Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava

Transkript

1 Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava Chov prasat 2016, SCHP, Tři věžičky, 3. listopadu 2015

2 Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál OBSAH: 1) Úvod co to jsou sliny resp. orální tekutiny 2) Diagnostické metody a interpretace lab. výsledků 3) Postup při odběrů vzorků 4) Trouble-shooting-doporučení 5) Jak zacházet se vzorkem slin 6) Strategie vzorkování (počet vz.) 7) Závěrečné shrnutí

3 Úvod Co jsou to orální tekutiny = OT? ORAL FLUIDS = OF OT = sliny + sérový transudát (slizniční transudát + cervikální gingivální tekutina) OT obsahuje sérové či lokální patogeny a protilátky (IgM, IgA, IgG): lokální Ab ze slinných žláz (B buňky) a lymfoidní tkáně (B buňky MALT/DALT); patogeny z tonsil (např. virus KMP) sérové slizničního transudát protilátky i patogeny ze séra/krve + buněčný detritus, zbytky potravy, enzymy, antibakteriální látky, léky apod.

4 Historie Sliny humánní diagnostické testy: přítomnost protilátek poprvé prokázána již v roce 1909 (Maltská horečka B. melitensis) nyní jsou široce využívány testy ze slin např.: spalničky, HIV, Epstein-Barr virus, hepatitida (A, B, C), příušnice, zarděnky, M. tuberculosis, SARS, parvovirus, herpesvirus a další vývoj rychlých testů (20 min.)

5 Slinné biomarkery a možnosti jejich využití Biomarkery sliny/ot DNA RNA proteiny muciny/glykoproteiny možnosti jejich využití standardní genotypizace bakteriální infekce diagnostika karcinomů hlavy a krku forenzní hledisko virová/bakteriální identifikace karcinomy hlavy a krku diagnostika periodontitis diagnostika karcinomů hlavy a krku detekce zubního kazu diagnostika karcinomů hlavy a krku detekce zubního kazu imunoglobuliny diagnostika virů (HIV, hepatitis B a C) metabolity drogy a jejich metabolity viry, bakterie buněčný materiál diagnostika periodontitis monitoring drog detekce drogy v těle Epstein-Barr virus -reaktivace (mononukleóza), HIV, Hepatitida A,B, C, atd. diagnostika karcinomů hlavy a krku

6 Sliny jako diagnostický vzorek ve veterinární medicíně: historie donedávna velmi málo využívané např. na: detekci Escherichia coli O157:H7 a Salmonellasp. ve výkrmu skotu diagnostika viru kočičí leukémie vsouvislosti s možným přenosem např. virus vztekliny uprasat virus ACH, virus vezikulární stomatitidy, virus SLAK apod. výskyt specifických protilátek ve slinách prasat prokázán: u APP (1993), Streptococcussk. E (1973) a podjednotka B choleratoxinu (2004).

7 Současnost Výzkum diagnostiky ze slin pro veterinární praxi ( ): Veterinary Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University,Ames, IA Jeff Zimmerman, John Prickett a další

8 EUROPEAN LAB NETWORK FOR ORAL FLUID DIAGNOSIS IN PIGS ( ) Evropská laboratorní síť pro diagnostiku z orálních tekutin u prasat

9 Možnosti a limity testování ze slin u prasat Detekce specifických protilátek: PRRSV, SIV, PCV2, Actinobacillus pleuropneumoniae, Erysipelothrixrhusiopathiae, PED Detekce patogenů (genom, NK): PRRSV, SIV, PCV2, virus KMP, Mycoplasma hyopneumoniae, virus PED, virus SLAK, BVDV, virus Aujeszkyho choroby, virus vezikulární stomatitidy, Erysipelothrix rhusiopathiae, apod. ALENEVŽDY IDEÁLNÍ,např.: Mycoplasma hyopneumoniae interpretace PCR?- falešně negativní? (spíše hlubokévýtěry zprůdušnicealaváže, výťěry zbronchů,změněnáplicní tkáň,sérologie párovévzorky) Actinobacillus pleuropneumoniae PCR pozitivní jen 1-7 den po infekci (CostaG.,etal. 2012) Další probíhající výzkum využití slin v diagnostice: např. M. hyorhinis, Lawsonia intracellularis, virus AMP, Salmonella spp., virus PED, Haemophilusparasuis, APP apod. ale také ATB (byly podány ATB?, dostatečné množství?, odbourávání ATB? apod.) adetekce proteinů akutní fáze,kortizol,progesteron apod.

