA IDEXX všechny tyto testy na sliny již akreditovány a k dispozici v laboratoři SVÚ JIHLAVA

12 Mezilaboratorní porovnání testů ze slin mezinárodní kruhové testy Účast SVÚ Jihlava v rámci EUROPEAN LAB NETWORK FOR ORAL FLUID DIAGNOSIS IN PIGS Test I. (2013) -panel vzorků na porovnání testů: anti-pcv2 protilátky ve slinách -ELISA anti-prrsv protilátky ve slinách -IDEXX OF ELISA virus PRRSV ze slin Real time RT PCR virus chřipky (SIV) ze slin RT PCR Test II. (2014) - panel vzorků na porovnání schopnosti detekce viru PRRS metodou RT PCR ve vzorcích slin různé kmeny viru, různá ředění, jedna metoda společná + jedna vlastní, různé extrakce apod.

13 IDEXX PRRS OF AbTest optimalizované ředění vzorku (1:2) změna v inkubaci vzorků (2 hodiny) změna konjugátu = výsledná sensitivita 100% a specifita 98,7 %

14 Protilátková odpověď proti viru PRRS (kmeny typu I a II) v séru a ve slinách = malé rozdíly mezi časem, kdy lze detekovat protilátky v séru a ve slinách

15 PCR testy a sliny využívány běžné laboratorní PCR testy stejný postup jako v případě séra a tkání (pouze jiná matrice) Graf: Výsledky testu qrt-pcr na PRRSV v séru a ve slinách (+ objem získaných slin): 1a. IngelvacPRRS MLV 2b. terénní virus TYP 1 (US) 3c. terénní virus TYP 2 (EU)

16 PRRSV ve slinách qrt-pcr

17 PCV-2 ve slinách - qreal-time PCR: INTERPRETACE VÝSLEDKŮ pouze průkaz viru zde nestačí, pro interpretaci je nezbytné znát kvantitu viru!!! kvantitativní výsledek ze séra (jednotlivé vzorky) vs. kvantitativní výsledek ze slin (= směsný vzorek) kvantita viru vyjádřena v počtu kopií DNA viru na gram/ml vzorku (PCV-2 DNA log10) např. Hardinget al experimentálně stanoveny cut-off koncentrace k rozlišení zdravých x nemocnýchprasat (PMWS): cut-off pro vzorek tkáně = 7-8/gram cut-off pro vzorek séra = 4-5/ml cut-off pro sliny =??? (interpretace výsledku)

18 Interpretace laboratorních výsledků PCR = co se děje právě nyní = šíří prasata virus? PCRpozitivní výsledek reflektuje aktivní cirkulaci patogena v populaci. ELISA Ab pohled zpět = byl tam dříve virus? Upozornění: aby jste se vyhnuli falešně negativním výsledkům, ELISA testy a PCR testy určené kdetekci ze séra musí být validované na vzorky slin. Před zasláním vzorků dotazovat laboratoř. jestliže není validace = opatrně interpretovat výsledky

19 Postup při odběrů vzorků Materiál potřebný k odběru slin u prasat PrickettJR et al. 2008

20 Postup při odběrů vzorků 1) upevnění provazu 2) min.nechat prasata žvýkat provaz 3) sběr slin z provazu 4) slití slin do zkumavky a uskladnění

21 Postup při odběrů vzorků 1) Upevnění provazu na místo kam mohou všechna prasata, v čistější části kotce, ne přímo u zdroje vody a u krmiva délka: do výšky kohoutku prasat přítomných v kotci Ø 1.3 cm provaz - předvýkrm; Ø 1.6 cm provaz -výkrm 1 provaz/10-25 prasat (kotec)

22 Postup při odběrů vzorků 2) prasata žvýkají provaz minut je dostatečný čas (70-80% prasat/kotec o25ks)

23 Postup při odběrů vzorků

24 Žvýkala provaz všechna prasata? = reprezentativní vzorek pro všechna prasata v kotci Seddonet al V praxi se potvrzuje, že u prasat zvyklých na provaz je min. dostatečný čas na to, aby se na něm vystřídalo % zvířat z kotce (25 kusů/kotec), což je již dostatečně reprezentativní vzorek pro celou skupinu.

