Kvantitativní hodnocení krevních cév biopsie peritonea

Transkript

1 5. sympozium o peritoneální dialýze Regionální centrum, Olomouc, Kvantitativní hodnocení krevních cév biopsie peritonea Z. Tonar 1, S. Opatrná 2, L Nedorost 1, M. Kultscherová 1, K. Witter 3 1 Ústav histologie a embryologie LF UK v Plzni 2 I. Interní klinika FN Plzeň 3 Institut für Histologie und Embryologie, VU Wien

2 Obsah sdělení Histologické změny peritonea při peritoneální dialýze (PD) Cíle práce Materiál a metody Přehled odhadů objemů, povrchů a počtu objektů Sampling Výsledky Odhady parametrů Analýza variability parametrů v sérii řezů výsledků mezi různými pozorovateli Diskuse Srovnání s literaturou: 2-D a 3-D měření Význam poměrů primárních parametrů Perspektivy Závěr

3 Změny peritonea při PD Epitel (Di Paolo 2000) deskvamace přeměna plochého na kubický ztráta mikroklků vakuolizace, hromadění inkluzí otevření mezibuněčných spojů polyploidie Submezotelové vazivo (Di Paolo 2000): fragmentace BM, po čase opět zesílení BM mezotelu i BM kapilár (multiplikace vrstev BM kapilár) submezotelový edém zvýšená buněčnost aktivace fibroblastů profibrotickými cytokiny z mezotelu zesílení kolagenního vaziva nad 50 µm (simple sclerosis), resp nad 150 µm (Williams, 2002) α-sm-aktin pozitivní myofibroblasty jsou častou známkou fibrózy (Del Peso 2005)

4 Změny peritonea při PD Cévy submezotelu: mikroangiopatie (zejména u DM), obliterace a hyalinizace cév, v.s. pokles počtu lymfatických cév ( transportní role zmnožených krevních cév?) vyšší exprese PAI-1 mezotelem (Pollock 2005) zvýšená vaskularizace na úrovni pre/kapilár (korelace s rychlostí peritoneálního transportu roztoku (Numata 2003)) peritoneální neoangioneze přes VEGF z mezotelu (Aquilera 2005) Problémy při hodnocení: omezená použitelnost ELMI (artefakty) nedostatečný popis a standardizace techniky biopsie i histologického hodnocení v publikacích omezená velikost vzorku některé ze změn jsou i u urémie bez PD

5 Cíle práce 1. navrhnout soubor parametrů pro kvantifikaci krevních cév peritonea a síly submezotelového vaziva 2. porovnat rozdíly při hodnocení těchto parametrů různými pracovníky

6 Materiál a metody 72 sériových řezů (síla 5 µ) bločkem biopsie parietálního peritonea zelený trichrom s Verhoeffovým železitým hematoxylinem 5 řezů zpracováno kombinací lektinové histochemie (Wheat Germ Agglutinin) a imunohistochemie (vwf) 5 řezů IHC α-sm-aktin moduly PointGrid, LineSystem a CountingFrame SW Ellipse3D (ViDiTo, Košice, SR) výběr 9 řezů ze série z každého řezu ještě 4 zorná pole při zvětšení hodnoceno pozorovateli A, B, C s identickým nastavením parametrů software Intraclass correlation coefficient (Shrout 1979) (Statistica 7.1, Statsoft CZ)

7 Odhady ploch/objemů testovacími mřížkami Obr. 1: Superpozice bodové testovací mřížky na mikrofotografii. Pravděpodobnost výskytu průsečíku s ROI je úměrná plošnému podílu ROI.