10 Současné praktické využití slin jako diagnostického vzorku PATOGEN porcinní reprodukční a respiratorní syndrom (PRRS) DETEKCE PROTILÁTEK ELISA ANO DETEKCE VIRU (NK) PCR ANO virus chřipky (SIV) ANO ANO porcinní cirkovirus 2(PCV2) ANO ANO Mycoplasma hyopneumoniae epidemický průjem prasat (PED) Actinobacillus pleuropneumoniae NE ANO ANO (?) ANO ANO NE

11 Patogen PRRSV PCV2 SIV Dostupné diagnostické testy Diagnostický test RT PCR and nested PCR (diferenciaceeu a AM kmene) q Real-time RT PCR ELISA Oral Fluid IDEXX qpcr ELISA IgM, IgG Semikvantitativní ELISA (Synbiotics Merial/LDA22) RT PCR M. hyop. PCR PED blokovací ELISA IDEXX PCR (+ ELISA?) všechny tyto testy na sliny již akreditovány a k dispozici v laboratoři SVÚ JIHLAVA

12 Mezilaboratorní porovnání testů ze slin: mezinárodní kruhové testy Účast SVÚ Jihlava v rámci EUROPEAN LAB NETWORK FOR ORAL FLUID DIAGNOSIS IN PIGS Test I. (2013) -panel vzorků na porovnání testů: anti-pcv2 protilátky ve slinách -ELISA anti-prrsv protilátky ve slinách -IDEXX OF ELISA virus PRRSV ze slin Real-time RT PCR virus chřipky (SIV) ze slin RT PCR Test II. (2014) - panel vzorků na porovnání schopnosti detekce viru PRRS metodou RT PCR ve vzorcích slin různé kmeny viru, různá ředění, jedna metoda společná + jedna vlastní, různé extrakce apod.

13 Průkaz protilátek proti viru PRRS IDEXX PRRS OF AbTest optimalizované ředění vzorku (1:2) změna v inkubaci vzorků (2 hodiny) změna konjugátu = výsledná sensitivita 100% a specifita 98,7 % Kittawornrat et al. 2010, 2011, 2012

14 Protilátková odpověď proti viru PRRS (kmeny typu I a II) v séru a ve slinách = malé rozdíly mezi časem, kdy lze detekovat protilátky v séru a ve slinách

15 PRRS,PCR testy a sliny využívány běžné laboratorní PCR testy stejný postup jako v případě séra a tkání (pouze jiná matrice) Graf: Výsledky testu qrt-pcr na PRRSV v séru a ve slinách (+ objem získaných slin): 1a. IngelvacPRRS MLV 2b. terénní virus TYP 1 (US) 3c. terénní virus TYP 2 (EU) 0-13 den více viru v krvi, ALE více viru v OF!

16 PRRSV ve slinách/séru qrt-pcr SLINY vs. SÉRUM = identická doba detekované virémie = 4-5 týdnů

17 PCV2Ab semikvantitativní ELISA (Synbiotics Merial/LDA22) SERELISA PCV2 Ab Mono BlockingELISA (Synbiotics) test je modifikován -přizpůsoben na detekci Ab proti PCV2 ze slin spolupráce Merial+ LDA22 (Ploufragan -Saint Brieuc, France) částečně kvantitativní výsledek (titry protilátek) jiné ředění vzorku slin než u séra problematická je interpretace titrů, neboť se jedná o směsný vzorek