25 Postup při odběrů vzorků 3) sběr slin z provazu mokrý konec provazu do igelitového sáčku vymačkejte/vyždímejte provaz a sliny shromážděte v jednom rohu sáčku

26 Postup při odběrů vzorků 4) slití slin do zkumavky a uskladnění ustřihněte roh sáčku a slijte sliny do zkumavky (nejlépe 50-mL plastová centrifugační zkumavka) 4 ml vzorku je ideální pro následné testování (min. 2,5 ml) uchování lednička nebo mrazák zachovat chladící řetězec! rychlé odeslání do laboratoře (4 C)

27 Trouble-shooting: doporučení nesměsujte vzorky slin již jsou směsný vzorek provaz bavlna /bez latexu/ bez chemie trénování prasat ( trénovacíprovaz ) ochuťte provaz roztokem cukru (popř. džus, pivo) nenechávat provaz přes noc nepoužívejte provaz určený k tréningu zároveň k odběru na porodně vzorkujte starší prasata ( den stáří - jsou agresivnější a provaz je více přitahuje než mladší selata) ochucení provazu pomáhá u mladých nebo nemocných selat prasata jsou více aktivní ráno nečistý vzorek = provaz moc dlouhý nevyndávat provaz z kotce předčasně odstraňte pokaždé všechny provazy použitý provaz nikdy nepoužívat znova

28 Jak zacházet se vzorkem slin Veterinární lékař: vzorky, které budou odeslány v den odběru, zachladit a zaslat na ledu (4 C) NEBO okamžitě zamrazit dodržovat chladící řetězec k ochraně vzorku před odesláním vzorky dobře zabalit (zabránit vytékání slin) nejlépe do igelitového sáčku a do chladícího boxu Laboratoř: čiré vzorky slin není potřeba dále zpracovávat výrazně znečištěné vzorky slin centrifugovat 10 minut (1000g při 4 C) a pak přepipetovatdo čisté zkumavky testován je supernatant

29 Strategie vzorkování Sliny = směsný vzorek = diagnóza na úrovni stáda cenově výhodný program surveillance POČET VZORKŮ (počet provazů) and FREKVENCE vzorkování záleží na: počtu zvířat (na farmě, v kotci) prevalenci specifitě a sensitivitě diagnostického testu důvodu testování (diagnostika onemocnění, monitoring) Příklad rutinní surveillance se 30 vzorky séra /měsíc NEBO místo toho vzorkovat sliny např. 6 kotců (provazů)/ 1000 ks odstavčat každé dva týdny?

30 Strategie vzorkování Sliny = směsný vzorek = diagnóza na úrovni stáda cenově výhodný programsurveillance Diagnostika onemocnění (PRRS, PCV2, SIV) unemocných zvířat = akutní infekce = virémie = PCR (např. PRRSV 2-3 (5) týdnů virémie) po odeznění klinických příznaků = sérokonverze = ELISA -za 2 týdny pro SIV (7-42 dpi), PCV2 (14 to 198 dpi) -za 4 týdny PRRSV (resp. 7 dpi) např. 2-5 provazů (vzorků) /farma Monitoring určení nákazového statusu stáda (PRRSV, SIV) nebo např. monitoring s cílem zavedení vakcinace prasnic např. 6 provazů (vzorků) / 2 týdny / farma

31 Kalkulace nákladů monitoringu PRRS a srovnání s diagnostikou ze séra Příklad rutinní surveillance se 30 vzorky séra /měsíc NEBO vzorkovatsliny např. 6 kotců (provazů) / 1000 ks odstavčat každé dva týdny. Ceny: ELISA ze séra = 150,- Kč / 1 vz. 30 vzorků séra = 4500,- Kč / 1 měsíc ELISA ze slin = 260,- Kč / 1 vz. 6 vzorků slin = 1560,- Kč (1x za 2 týdny) = 3120,- / 1 měsíc NEBO jinak: 4500,- Kč = 17 x testování slin (20 zvířat/provaz), tzn. monitoruji 17 kotců = 340 zvířat ANEB za méně peněz více muziky??? Využitíslin =možnost zavedenírozsáhlejšíhomonitoringu, častějšítestování, svyšší sensitivitou na úrovni farmy, což poskytne přesnější mapování epizootologické situace.

