Diagnostické možnosti alergie na jablko a mrkev u pacientů s projevy orálního alergického syndromu Diagnostic options of allergy to apple and carrot in patients with oral allergy syndrome IVANA ŠETINOVÁ, MARIE HAVRANOVÁ, EVA DAŇKOVÁ, STANISLAVA HONZOVÁ, MARTINA HEROLDOVÁ 1, PETR KUČERA 1, MILAN HOUŠKA, JAN STROHALM Imumed, Imunologické centrum, Synlab.cz s. r. o. Praha 1 Oddělení alergologie a klinické imunologie, FN Královské Vinohrady a 3. LF UK Praha Výzkumný ústav potravinářský, Praha SOUHRN Cílem naší práce bylo srovnat diagnostickou hodnotu kožních prick testů (SPT), testu aktivace basofilů (BAT) a specifického IgE (sige) u břízových alergiků s projevy orálního alergického syndromu (OAS) na jablko a mrkev a současně zjistit odpovědné alergeny za projevy zkřížené alergie. Vysoká senzitivita byla zaznamenána v SPT s čerstvým jablkem a mrkví a v BAT s homogenátem jablka a mrkve (1,). SPT a BAT s komerčními extrakty jablka a mrkve prokázaly nízkou senzitivitu (senzitivita pro jablko,53, pro mrkev,71 v SPT, senzitivita BAT pro jablko,1, pro mrkev,71). U obou skupin byla zaznamenána vysoká senzitivita při stanovení sige na alergeny jablka (1,) a mrkve (,9). Potvrdili jsme vysokou prevalenci zkřížené alergie u břízových alergiků prostřednictvím hlavních alergenů Mal d 1 a Dau c 1 udávanou pro země střední Evropy. Klíčová slova: orální alergický syndrom(oas), kožní test, specifické IgE, test aktivace basofilů, rekombinantní alergeny SUMMARY The aim of the study was to examine the diagnostic value of skin prick test (SPT), specific IgE (sige) and basophil activation test (BAT) in birchallergic patients with history of oral allergy syndrome to apple and carrot. The highest senzitivity showed the SPT and the BAT with fresh apple and carrot (1, for both). The SPT and the BAT with commercial extracts of apple and carrot showed low sensitivity (sensitivity of SPT for apple was,53 and,71 for carrot, sensitivity of BAT for apple was,1 and,71 for carrot). The high sensitivity of sige of apple (1,) and carrot (,9) showed good diagnostic value in both groups. We determined the high prevalence of cross-reactivity in birch allergic patients to main allergens Mal d 1 and Dau c 1, which corresponds to results in previous studies for middle Europe. Key words: oral allergy syndrome(oas), skin prick test, specific IgE, the basophil activation test, recombinant allergens Úvod Pacienti s alergií na pyl břízy velmi často udávají projevy alergického orálního syndromu po požití čerstvého ovoce či zeleniny vlivem zkřížené reaktivity alergenů. Mezi projevy orálního alergického syndromu řadíme svědění a otok rtů, sliznice dutiny ústní a měkkého patra po požití čerstvého ovoce a zeleniny. Nejčastější příčinou je zkřížená reaktivita mezi hlavním alergenem břízy Bet v1 a homologními alergeny ovoce či zeleniny. U jablka se jedná o alergen Mal d 1, u mrkve o alergen Dau c 1. Mezi těmito alergeny existuje významná homologie na molekulární úrovni a specifické IgE protilátky vytvořené proti Bet v1 mohou reagovat také s Mal d 1 či Dau c 1. Aminokyselinová sekvence Mal d 1 je z 55 % identická s alergenem Bet v 1 (9). Předpokládá se, že Bet v 1 senzibilizace iniciuje alergickou reakci s Mal d 1 (9). V literatuře je uváděno, že ve střední a severní Evropě více než Alergie /7 37