18 PCV-2 ve slinách - qreal-timepcr: INTERPRETACE VÝSLEDKŮ pouze průkaz viru zde nestačí, pro interpretaci je nezbytné znát kvantitu viru!!! kvantitativní výsledek: sérum (jednotlivé vz.) VS. sliny (= směsné vz.) kvantita viru vyjádřena v počtu kopií DNA viru na gram/ml vzorku (PCV-2 DNA log10) např. Harding et al experimentálně stanoveny cut-off koncentrace k rozlišení zdravých x nemocných prasat (PMWS): cut-off pro vzorek tkáně = 7-8/gram cut-off pro vzorek séra = 4-5/ml cut-off pro sliny =??? (interpretace výsledku)

19 Interpretace laboratorních výsledků PCR = co se děje právě nyní = šíří prasata virus? PCRpozitivní výsledek indikuje rannou fázi infekce a aktivní cirkulaci patogenavpopulaci. ELISA Ab imunita stáda, pohled zpět = byl tam virus? Upozornění: aby jste se vyhnuli falešně negativním výsledkům, ELISA testy apcr testy určené k detekci ze séra musí být validované na vzorky slin. Před zasláním vzorků doporučujeme dotazovat laboratoř. jestliže není validace testu = opatrně interpretovat výsledky

20 Postup při odběrů vzorků Materiál potřebný k odběru slin u prasat Prickett JR et al. 2008

21 Postup při odběrů vzorků 1) upevnění provazu 2) min.nechat prasata žvýkat provaz 3) sběr slin z provazu 4) slití slin do zkumavky a uskladnění IDEXX Laboratories, Inc.

22 Postup při odběrů vzorků 1) Upevnění provazu na místo kam mohou všechna prasata, v čistější části kotce, ne přímo u zdroje vody a u krmiva délka: do výšky kohoutku prasat přítomných v kotci Ø 1.3 cm provaz - předvýkrm; Ø 1.6 cm provaz -výkrm 1 provaz/10-25 prasat (kotec) Dr. Keith Erlandson

23 Postup při odběrů vzorků MVDr. Jiří Malášek

24 Postup při odběrů vzorků 2) prasata žvýkají provaz minut je dostatečný čas (70-80% prasat/kotec o25ks)

25 Žvýkala provaz všechna prasata? = reprezentativní vzorek pro všechna prasata v kotci Seddonet al V praxi se potvrzuje, že u prasat zvyklých na provaz je min. dostatečný čas na to, aby se na něm vystřídalo % zvířat z kotce (25 kusů/kotec), což je již dostatečně reprezentativní vzorek pro celou skupinu.

26 Postup při odběrů vzorků Dr. Keith Erlandson 3) sběr slin z provazu mokrý konec provazu do igelitového sáčku vymačkejte/vyždímejte provaz a sliny shromážděte v jednom rohu sáčku

27 Postup při odběrů vzorků Dr. Keith Erlandson 4) slití slin do zkumavky a uskladnění ustřihněte roh sáčku a slijte sliny do zkumavky (nejlépe 50-mL plastová centrifugační zkumavka) 4 ml vzorku je ideální pro následné testování (min. 2,5 ml) uchování lednička nebo mrazák zachovat chladící řetězec! rychlé odeslání do laboratoře (4 C)

28 Trouble-shooting: doporučení nesměsujte vzorky slin již jsou směsný vzorek provaz bavlna /bez latexu/ bez chemie trénování prasat ( trénovacíprovaz ) ochuťte provaz roztokem cukru (popř. džus, pivo) nenechávat provaz přes noc nepoužívejte provaz určený k tréningu zároveň k odběru na porodně vzorkujte starší prasata ( den stáří - jsou agresivnější a provaz je více přitahuje než mladší selata) ochucení provazu pomáhá u mladých nebo nemocných selat prasata jsou více aktivní ráno nečistý vzorek = provaz moc dlouhý nevyndávat provaz z kotce předčasně odstraňte pokaždé všechny provazy použitý provaz nikdy nepoužívat znova

