PROTEOMIKA 2006 PTM. Nativní elektroforézy. Chromatografické Separace. Vícerozměrné separace. Membránové proteiny. Proteinové čipy

Transkript

1 PROTEOMIKA 2006 PTM Nativní elektroforézy Chromatografické Separace Vícerozměrné separace Membránové proteiny Proteinové čipy Klinická proteomika..

2 A CO POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE?

3 RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ FOSFÁTOVÝCH SKUPIN

4 BIOTINYLACE A AFINITNÍ IZOLACE FOSFOPEPTIDŮ

5 IMOBILIZOVANÁ METAL-AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE

6 Detekce fosfoproteinů na gelech Kolorimetricky (metylzeleň) Fluorescenčně Pro-Q Diamond Citlivost ng PP 1 16 ng PP

7 Detekce glykoproteinů v gelech fluorescenčně: (Pro-Q Emerald 300) kolorimetricky: (GelCode) Glykoproteiny Proteiny Játra Karcinom jater

8 ANALÝZA PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ A INTERAKCÍ PROTEIN-PROTEIN Komplexozom Interaktozom Nativní vícerozměrné separace Blue native - 2D Afinitní purifikace komplexů Tandemová afinitní purifikace (TAP) Dvojhybridní systém (Two-hybrid systém) QUICK

9 NATIVNÍ CHROMATOGRAFIE - NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA- LC/MS-MS the native way...

10 Methods For separation and identification of heme binding protein complexes, we used: Metabolic labeling of MEL cells by 59 Fe-hemin Anion exchange liquid chromatography Native electrophoresis in presence of Triton X100 Mass spectrometry analysis (Ion trap - LC-MS/MS)

11 Results Native electrophoretic separation of radioactive fractions A total 13 protein complexes (bands A-M) were analyzed 33 individual proteins were identified.

12 Results Hb hemoglobin Complex 1 (α, β1, β2, δ chains) Prx I peroxiredoxin I Prx II peroxiredoxin II ROS reactive oxygen species. PPI - peptidylprolyl isomerase B IAP integtrin-associated protein

13 Results Ft ferritin Prx I peroxiredoxin I Prx II peroxiredoxin II Hox heme-oxygenase ROS reactive oxygen species. Comple x 2 ATPs ATP synthase

14 Results Hb hemoglobin (α, β1, β2, δ chains) Prx I peroxiredoxin I Prx II peroxiredoxin II ROS reactive oxygen species. CA II carbonic anhydrase II MD cyt. malate dehydrogenase AAT aspartate amino transferase Complex 3 NDK nucleoside diphosphate kinase

15 Results Prx II peroxiredoxin II Prx IV peroxiredoxin IV NAC Nascent polypeptideassociated complex HSP 2 heat shock protein 2 HSP 110 heat shock protein 110 PDI protein disulfide isomerase ALAD delta aminolevulinic acid dehydratase ATPs ATP synthase Complex 4

16 BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS

17 Coomassie G250 serves as substitute for detergents binds on the surface of all membrane and most soluble proteins negative charge shift. precipitation of very hydrophobicproteins is minimized due to charge repulsion effects. Schägger, H. & von Jagow, G. (1991). Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem 199,

18 BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS AND BN-2D PAGE sample : added Coomassie brilliant blue G-250 in aminocaproic acid (0.5 M). cathode buffer: Tricine (50 mm), BisTris (15 mm), and Coomassie brilliant blue G-250 (0.02% w/v). anode buffer : BisTris (50 mm).

19 Arabidopsis thaliana mitochondrial proteome by Bluenative /SDS (Eubel et al. 2003, Plant Physiol. 133, ).

20 IMUNOAFINITNÍ IZOLACE PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ 1) matrix s protilátkou proti jedné složce komplexu 2) matrix s rekombinantním proteinem (složkou komplexu) Navázání rekombinantního proteinu s tagem na matrix Eluce specifickou endopeptidázou (trombin) štěpící v tagu Tag (lalůček, přívěšek, značka) - AA sekvence vložená do rekombinantního proteinu sloužící k detekci, zakotvení apod...

