Praktické využití serologických metod Daniel Sperling 21.3. 2014 Hotel Myslivna, Brno
Využití sérologie v diagnostice infekčních onemocnění prasat sérologie je vědecká disciplína zaměřená na detekci protilátek v tělních tekutinách- nikde v této definici nenajdete spojení protektivní imunita Dr. Ian Tizzard Využití: Detekce protilátek (IgG, IgM), dynamika humorální odpovědi s cílem demonstrovat infekci (expozici) specifickým antigenem Serologické testy detekují protilátky, není možno stanovit buňkami zprostředkovanou imunitu Levné, standardizované postupy s rychlým výsledkem Problematické využití jako metody definitivní diagnostiky (veterinární využití ASF, humánní medicína HIV)
Praktické využití sérologie Serologický monitoring chovného stáda, nákup chovných zvířat, zařazení do chovu Ověření infekčního statusu v rámci farmy (incidence patogenů na úrovni jednotlivých kategorií zvířat) Monitoring úrovně hladiny protilátekpasivní imunita, načasování vakcinace, imunitní okno Zdravotní programy, monitoring úspěšnosti eradikačních programů, systém test and removal Ověření vakcinace
Odběr vzorků Kvalita a uchování vzorků Sterilní odběr, bakteriální kontaminace, uchování při 4 C (max. 7 dnů) Delší uchování- využití vysráženého sera a následné zamražení Optimální počet vzorků Odběr reprezentativního množství vzorků, při vysoké míře spolehlivosti výsledku: confidence value (95%) - hodnota konfidenčního intervalu spolehlivosti daného testu Obecné pravidlo Počet testovaných vzorků by měl se spolehlivostí minimálně 95% detekovat časnou infekci s nízkou prevalencí (ø 10% prevalence) Obecně zhruba 30 odebraných vzorků zajištuje detekci při 10% prevalenci při 95% jistotě
Výpočet dle aktuálních parametrů n= [1- (1-a)1/D] x [N- (D-1)1/2] n nutný počet vzorků a - confidence value- hodnota spolehlivosti daného testu N množství všech zvířat v dané skupině (věk, sekce...) D množství pravděpodobně pozitivních zvířat prevalence Praktický příklad aplikace výpočtu Stádo 5000 prasnic, nízká serologická prevalence endemická infekce App zhruba 10%, předpoklad 500 pozitivních prasnic ve stádě Po dosazení a kalkulaci 47 náhodně vybraných prasnic je třeba odebrat a vyšetřit Při pozitivním záchytu je farma považována za infikovanou, v případě negativního výsledku je z 95% jistotou negativní
Počet vzorků ve vztahu k prevalenci a confidencí 95% (Segales et al., 2013)
Vývoj humorální imunitní odpovědi Fáze virémie bakteriémie Vývoj IgG doprovázený odstraněním patogenu z cirkulace Charakter vývoje jednotlivých typů Ig (stimulace antigenem- vakcinace, nebo infekce) Zdroj:UTEXAS Edu
Dynamika onemocnění Aplikace vývoje onemocnění (fází infekčního procesu) na diagnostiku- kombinace serologických metod s přímým průkazem patogenu Prof. José M. Sánchez- Vizcaíno OIE
Charakteristika testu (ELIZA)- důležité parametry testu Diagnostická citlivost (sensitivita) schopnost testu korektně určit infikované zvířata jako pozitivní s minimem falešně negativních Analytická citlivost- minimální množství Ig detekovatelné danou metodou Diagnostická specifita- schopnost (pravděpodobnost) daného testu korektně určit negativní zvířata s minimem falešně pozitivních Analytická specifita- schopnost minimalizovat zkříženou reaktivitu daného testu
Charakteristika testu (ELIZA)- důležité parametry testu Stanovení citlivosti/specifity testu na základě referenčního testu- zlatého standartu např. Mycoplasma hyopneumoniae kultivace, virové infekce SNT Praktické hledisko- nižší hodnoty výsledku = vyšší pozitivita např. u metody blocking ELISA (testy používané na PRRS) Perfektně citlivé a specifické testy neexistují v praxi! Na individuální bázi sérologie na virové patogeny Požadavky na obě vlastnosti se liší v praxi Vysoká sensitivita dovoz do chovů SPF, import na úrovni státu- minimalizace rizika zavlečení infekce Ochrana zdraví a patogeny- Salmonella, Trichinella Vysoce specifické testy (minimalizace falešně pozitivních)- eradikace (test and removal)
M. hyopneumoniae - příklad volby serologického testu Volba vhodného testu- praktické limitace a senzitivita daného testu DAKO ELISA- proteinový epitop terénních kmenů + monoklonální Ig G Vakcíny proti M. hyo indukují pouze velmi slabou imunologickou odpověď nevhodnost pro post-vakcinační monitoring DAKO Elisa- monitoring infekčního statusu, Tween 20 Elisa monitoring/kontrola vakcinace Delší doba pro indukci specifických IgG, IgM v porovnání s dalšími respiračními infekcemi
Detekce specifických IgG Pieters M.