29 Jak zacházet se vzorkem slin (uskladnění + transport) Veterinární lékař: vzorky, které budou odeslány v den odběru, zachladit a zaslat na ledu (2-8 C /max. 24 hodin) NEBO okamžitě zamrazit dodržovat chladící řetězec k ochraně vzorku před odesláním vzorky dobře zabalit (zabránit vytékání slin) nejlépe do igelitového sáčku a do chladícího boxu Laboratoř: výrazně znečištěné vzorky slin centrifugovat 10 minut (1000g při 4 C) a pak přepipetovat do čisté zkumavky testován je supernatant

30 Strategie vzorkování Sliny = směsný vzorek = diagnóza na úrovni stáda cenově výhodný program surveillance POČET VZORKŮ (počet provazů) and FREKVENCE vzorkování záleží na: počtu zvířat (na farmě, v kotci) prevalenci specifitě a sensitivitě diagnostického testu důvodu testování (diagnostika onemocnění, monitoring) Příklad rutinní surveillance se 30 vzorky séra /měsíc NEBO místo toho vzorkovat sliny např. 6 kotců (provazů)/ 1000 ks odstavčat každé dva týdny?

31 SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ - SÉRUM Počet vzorků pro 95% jistotu detekce infekce (1 nebo více) s testem se 100% senzitivitou Velikost populace Prevalence (%)

32 Správný počet vzorků slin? Příklad: detekce viru PRRS metodou RT-PCR Kolik mám odebrat vz. slin abych potvrdil virus v chovu?? Požadované proměnné: velikost (četnost) populace (hala/farma) 1000 zvířat prevalence (procento infikovaných zvířat) - 10% -70% požadovaná jistota detekce infekce (konfidence) 95% diagnostická sensitivita testu např. 87,5% Tab. Kolik bych měl testovat kotců (počet provazů) abych detekoval PRRSV ve vzorcích slin. prevalence PRRSV (sérum) jistota detekce 95% 10% 19 vzorků 20% 6 vzorků 30% 3 vzorky 40% 1 vzorek 50% 1 vzorek 60% 1 vzorek 70% 1 vzorek Robbenet al. 2014

33 Správný počet vzorků slin? Příklad: detekce protilátek proti viru PRRS metodou ELISA IDEXX OF Kolik mám odebrat vz. slin abych potvrdil výskyt PRRS v chovu?? prevalence PRRSV - ELISA (sérum) (% + v kotci) Prasat (+/celkem) Pravděpodobnost detekce ze slin Počet vzorků séra k dosažení pravděpodobnosti jako ze slin 95% pravděpodobnost detekce 4% 1/25 15% 4 vz. 24 vz. 12% 3/ 25 45% 5 vz. 16 vz. 20% 5 /25 75% 7 vz. 12 vz. 36% 9 /25 95% 8 vz. 8 vz. Olsenet al IDEXX Laboratories, Inc. uvádí že při 20% prevalenci v kotci jsou protilátky detekovány testem ELISA PRRS IDEXX OF Ab Test s 96% jistotou. Při prevalenci 20-30% v kotci je stejná pravděpodobnost detekce z jednoho vzorku slin jako při testování jednotlivých vz. krve (8 vz. krve).

34 Pravděpodobnost detekce z jednoho odebraného séra či z jednoho vzorku slin (ELISA nebo RT-PCR) Pravděpodobnost detekce (%) jeden vzorek slin jeden vzorek séra Prevalence v kotci (%) Olsen et al. 2013

35 Strategie vzorkování slin Sliny = směsný vzorek = diagnóza na úrovni stáda cenově výhodný programsurveillance Diagnostika onemocnění (PRRS, PCV2, SIV, PED) unemocných zvířat (horečka, resp. problémy apod.) = akutní infekce = virémie = PCR (např. PRRSV 2-3 (5) týdnů virémie) po odeznění klinických příznaků = sérokonverze = ELISA -za 2 týdny pro SIV (7-42 dpi), PCV2 IgG (14 to 198 dpi) -od 7-9 dpi IgG pro PRRSV např. 2-4provazů (vzorků) /farma (hala) (v akutní fázi pro PCR, 1-2 týdny po akutní fázi ELISA + PCR) Pravidelný monitoring / aktivní surveillance (PRRSV, SIV) popř. určení/potvrzení nákazového statusu stáda, nebo monitoring s cílem zavedení vakcinace prasnic např. 4-6 provazů (vzorků) / 2-4 týdny / farma (1000 ks) Pricket et al. 2007, Pricket et al. 2008, Olsen elt al. 2013, Robben et al atd.