21 TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP) Anne-Claude Gavin et. al., (2002) Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature 415, ORF

22 TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP)

23 TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP) Komplexy (v průměru 7 komponent)

24 TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP)

25 QUICK SILAC+RNAi knock-down 4 classes of proteins are present in an immunoprecipitate: The target proteins specific interaction partners nonspecific binders cross-reactive proteins After knocking down expression of the protein of interest, only contaminants remain. Matthias Selbach & Matthias Mann Nature Methods, 2006

26 METODY SEPRACE BIOMOLEKUL

27 Liquid Chromatography (LC) Sample containing proteins or peptides Liquid flow Liquid flow Separation according to: -molecular weight/ size -charge -hydrophobicity -affinity 4: Time Vzorek se rozděluje mezi mobilní a stacionární (pevnou) fázi

28 KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC) Atmosférická Nízkotlaká (FPLC, MPLC) Vysokotlaká (HPLC) Klesá : objem vzorku, průtok a průměr kolony Roste: rychlost separace MATRIX : kroslinkovaný dextran (Sephadex) kroslinkovaná celulóza (Sephacel) kroslinkovaná agarosa (Sepharose) polyakrylamid (Sepahacryl) silica - kyselina ortokřemičitá

29 SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY GEL-PERMEATION, GEL-FILTRATION Částice se v porézní matrix rozdělují na základě velikosti Lze provádět za nativních podmínek! Separační rozmezí až do Da

30 ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY IONTOMĚNIČOVÁ CHROMATOGRAFIE Dělí na základě aktuálního celkového náboje Cation exchange column carries negatively charged groups Anion exchange column carries positively charged groups

31 Eluce: Gradient soli (gradient ph)

32 Funkční skupiny iontoměničů

33 REVERZNÍ FÁZE (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY) Dělení na základě odlišné hydrofobicity peptidů/proteinů Matrix: vysoce hydrofobní (C4-C18 alifatické řetězce ( -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 ) Vzorek je v hydrofilním rozpouštědle Eluce: gradientem organického rozpouštědla

34 AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE Interakce proteinu s jeho specifickým ligandem metabolit, kov, DNA, protilátka.. Eluce : ph, iontová síla, ligand.

35 AFINITNÍ MATRIX Aktivované matrix: AH Sepharose lze vázat protein za karboxyl CH Sepharose..laze vázat za aminoskupinu Matrix s afinitou pro IgG Protein G Sepharose Protein A sepharose Protein A, G magnetic beads Velké ligandy (DNA, protein) lze vázat přímo na matrix. Malé ligandy (nukleotid, NADP, hormon ) se váží přes inertní spacer arm.

36 Celková účinnost a počet kroků Yield (%) % / step Number of steps 90% / step 85% / step 80% / step 75% / step 20% overall yield!

37 VÍCEROZMĚRNÉ CHROMATOGRAFICKÉ SEPARACE Ion exchange - RP Size exclusion - ion exchange - RP Nativní ion exchange - Nativní elektroforéza - RP

38 Vícerozměrná chromatografická analýza proteomu Jon M. Jacobs, Multidimensional Proteome Analysis of Human Mammary Epithelial Cells. Journal of Proteome Research 2004, 3, 68-75

39 MudPIT (2002) Multidimensional protein identification technology 1484 proteinů identifikováno! (kvasinka - cca 5000 ORF)

40 Jak na membránové proteiny?! Až 30 % všech bílkovin!! Nízké zastoupení a vysoká hydrofobicita!

41 Strukturní proteomika 1) Prefrakcionace -1D SDS - digesce a LC-MS/MS 2) Prefrakcionace - digesce - 2D LC-MS/MS 3) Oholení peptidů z povrchu 2D LC/MS 4) povrchové značení Cy3, Cy2, Cy5 a detekce na gelech 5) povrchová biotinylace + affinitní izolace

42 Cysteiny

43 Lys The N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) ester group reacts with the e -amine of lysine. Although a -amine groups present on the N-termini of peptides react with NHS esters, a - amines on proteins are seldom accessible for conjugation.

44 Cukry Biotin Hydrazide and Biotin-LC-Hydrazide bind to oxidized carbohydrates through the hydrazide group ( NH-NH 2 ), forming a hydrazone linkage. Oxidation of glycoproteins generates reactive aldehydes that react specifically with hydrazide groups.

45 COOH Amine-PEO-Biotin The amine group can be reacted with carboxyl groups on aspartate or glutamate residues or carboxy termini. The reaction is mediated by the crosslinker EDC.

46 ??? Semi-kvantitativní proteomika membránových proteinů??? SILAC povrchová biotinylace + affinitní chromatografie digesce LC-MS/MS

47 PROTEOMICKÁ ANALÝZA POSTTRANSLAČNÍCH MODIFIKACÍ FOSFORYLACE 1) radioaktivní značení a 2D (různé izotopy) 2) biotinylace a afinitní izolace proteinů a peptidů 3) IMAC afinitní izolace izolace peptidů 4) Specifické pigmenty a protilátky

48 PROTEINOVÉ ČIPY (PROTEIN ARRAYS)

49 MATRICE PRO ZACHYCENÍ BÍLKOVIN

50 POROVNÁNÍ EXPRESE NA PROTEINOVÝCH ČIPECH

51 Global Analysis of Protein Activities Using Proteome Chips. Heng et. al., (2001) Science. 293, His-GST fusion yeast proteins : expressed and purified 6566 protein samples representing 5800 unique proteins were spotted in duplicate on a single nickelcoated microscope slide. The slide was probed with anti-gst (10).

