Co je proteomika? Proteom? Protein? Experimentální strategie proteomiky Vlastnosti AMK a proteinů

Co je proteomika? Proteom? Protein? Experimentální strategie proteomiky Vlastnosti AMK a proteinů METODY PRÁCE S PROTEINY dezintegrace, lyzace, frakcionace detergenty srážení, precipitace, denaturace koncentrace, filtrace stanovení koncentrace značení bílkovin separace proteinů

Precipitace bílkovin Precipitace bílkovin Snížení solvatačního potenciálu rozpouštědla vedoucí k tvorbě precipitátu Rozpustnost proteinu je výsledkem: polárních interakcí s vodným rozpouštědlem iontových interakcí s přítomnými solemi odpudivých elektrostatických sil mezi shodně nabitými molekulami Rozpustnost proteinu závisí na: struktuře proteinu ph, I a typu soli, T struktuře vody v solvatačním obalu Precipitace je POTENCIÁLNĚ spojena s DENATURACÍ! Precipitace v praxi : Nízkou iontovou silou Vysolováním (salting-out) Organickými rozpouštědly

SALTING-OUT - VYSOLOVÁNÍ Jednotlivé soli se liší schopností precipitovat/denaturovat proteiny Franz Hofmeister (1850-1922). Precipitace Denaturace Stabilita proteinu Precipitace Denaturace Stabilita proteinu

[CH 6 N 3 ] +. Precipitace Denaturace Stabilita proteinu Precipitace Denaturace Stabilita proteinu Precipitace síranem amonným Denaturace guanidinium thiokyanátem

PRECIPITACE ORGANICKÝMI ROZPOUŠTĚDLY Vytěsnění vody ze solvatačního obalu převáží elektrostatické a van der Waalsovy síly (přitahují se opačně nabité úseky což způsobí precipitaci) Etanol Aceton (méně denaturující, více volatilní) Mělo a by být provozováno v teplotách pod bodem mrazu (prevence denaturace malá konformační flexibilita, solvent se nedostane dovnitř molekuly) Precipitace 10 % kyselinou trichloroctovou (TCA)

Denaturace Dezintegrace terciální struktury narušením vodíkových, S-S a jiných slabých interakcí ztráta funkce proteinu výsledkem je fyzická agregace, zamotají se do sebe - pokud je I nízká, a ph daleko od pi, protein nemusí precipitovat (odpudivé síly nabitých skupin) teplotní (zvýšení pohyblivosti molekul naruší vodíkové můstky) ph (změna náboje, vnitřní odpuzování, ztráta solventu) organickým rozpouštědlem (vyvázání hydrofobních úseků rozpouštědlem, při nízkých teplotách neproniká organika dovnitř molekul a nedenaturuje je) agregace je způsobena interakcí opačně nabitých úseků na površích detergenty

Zahušťování roztoku bílkovin precipitací odpařením solventu dialýzou proti nevodnému solventu (polyvinylpyrrolidon) přidáním suché matrice přijímající vodu (Sephadex) (centrifugační) ultrafiltrací na molekulárních filtrech Filtry s definovaným filtračním rozsahem pro různé MW a pro různá rozpouštědla 100 000 30 000 10 000 5 000 3 000

Stanovení celkové koncentrace proteinu ve vzorku UV spektrofotometrie 280 nm (Trp, Tyr) UV spektrofotometrie 190-205 nm (peptidická vazba) Redukce Cu 2+ na Cu 1+ ionty Biuret, Lowry nebo BCA (kys. bicinchonová) Komplexy AA s pigmenty (CBB G250) dle Bradforda

Co je proteomika? Proteom? Protein? Experimentální strategie proteomiky Vlastnosti AMK a proteinů METODY PRÁCE S PROTEINY dezintegrace, lyzace, frakcionace detergenty srážení, precipitace, denaturace koncentrace, filtrace stanovení koncentrace značení a imobilizace bílkovin separace proteinů

ZNAČENÍ A ZAKOTVOVÁNÍ PROTEINŮ Reaktivní skupiny bílkovin sulfhydryl ( SH) primární amin ( NH2) karboxyl ( COOH) karbonyl sacharidu ( CHO)

SH- Cys Maleimid

SH- Cys Iodacetyl

NH 2 - N, epsilon aminoskupina Lys N-hydroxysuccinimid

COOH- C, Asp. Glu Protein -COOH + Crosslinker EDC

Cukry hydrazid Biotin Hydrazide bind to oxidized carbohydrates through the hydrazide group ( NH-NH 2 ), forming a hydrazone linkage. Oxidation of glycoproteins generates reactive aldehydes that react specifically with hydrazide groups.