8 odhad plochy ROI v rovině řezu pomocí bodové testovací sondy (mřížky), rovnice 1, esta = a P (1) Delesseho princip plošný podíl dává odhad objemového podílu téže složky: A A = V V. (2) výpočet odhadu celkového objemu ROI Cavalieriho metoda mezi vybranými řezy je konstantní známá vzdálenost T (např. 40 µm), plochy jednotlivých řezů a součet těchto ploch A indexovaných i (v počtu m = 8) se poté vynásobí vzdáleností T podle rovnice 3. estv = T (A 1 + A Am) (3)

9 Odhady povrchové hustoty systém lineárních sond S V (Y, ref) = S(Y ) V (ref) [m 1 ], (4) kde S V (Y, ref) je povrchová hustota plochy povrchu S(Y ) v referenčním objemu V (ref). S V = 2I L, (5) S V (Y, ref) = 2 n I i=1 i l/p n P, (6) i=1 i kde I L je počet průsečíků plochy s lineárními testovacími sondami, l/p je délka testovací linieku počtu bodů pomocné mřížky. předpokladem je náhodnost orientace řezů (u objemů ne) testovací linie prokládané vzorkem musí být izotropní IUR či VUR řezy

10 Vertikální uniformní náhodné řezy VUR řezy nejsou izotropní ve 3-D izotropii zajistíme jen v arbitrárně zvolené horizontální rovině rotací o úhel φ vzorek pak krájíme systematicky náhodně kolmo na horizontální rovinu potřebujeme systém křivek, jejichž délková hustota je úměrná sin θ Obr. 2: Abitrární orientace horizontální roviny a rotace φ kolem vertikální osy.

11 Odhady plochy povrchů cykloidy s kratší osou s vertikálou mají délkovou hustotu úměrnou sin θ kombinace roviny generované VUR protokolem a sítí cykloid je ekvivalentní izotropním řezům (IUR) ve 3-D cykloidy lze použít k odkadu povrchové hustoty na VUR řezech Obr. 3: Síť cykloid.

12 Vzorkování Na každé úrovni odběru/vzorkování odebrané tkáně či histologických řezů by měl proběhnout systematický nestranný náhodný výběr. Obr. 4: Systematický nestranný náhodný výběr. 1. Pozice prvního vzorku v sérii je určena náhodným číslem. 2. Pozice dalších vzorků jsou ekvidistantní vzhledem k prvnímu. 3. Hustota vzorkování se řídí požadovaným koeficientem chyby. 4. Rozptyl metody je vždy minimálně stejný jako u prostého náhodného výběru, většinou je však význačně nižší.

13 Hodnocení koeficientu chyby CE je užitečnou mírou variability, která je pro základní soubor definována: CE = SD x (7) Posouzení variability výběru Cavalieriho řezů prostorově korelovanými objekty hodnocení variability způsobené výběrem (sampling error) odhadem CE (rovnice 8, 9) dle Gundersena a Jensenové (1987): estce n = 1 ai 3A + C 4B 12 (8) A = n a i a i, B = i=1 n 1 i=1 a i a i+1, C = n 2 i=1 a i a i+2 (9)

14 estv1: objem celého vzorku na řezu = µm 3 ICC: 0,894 (0,716 0,970) Obr. 5: Odhad estv1.

15 estv2: objem submezotelového kolagenního vaziva = 2, µm 3 ICC: 0,862 (0,629 0,961) Obr. 6: Odhad estv2.

16 estv3: objem všech cév rozlišitelných při daném zvětšení v subserózním vazivu = 1, µm 3 ICC: 0,912 (0,769 0,975) Obr. 7: Odhad estv3.

17 estv4: objem drobných cév v kolagenním submezotelovém vazivu (celkem ze 4 zorných polí z každého z 9 řezů) = 1, µm 3 ICC: 0,990 (0,984 0,994) Obr. 8: Odhad estv4.

18 estv5: objem submezotelového kolagenního vaziva (při velkém zvětšení) = referenční objem pro estv4 (celkem ze 4 zorných polí z každého z 9 řezů) = 9, µm 3 ICC: 0,992 (0,987 0,995) Obr. 9: Odhad estv5.

19 ests1: plocha peritoneálního povrchu vzorku = 1, µm 2 ICC: 0,745 (0,440 0,921) Obr. 10: Odhad ests1.

20 ests2: vnitřní povrch všech cév rozlišitelných při daném zvětšení v tukovém subserózním vazivu = 4, µm 2 ICC: 0,892 (0,721 0,969) Obr. 11: Odhad ests2.