32 Počet vzorků pro 95% jistotu detekce infekce (1 nebo více) s testem se 100% senzitivitou Velikost populace SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ Prevalence (%)

33 Správný počet vzorků? Příklad: detekce viru PRRS metodou RT-PCR Kolik mám odebrat vz. slin abych potvrdil virus v chovu?? Požadované proměnné: velikost (četnost) populace (hala/farma) 1000 zvířat prevalence (procento infikovaných zvířat) - 10% -70% požadovaná jistota detekce infekce (konfidence) 95% diagnostická sensitivita testu např. 87,5% Tab. Kolik bych měl testovat kotců (počet provazů) abych detekoval PRRSV ve vzorcích slin. prevalence PRRSV (sérum) jistota detekce 95% 10% 19 vzorků 20% 6 vzorků 30% 3 vzorky 40% 1 vzorek 50% 1 vzorek 60% 1 vzorek 70% 1 vzorek Robbenet al. 2014

34 Závěrečné shrnutí Nahradí vzorky slin vzorky séra např. v surveillance PRRSV? je to výborná nová pomůcka pro veterinární lékaře, chovatele, zootechniky i epidemiology ALE vzorky slin jsou reprezentativní pro populaci a nemůžou nikdyzcela nahraditindividuálnívzorky např.- - při snaze o izolaci mikroorganismů - ukvantitativního vyhodnocování výsledků (např. PCV2)

35 Závěrečné shrnutí 1 negativa manipulace se vzorky a způsob odeslání vzorků slin ovlivňuje kvalitu výsledků ne vždy zcela vhodné pro sající selata a pro prasnice nižší koncentrace viru oproti séru - problémy (někdy) s izolací a sekvenací specifické laboratorní testy přizpůsobení a validace testu sensitivita=? (např. PCR na SIV -sliny vs. nosní výtěry? ) pravděpodobně není vhodné pro některé rutinně testované patogeny APP, M. hyopneumoniae = zdvojené vzorkování (krev + sliny) v některých případech?

36 Závěrečné shrnutí 2 - pozitiva cenově výhodný monitoring populace popř. surveillance program neinvazivní sběr vzorku: welfare(bez stresu) jednoduchý odběr vzorků zjednodušené vzorkování by mohlo umožnit častější testování za stejné náklady a poskytnout tak přesnější epidemiologickou situaci vyšší sensitivita na úrovni farmy vzorky slin = více reprezentují populaci ve srovnání s tradičními individuálními 30 vzorky séra/měs. umožňuje rozsáhlý monitoring (PRRSV, PCV2, SIV) široký potenciál monitoring dalších patogenů?

37 Informace Jirásek T., Václavek P. Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál praktické zkušenosti. Veterinářství 2014; 64: VIDEO - PUBLIKACE, např.: Prickett, J. R. et al. Oral fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive andrespiratory syndromevirusandcircovirustype 2infections.J SwineHealthProd2008;16: Seddon, M. Y., et al. Optimising oral fluid collection from groups of pigs: Effect of housing systemandprovisionof ropes. VetJournal2012;193: Kittawornrat, A., et al. Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) antibodies in oral fluid specimens using acommercial PRRSV serum antibody enzyme-linked immunosorbent assay. JVet Diagn Invest. 2012;24(2): Prickett, J., et al. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: A longitudinal study under experimental conditions.jvetdiagninvest2008;20: Kittawornrat, A., et al. Ring test evaluation of the repeatability and reproducibility of aporcine reproductive and respiratory syndrome virus oral fluid antibody enzymelinkedimmunosorbentassay.jvetdiagninvest2012;24(6):

38 Děkuji za pozornost!

39 STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA Oddělení virologie