Liquid Chromatography (LC) Sample containing proteins or peptides Liquid flow Liquid flow Separation according to: -molecular weight/ size -charge -hydrophobicity -affinity Time 1 2 3 4 5 Vzorek se rozděluje mezi mobilní a stacionární (pevnou) fázi

METODY Chromatografické SEPRACE BIOMOLEKUL VELIKOST AKTUÁLNÍ NÁBOJ Gelová filtrace (Size-exclusion chromatography) Iontoměničová chromatografie (Ion exchange chromatography) SPECIFICKÉ INTERAKCE Afinitní chromatografie (Affinity chromatography) HYDROFOBICITA HYDROFILNOST Chromatografie v reverzní fázi (Reverse phase chromatography) Chromatografie hydrofilních interakcí (Hydrophilic interaction LC)

KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC) Atmosférická Nízkotlaká (FPLC, MPLC) Vysokotlaká (HPLC) Klesá : objem vzorku, průtok a průměr kolony Roste: rychlost separace MATRIX : kroslinkovaný dextran (Sephadex) kroslinkovaná celulóza (Sephacel) kroslinkovaná agarosa (Sepharose) polyakrylamid (Sepahacryl) silica - kyselina ortokřemičitá polystyren a jiné synt. polymery

GELOVÁ FILTRACE SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY GEL-PERMEATION CHROMATOGRAPHY Částice se v porézní matrix rozdělují na základě velikosti Lze provádět za nativních podmínek! Separační rozmezí až do 1000-2 000 000 Da Vhodná pro proteiny.

ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY IONTOMĚNIČOVÁ CHROMATOGRAFIE Dělí na základě aktuálního celkového náboje + - Anex je pozitivně nabitý Katex je negativně nabitý

Funkční skupiny iontoměničů

ANEX KATEX - + +++ (DEAE) - - - (CM) ELUCE: Zvýšená iontová síla = snížení ES interakcí Změna ph = chromatofokusace ELUCE: Zvýšená iontová síla = snížení ES interakcí Změna ph = chromatofokusace +++ (DEAE) - - - (CM) - +

AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE Interakce proteinu s jeho specifickým ligandem metabolit, kov, DNA, protilátka.. Eluce: ligand ph iontová síla denatuační činidlo

Aktivované matrice: NHS Sepharose lze vázat za aminoskupinu (succiimid) CNBr Sepharose..lze vázat za aminoskupinu EAH Sepharose..lze vázat protein za karboxyl (karbodiimid) Thiol sepharose lze vázat za SH cysteinu Matrice s afinitou pro IgG Protein G Sepharose Protein A sepharose Protein A, G magnetic beads AFINITNÍ MATRIX Matrice s afinitou pro glykoproteiny ConA Sepharose Velké ligandy (DNA, protein) lze vázat přímo na matrix. Malé ligandy (nukleotid, NADP, hormon ) se váží přes inertní spacer arm.

REVERZNÍ FÁZE (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY) Dělení na základě interakce s hydrofobní matricí (na základě odlišné hydrofobicity peptidů/proteinů) Matrice a ligand: vysoce hydrofobní alifatické řetězce Vzorek je v hydrofilním rozpouštědle Eluce: gradientem organického rozpouštědla

Matrice - nerozpustná, odolná organice a vysokému tlaku silica, polystyren Ligandy hydrofobní alifatické řetězce C2-C18 C18 H 3 Vhodnost: proteiny, peptidy Kompatibilita s MS!

HILIC hydrophilic interaction liquid chromatography (chromatografie hydrofilních interakcí) Dělí analyty na základě jejich schopnosti polárních interakcí Stacionární fáze polární, retenční čas roste s polaritou analytu Mobilní fáze organické rozpoštědlo, eluce zvyšující se polaritou (podílem vody a/nebo soli) Komplexní proces - Podílí se více typů interakcí a mechanismů separace Polární interakce OH peptidu s polární skupinou stacionární fáze

HILIC matrice

HPLC podle průtoku Vnitřní průměr kolony Průtok Nano HPLC 25-100 μm 24-4000 nl/min On-line MS Capillary HPLC Micro HPLC Normal HPLC 100-100 μm 1.0-2.1 mm 4.0-5.0 mm 0.4-200 μl/min 50-1000 μl/min 1.0-10.0 ml/min

HPLC Macrotrap Zip-Tips

Komplexita proteomu Kolik je proteinů? ~20 600 lidských genů? mrna? x 4-6 variant??? Proteinů??? Kódující gen mrna mrna mrna mrna mrna JAK JE DEFINOVÁN PROTEIN? GENOCENTRICKÝ vs. PROTEOCENTRICKÝ POHLED PROTEIN a PROTEOFORMA

Jaká je koncentrace jednotlivých proteinů a dynamický rozsah? V savčí buňce: 1-10 000 000 kopií/buňku (10 8 ) V séru/plazmě: pg/ml až mg/ml (10 10 )

KLASICKÁ STRATEGIE PROTEOMICKÝ EXPERIMENT Štěpení všech bílkovin (trypsin) Separace směsi BÍLKOVIN Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace Separace směsi PEPTIDŮ Štěpení vybraných bílkovin + čištění peptidů Měření přesné hmotnosti peptidů ( a jejich fragmentů) Získání hmotnostních spekter SHOT-GUN STRATEGIE Porovnání hmotností sady peptidů (jejich fragmentů) s údaji o všech dostupných ORFs v databázích Identifikace bílkovin (+ kvantifikace)