Praktické využití sérologie Využití predikce klinického onemocnění a jeho závažnosti na základě prevalence v době odstavu (Pijoan, 2006) M. hyopneumoniae Pieters M.
Serologie Actinobacilus pleuropneumoniae
Sérologie App Detekce Apx 4 toxinu- princip DIVA, 99.8% specificita, 80.8% sensitivita ELISA Problematika sérologie App obecně- častý status nosičství, kolonizace epitelu (lymfatická tkáň tonzil)- špatná humorální odpověď bez možnosti detekce u některých zvířat U některých infikovaných zvířat nedochází k vývoji protilátek vůbec ELISA testy jsou založené: 1. na specifickém LPS (serotypovém určení) 2. detekce společného antigenu (sérotypově nespecifická)- dobrá korelace 3. detekce toxinů (APX1 a APX2)- zde pozor na nespecifické reakce (A. suis) Konfirmace vakcinačních protilátek- problematická pokud komerční kyty nebyly již dříve validovány ne detekci post-vakcinačních protilátek!
App sérologie Počet infikovaných/sérologicky pozitivních zvířat je velmi závislý na sérotypu subklinické infekce a infekce některými vysoce virulentními sérotypy (1,5) nízká nebo žádná séro-konverze Důležitá vlastnost- korelace kontagiosita (infektivity) se schopností produkovat optimální množství Ig Sérotypy vysoce virulentní s nízkou kontagiositou (1,5) x vysoce kontagiózní (3,6,8,12)
Sérokonverze a výběr vhodných zvířat Serologický status chovu Multi-site production- pro monitoring nejlépe zvířata z finální fáze výkrmu Obdobně možno postupovat i u farow to finish uspořádání- serokonverze ovšem nastává dříve Sérokonverze po ústupu mateřských protilátek (4-8 týden) zhruba 4 týdny až 10-12 týdnů- počet infikovaných v době odstavu, typ chovu Typická sérokonverze dle uspořádání chovu Farow to finish Multi site
Postup v případě pozitivity bez klinické manifestace onemocnění Vhodná kombinace s další diagnostickou metodou- PCR, kultivace hlubokých stěrů tonzil Přednostně zvířata označena sérologicky jako pozitivní Vyšetření tonzil x plíce bez patologického nálezu nevhodné i přes séropozitivitu daného jedince Seškrab x vyšetření celé mandle (ekonomická hodnota daného zvířete) Zejména důležité- nákup chovných zvířat v mladém věku z nedávno ozdravených chovů SPF Odběr tonzil (AASV)
Využití sérologie v diagnostice Ileitis prasat Metoda nepřímé imunofluorescence (IFAT), ELIZA Vysoká senzitivita (přibližně 90 %) a specifita (téměř 100 %) Sérokonverze 2 týdny po infekci, IgG přetrvávají od 3-13, typ infekce (PHE nebo PIA) Vyšší a déle přetrvávající titry protilátek jsou zjišťovány především u PHE formy infekce U prasat s chronickou formou infekce L. intracellularis jsou titry většinou nízké (1: 30) a jsou zjistitelné pouze několik týdnů Seroprofil- inherentní variabilita, všechny vzorky nutno vyšetřit najednou
% sero-positive 100 80 60 40 20 0 Typ farmy- farow to finish (přítomnost reprodukce a výkrmu, kontinuální systém chovu, příklad využití stanovení serologického profilu, semikvantitativní stanovení Imunofluorescencí
Séro-profil- Lawsonia Multi-site produkce, oddělená reprodukce od produkčních jednotek, pozdní typ nástupu infekce po naskladnění do výkrmu
Děkuji za pozornost!