52 Identifikace bílkovin interagujících s calmodulinem S S LEGENDA Protein na čipu Calmodulin - Ca++ protein-protein vazba PI - různé fosfolipidy, interakce lipid-protein S Biotynylovaný calmodulin Streptavidin -Cy3

53 Leukaemia-specific cell profiles (cells captured on CD antibody microarrays (Dot Scan) (A) Key; (B) T-ALL (C) AML (D) Precursor B-379 (E) B-CLL (F) FL Belov et al. (í2006) British Journal of Haematology 135 (2),

54 Hledání diagnostických biomarkerů pomocí hmotnostní spektrometrie

55 Co je to biomarker? Protein nebo peptid vykazující reprodukovatelné rozdíly v expresi či struktuře specifické pro dané onemocnění. Nejlépe ve snadno dostupné tkání či tělní tekutině.

56 Sérum Dodnes spolehlivě identifkováno přes 3020 bílkovin extrémní rozdíly v koncentracích Albumin pg/ml Interleukin 6 5 pg/ml 6 hlavních proteinů představuje cca 85% bílkoviny (Albumin, IgG, IgA, Tf, alpha-2 makroglobulin, haptoglobin) 22 hlavních představuje více než 99 % složení séra se mění při chorobných stavech

57 α2-macroglobulin IgA albumin α1-antitrypsin fibrinogen haptoglobin Tf IgG HC Apo A1 IgG LC haptoglobin chromatografické přístupy!!!

58 Sérové profilování (kombinace chromatografie a MS) profilování pomocí SELDI (Surface enhanced laser desorption ionization) profilování pomocí MALDI (Matrix assisted laser desorption ionization)

59 SELDI (Ciphergen) MALDI Magnetické kuličky (Bruker Daltonics) Sérum nebo plazma Sérum nebo plazma Odmytí nenavázaných Odmytí nenavázaných Eluce navázaných Překrytí matricí TOF MS analýza SELDI MALDI

60 Vyhledávání (nejen) nádorových markerů v séru

61 C8 Cu-IMAC WCX

62

63

64 m/z 2466

65

66 nemocní zdraví

67 Problémy s identitou? Tentýž vzorek v reflexním modu m/z 1865

68 MS/MS spektrum, peak 1865,001 peptid m/z 1865 je fragment lidského komplementu C3

69

70 Xixiong Kang et. al.

71 JCI, 116 (1) 2006

72 SELDI analýza (136 vzorků z toho 96 poztivních na BRC) Klinika A Klinika B Karsan et al. Clin Chem. 51(2005)

73 Rýžování zlata nebo přebírání odpadků? Dosud identifikované biomarkery jsou fragmenty majoritních sérových bílkovin! Fibrinopeptid A Transferin C3a, C3f,C4 fibrinogen haptoglobin alpha 1-antitrypsin transthyretin serum amyloid A Hb alpha, beta apolipoprotein A-I, A-II apod..až na vzácné výjimky

74 Co vlastně nacházíme? Fragmenty bílkovin pocházející přímo z nádoru nebo okolní tkáně (navázané na nosič?) Fragmenty vzniklé štěpením sérových proteinů nádorovými proteázami (navázané na nosič? Nebo vzniklé ex-vivo?)

75 Afinitní mechanismy deplece majoritních proteinů Top6 MARS imunodeplece (albumin, transferrin, haptoglobin,antitrypsin, IgG, IgA) Cibacron Blue (albumin) Protein A, protein G (IgG, IgA)

76

77 KOLIK STOJÍ PROTEOMICKÁ LABORATOŘ? Izoelektrická fokusace: Kč Vertikální elektroforéza, zdroj a chlazení: Kč Software pro 2D analýzu : Kč Minimální investice: Kč Hmotnostní spektrometr (TOF) Kč Hmotnostní spektrometr (TOF-TOF) Kč Laserový scanner/p-imager Kč Stripy Kč/ks Akrylamid gel (pre-cast) Kč/ks Barveni CCBB Kč/gel Sypro Ruby Kč/gel DIGE.2000 Kč/gel

78 PUBLISH OR PERISH.. Počet publikací s proteomickou tématikou (Medline) Molecular and Cellular Proteomics (IF 9,8) Journal of Proteome Research ( IF 6.9) Proteomics (IF 6.0 ) Electrophoresis (IF 3,7) BBA Proteins and proteomics (IF 2,9) Expert Review of Proteomics (IF 1,5)

79 HUPO HUman Proteome Organization ( US HUPO ( Proteomická sekce ČSBMB ( česká proteomická konference!!!)

80 Prezentace z přednášek budou ke stažení na adrese: včetne pdf souborů s doporučenou literaturou