KLASICKÁ STRATEGIE 2-DE-MS (proteiny) SHOT-GUN STRATEGIE 2D-LC-MS IEF-LC-MS (peptidy)

SEPARAČNÍ METODY chromatografie elektroforézy 2-DE příprava vzorků izoelektrická fokusace ekvilibrace SDS-PAGE detekce bílkovin a DIGE zpracování dat a vyhodnocení digesce vzorku a extrakce peptidů limty a záludnosti 2-DE

Liquid Chromatography (LC) Sample containing proteins or peptides Liquid flow Liquid flow Separation according to: -molecular weight/ size -charge -hydrophobicity -affinity Time 1 2 3 4 5 Vzorek se rozděluje mezi mobilní a stacionární (pevnou) fázi

METODY Chromatografické SEPRACE BIOMOLEKUL VELIKOST AKTUÁLNÍ NÁBOJ Gelová filtrace (Size-exclusion chromatography) Iontoměničová chromatografie (Ion exchange chromatography) SPECIFICKÉ INTERAKCE Afinitní chromatografie (Affinity chromatography) HYDROFOBICITA HYDROFILNOST Chromatografie v reverzní fázi (Reverse phase chromatography) Chromatografie hydrofilních interakcí (Hydrophilic interaction LC)

KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC) Atmosférická Nízkotlaká (FPLC, MPLC) Vysokotlaká (HPLC) Klesá : objem vzorku, průtok a průměr kolony Roste: rychlost separace MATRIX : kroslinkovaný dextran (Sephadex) kroslinkovaná celulóza (Sephacel) kroslinkovaná agarosa (Sepharose) polyakrylamid (Sepahacryl) silica - kyselina ortokřemičitá polystyren a jiné synt. polymery

GELOVÁ FILTRACE SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY GEL-PERMEATION CHROMATOGRAPHY Částice se v porézní matrix rozdělují na základě velikosti Lze provádět za nativních podmínek! Separační rozmezí až do 1000-2 000 000 Da Vhodná pro proteiny.

ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY IONTOMĚNIČOVÁ CHROMATOGRAFIE Dělí na základě aktuálního celkového náboje + - Anex je pozitivně nabitý Katex je negativně nabitý

Funkční skupiny iontoměničů

ANEX KATEX - + +++ (DEAE) - - - (CM) ELUCE: Zvýšená iontová síla = snížení ES interakcí Změna ph = chromatofokusace ELUCE: Zvýšená iontová síla = snížení ES interakcí Změna ph = chromatofokusace +++ (DEAE) - - - (CM) - +

AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE Interakce proteinu s jeho specifickým ligandem metabolit, kov, DNA, protilátka.. Eluce: ligand ph iontová síla denatuační činidlo

Aktivované matrice: NHS Sepharose lze vázat za aminoskupinu (NHsucciimid) CNBr Sepharose..lze vázat za aminoskupinu EAH Sepharose..lze vázat protein za karboxyl (karbodiimid) Thiol sepharose lze vázat za SH cysteinu Matrice s afinitou pro IgG Protein G Sepharose Protein A sepharose Protein A, G magnetic beads AFINITNÍ MATRIX Matrice s afinitou pro glykoproteiny ConA Sepharose Velké ligandy (DNA, protein) lze vázat přímo na matrix. Malé ligandy (nukleotid, NADP, hormon ) možnost vazby přes inertní spacer arm.

REVERZNÍ FÁZE (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY) Dělení na základě interakce s hydrofobní matricí (na základě odlišné hydrofobicity peptidů/proteinů) Matrice - nerozpustná, odolná organice a vysokému tlaku silica, polystyren Ligandy hydrofobní alifatické řetězce C2-C18 C18 H 3 Vhodnost: proteiny, peptidy Kompatibilita s MS!

REVERZNÍ FÁZE (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY) Dělení na základě interakce s hydrofobní matricí (na základě odlišné hydrofobicity peptidů/proteinů) Matrice a ligand: vysoce hydrofobní alifatické řetězce Vzorek je v hydrofilním rozpouštědle Eluce: gradientem organického rozpouštědla

HILIC hydrophilic interaction liquid chromatography (chromatografie hydrofilních interakcí) Dělí analyty na základě jejich schopnosti polárních interakcí Stacionární fáze polární, retenční čas roste s polaritou analytu Mobilní fáze organické rozpoštědlo, eluce zvyšující se polaritou (podílem vody a/nebo soli) Komplexní proces - Podílí se více typů interakcí a mechanismů separace Polární interakce OH peptidu s polární skupinou stacionární fáze

HILIC matrice

HPLC podle průtoku Vnitřní průměr kolony Průtok Nano HPLC 25-100 μm 24-4000 nl/min On-line MS Capillary HPLC Micro HPLC Normal HPLC 100-100 μm 1.0-2.1 mm 4.0-5.0 mm 0.4-200 μl/min 50-1000 μl/min 1.0-10.0 ml/min

HPLC Macrotrap Zip-Tips