36 Kalkulace nákladů monitoringu PRRS (OT x sérum) X Příklad: rutinní surveillance se 30 vzorky séra/měsíc NEBO vzorkovatsliny např. 6 kotců (provazů) / 1000 ks prasat každé dva týdny. Ceny: ELISA ze séra = 150,- Kč / 1 vz. 30 vzorků séra = 4500,- Kč / 1 měsíc ELISA ze slin = 260,- Kč / 1 vz. NEBO jinak: 6 vzorků slin = 1560,- Kč (1x za 2 týdny) = 3120,- Kč / 1 měsíc 4500,- Kč = 17 x testování slin (20 zvířat/provaz), tzn. 17 kotců = 340 zvířat ANEB za méně peněz více muziky??? Využití slin =možnost zavedení rozsáhlejšího monitoringu, častější testování, svyšší sensitivitou na úrovni farmy,což poskytnepřesnějšímapování epizootologické situace.

37 Závěrečné shrnutí Nahradí vzorky slin vzorky séra např. v surveillance PRRSV? je to výborná nová pomůcka pro veterinární lékaře, chovatele, zootechniky i epidemiology ALE vzorky slin jsou reprezentativní pro populaci a nemůžou nikdyzcela nahraditindividuálnívzorky např.- - při snaze o izolaci mikroorganismů - ukvantitativního vyhodnocování výsledků (např. PCV2)

38 Závěrečné shrnutí 1 negativa manipulace se vzorky a způsob odeslání vzorků slin ovlivňuje kvalitu výsledků ne vždy zcela vhodné pro sající selata a pro prasnice nižší koncentrace živého viru oproti séru - problémy (někdy) s izolací a sekvenací specifické laboratorní testy přizpůsobení a validace testu sensitivita=? (např. PCR na SIV -sliny vs. nosní výtěry? ) dubiózní výsledek ze slin je nutné konfirmovat odběrem sér pravděpodobně není vhodné pro některé rutinně testované patogeny APP, M. hyopneumoniae = zdvojené vzorkování (krev + sliny) v některých případech?

39 Závěrečné shrnutí 2 - pozitiva cenově výhodný monitoring populace popř. surveillance program neinvazivní sběr vzorku: welfare(bez stresu) jednoduchý odběr vzorků zjednodušené vzorkování by mohlo umožnit častější testování za stejné náklady a poskytnout tak přesnější epidemiologickou situaci vyšší sensitivita na úrovni farmy vzorky slin = více reprezentují populaci ve srovnání s tradičními individuálními 30 vzorky séra/měs. umožňuje rozsáhlý monitoring (PRRSV, PCV2, SIV) široký potenciál monitoring dalších patogenů?

40 PREZENTACE Informace VIDEO - PUBLIKACE, např.: Jirásek T., Václavek P. Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál praktické zkušenosti. Veterinářství 2014; 64: Prickett, J. R. et al. Oral fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and circovirus type 2infections. J Swine Health Prod2008;16: Seddon, M. Y., et al. Optimising oral fluid collection from groups of pigs: Effect of housing systemand provision of ropes. VetJournal 2012;193: Kittawornrat, A., et al. Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) antibodies in oral fluid specimens using a commercial PRRSV serum antibody enzyme-linkedimmunosorbent assay.jvetdiagn Invest.2012;24(2): Prickett, J., et al. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: Alongitudinal study under experimental conditions. JVetDiagn Invest 2008;20: Kittawornrat, A., et al. Ring test evaluation of the repeatability and reproducibility of a Porcine reproductive and respiratory syndrome virus oral fluid antibody enzyme-linked immunosorbent assay.jvetdiagn Invest2012;24(6):

41 Děkuji za pozornost!

42 STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA Oddělení virologie