21 ests3: vnitřní povrch malých cév v submezotelovém kolagenním vazivu při velkém zvětšení = 6, µm 2 ICC: 0,961 (0,937 0,977) Obr. 12: Odhad ests3.

22 ests4: povrch hranice mezotel/kolagen u snímků při velkém zvětšení = 1, µm 2 ICC: 0,868 (0,752 0,928) Obr. 13: Odhad ests4.

23 Analýza CE Obr. 14: Pro CE 0, 05 je nutno hodnotit min. 9 řezů ze série 72.

24 von Willebrandův faktor (endotel) Obr. 15: Počítání profilů vwf-pozitivních shluků (kapilár).

25 von Willebrandův faktor (endotel) Obr. 16: Hodnocení referenční plochy submezotelového vaziva.

28 α-sm aktin Obr. 19: Aktin-pozitivní buňky mohou být významné v submezotelovém vazivu.

29 α-sm aktin Obr. 20: Aktin-pozitivní buňky mohou být významné v submezotelovém vazivu.

30 Diskuse poměr estv 2/estS1 udává střední sílu submezotelového kolagenního vaziva = 173 µm; kontrolní měření kalibrovanou úsečkou (n=45) = 144 µm poměr ests2/estv 1 ukazuje povrchovou hustotu velkých cév v tukovém subserózním vazivu poměr a ests3/estv 5 ukazuje povrchovou hustotu malých cév v submezotelu poměr Q A = V P 2/estV 5 je analogický relative microvessel number a poměr estv 4/estV 5 je obdobný parametru relative microvessel area (Numata 2003)

31 Diskuse většina publikací (Zareie 2005, van Westhenen 2005, Numata 2003) používá parametry založené na hodnocení počtu/plochy profilů cév profily cév jsou 2-D struktury (průměty do roviny řezu) a jejich počet/plocha úhlu mezi osou cévy a rovinou řezu a délce cévy hodnocení povrchů cév má v.s. větší biologický význam hodnocení Q A relative microvessel number, density of microvessel profiles je jednoduché, použitelné i u vzorků variabilního vzhledu, efektivní a může vypovídat o ev. angiogenezi má smysl hodnotit větší cévy v subserózním vazivu? použití IHC? αsm-actin+ myofibroblasty u fibrózy;

32 Perspektivy 1. porovnání vzorků peritonea: za normy (bez urémie) během PD po HD (příjemci Tx ledviny) 2. Existuje korelace parametrů mikroskopických a klinických? 3. další testování variability na větším počtu vzorků

33 Závěr 1. Představili jsme novou metodiku nestranné stereologické analýzy cév a vaziva peritonea na mikroskopické úrovni. 2. Její validita a korelace s klinickými parametry bude předmětem dalších studií.

34 Literatura [1] Di Paolo N., Sacchi G.: Atlas of peritoneal histology in normal conditions and dutiny peritoneal dialysis. Perit. Dial. Int. 2000, Vol. 20, Suppl.3. [2] Gundersen H.J.G., Jensen E.B.: The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 1987, 147: [3] Numata M., Nakayama M., Nimura S. et al.: Association between an increased surface area of peritoneal microvessels and a high peritoneal solute transport rate. Perit. Dial. Int. 2003, 23: [4] Opatrná S., Opatrný K.: Peritoneální dialýza aktuální trendy. Postgraduální medicína 2003, 5: [5] Shrout P.E., Fleiss J.L.: Intraclass Correlations: Uses in Assessing Rater Reliability. Psychological Bulletin 1979, 2: [6] van Westrhenen R., Aten J., Aberra M. et al.: Effects of inhibition of the polyol pathway during chronic peritoneal exposure to a dialysis solution. Perit. Dial. Int. 2005, Suppl 3:S18 S21. [7] Zareie M., van Lambalgen A.A., ter Wee P.M. et al.: Better preservation of the peritoneum in rats exposed to amino acid-based peritoneal dialysis fluid. Perit. Dial. Int. 2005, 25:58 67.

35 Děkuji Vám za pozornost. Práce byla podpořena výzkumným záměrem LF UK v Plzni MSM Náhrada a podpora funkce některých životně důležitých orgánů.