75 % břízových alergiků s projevy OAS je senzibilizováno na jablko (,7). Více než 9 % alergiků na jablko reaguje zkříženě prostřednictvím hlavních alergenů Bet v 1- Mal d 1.V jižních státech Evropy (Itálie, Španělsko) je situace odlišná. Alergie na jablko má mnohem závažnější průběh a je publikováno, že až u 3 % je provázena systémovou reakcí (7,). Předpokládá se, že k senzibilizaci dochází primárně při požití potravy a to vlivem termostabilního alergenu lipid transfer proteinu (LTP Mal d 3) bez projevů zkřížené pylové alergie (7,). Dalším alergenem, který je schopen vyvolat projevy alergické reakce na základě zkřížené reaktivity alergenů je profilin Bet v, který je homologní s vedlejším alergenem jablka Mal d a vedlejším alergenem mrkve Dau c. Tento typ senzibilizace se týká mnohem menšího počtu alergiků. Pouze u % břízových alergiků nacházíme pozitivitu specifického IgE na profilinový alergen Bet v a IgE zkříženou reaktivitu s ovocem a zeleninou (,). U 5 % všech potravinových alergiků ve střední Evropě se setkáváme s projevy OAS po požití čerstvé mrkve (3). 9 % těchto alergiků je senzibilizováno prostřednictvím hlavního alergenu Dau c 1, 3 % pacientů reaguje pozitivně na vedlejší profilinový alergen Dau c, u % mrkvových alergiků byla zaznamenána pozitivita sige pro zkříženě reagující determinanty (CCD) (3,). Přítomnost lipid transfer proteinu v alergenu mrkve nebyla zatím jednoznačně potvrzena (3,). Diagnostické metody in vivo a in vitro testů při diagnostice zkřížené potravinové alergie jsou známy nízkou senzitivitou a specifitou. Zlatým standardem potravinové alergie zůstává stále dvojitě slepý placebem kontrolovaný expoziční test. Cílem naší práce bylo srovnat diagnostickou hodnotu kožních testů, testu aktivace basofilů a specifického IgE u břízových alergiků s projevy OAS na jablko a mrkev. Zároveň využitím component-resolved diagnostiky pomocí dostupných rekombinantních alergenů se pokusit zjistit odpovědné alergeny za projevy zkřížené alergie u našich jarních polinotiků. Metodika 1. skupinu pacientů tvořilo břízových alergiků (věk 55 let, 5 mužů/11 žen) s klinickými projevy pylové alergie v jarních měsících, pozitivitou kožního prick testu s pylem břízy a s udanými anamnestickými projevy orálního alergického syndromu na jablko.. skupinu tvořilo břízových alergiků (věk 17 5 let, 5 mužů/11 žen) s klinickými projevy pylové alergie v jarních měsících, pozitivitou kožního prick testu s pylem břízy a s udanými anamnestickými projevy orálního alergického syndromu na mrkev. 3. kontrolní skupinu tvořilo nealergických pacientů ( let, muži/ žen) s negativní rodinnou a osobní anamnezou ve smyslu atopie. Vyšetření Kožní prick test ( SPT ) Byly provedeny testovací komerční soupravou Alyostal fy Stallergenes s extraktem pylu břízy, jablka a mrkve. Dále byly provedeny kožní prick to prick testy s čerstvým jablkem Golden Delicius a čerstvou mrkví a zároveň prick to prick testy se zhotoveným zmraženým homogenátem jablka Golden Delicius a zmraženým homogenátem mrkve, odrůda Romosa. Za pozitivní reakci byl hodnocen pupen o průměru 3 mm a více při srovnání s negativní kontrolou. Stanovení sige Specifické IgE (sige) na alergen jablka, mrkve a rekombinantní alergeny rbet v 1, rbet v bylo stanoveno na přístroji UniCAP (Phadia). Jako pozitivní byla považována hodnota nad,35 U/ ml. Test aktivace basofilů (BAT) Vyšetření bylo prováděno z plné krve odebrané do heparinu. Na 1 test bylo třeba µl krve. Pro každého pacienta byla stanovena negativní kontrola (bez stimulace) a pozitivní kontrola (stimulace, µg anti-ige). Stimulace buněk byla provedena buď ředěným alergenem jablka a mrkve Alyostal (Stallergenes), dále s vyrobeným homogenátem jablka a mrkve (Výzkumný ústav potravinářský) a s rekombinantními alergeny rbet v 1, rbet v, rmal d 1, rdau c 1 ( µl,1mg/ml, Biomay) vždy ve čtyřech ředěních. Detekce basofilů byla prováděna pomocí monoklonální protilátky anti-cd3c/pe (Beckmann-Coulter). Aktivace byla detekována protilátkou anti-cd3/fitc (Exbio). Měření bylo prováděno na průtokovém cytometru FC 5 (Beckmann Coulter). Pro každý vzorek byla provedena detekce nejméně 5 basofilů a na tomto množství i sledována exprese aktivačního znaku CD3. Jako pozitivní výsledek byla považována aktivace více než 15 % basofilů (> 15 % CD3+CD3+). Laboratorní postup a interpretace výsledků testu aktivace basofilů viz Patentový spis (). Mražený homogenát jablka a mrkve (Výzkumný ústav potravinářský) Jablka, odrůda Golden Delicious, byla dodána z chladírny s řízenou atmosférou skladu Tuchoraz. Jablka vychlazená v lednici na teplotu 5, C, byla omyta studenou vodou, vykrájena, naosminkována a lisována dřeňová šťáva na odšťavňovači Champion, smíchána s odpovídajícím množstvím výlisků a mixována ponorným mixerem, cezena, naplněna do sáčků z folie AL/PE a mražena.v průběhu zpracování nepřestoupila teplota vzorků 1 C, konečné ph = 3, a refrakce, %. Mrkev, odrůda Romosa, sklizená v r. a vypěstované firmou Lesolk-Rosatec (u Havlíčkova Brodu) vychlazená v lednici na teplotu 5, C, byla omyta, nakrájena a připraven mražený homogenát stejným způsobem jako u jablka. Statistická analýza Výpočet senzitivity byl proveden metodou dle Goldmana. 3 Alergie /7
Výsledky V 1. skupině pacientů s projevy OAS po jablku všech pacientů reagovalo pozitivně v kožním testu s komerčním extraktem břízy, % pacientů (tzn. /) zareagovalo pozitivně v kožním prick to prick testu s čerstvým jablkem Golden Delicious. Pouze 1 % pacientů (3/) reagovalo pozitivně v kožním testu s komerčním extraktem jablka Alyostal. Se zhotoveným mraženým homogenátem jablka reagovalo % pacientů (11/). Všichni pacienti tzn. % (/) měli pozitivitu sige na alergen břízy. U 93 % pacientů (15/) byla zjištěna zvýšená hodnota sige na alergen jablka. % pacientů (/) mělo pozitivitu sige na hlavní alergen Bet v 1, u % pacientů (1/) byla zachycena pozitivita sige na vedlejší profilinový alergen Bet v. V testu aktivace basofilů reagovalo pouze % pacientů (1/) s komerčním extraktem jablka, % pacientů (/) reagovalo se zhotoveným jablečným homogenátem a zárověň s rekombinantním alergenem rbet v 1. % pacientů (1/) s rbet v. S rekombinantním hlavním alergenem jablka rmal d 1 v BAT reagovalo všech % pacientů (/) v neředěné formě (graf 1). Postupným ředěním alergenu počet reagujících pacientů klesal (graf 3). Po et pozitivních pacient 1 1 Diagnostická metoda SPT komer ní extrakt jablko SPT homogenát jablko SPT erstvé jablko BAT komer ní extrakt jablko BAT homogenát jablko BAT 1rBet v 1 1 11 BAT rmal d 1 BAT rbet v sige jablko sige Bet v 1 sige Bet v Graf 1: Výsledky SPT, sige a BAT u pacientů s projevy OAS na jablko po et pozitivních pacient 1 1 Pozitivita BAT rmal d 1 v závislosti na ed ní koncetrace rmal d 1 15 1 1 Graf 3: Pozitivita BAT s rmal d 1 v závislosti na ředění rmal d1 5mg/ml rmal d 1 5mg/ml rmal d1 5mg/ml rmal d1 mg/ml Ve. skupině pacientů s projevy OAS po mrkvi všichni pacienti reagovali pozitivně v kožním prick testu s pylem břízy. % pacientů (/) mělo pozitivní reakci s čerstvou mrkví v prick to prick testu i s mraženým homogenátem mrkve. 37% pacientů (/) reagovalo pozitivně v kožním prick testu s komerčním extraktem mrkve Alyostal. Pozitivita sige na alergen břízy byla zjištěna u všech pacientů. Pozitivita sige na alergen mrkve byla zachycena u 93 % pacientů (15/), na hlavní alergen Bet v 1 u 93 % pacientů (15/) %. 1 % pacientů (3/) mělo pozitivitu sige na vedlejší alergen Bet v. V testu aktivace basofilů reagovalo 3 % pacientů (7/) pozitivně s komerčním extraktem mrkve, % pacientů (/) se zhotoveným homogenátem mrkve. % pacientů (/) reagovalo pozitivně s rekombinantním alergenem rbet v 1, 1 % pacientů (/) pozitivně s rbet v. S hlavním alergenem rdau c 1 reagovalo pozitivně 7 % pacientů (/) v testu aktivace basofilů v nejvyšší koncentraci (graf ). Postupným ředěním alergenu počet reagujících pacientů klesal (graf ). V kontrolní skupině pacientů nebyla zaznamenána pozitivní reakce v kožních testech ani při stanovení sige a v testu aktivace basofilů s jednotlivými vyšetřovanými alergeny. 1 7 Po et pozitivních pacient 1 SPT komer ní extrakt mrkev SPT homogenát mrkev SPT erstvá mrkev BAT komer ní extrakt mrkev BAT homogenát mrkev BAT rdau c 1 BAT rbet v 1 BAT r Bet v sige mrkev sige Bet v 1 sige Bet v po et pozitivních pacient 1 rdau c1 11 5mg/ml 7 rdau c1 mg/ml rdau c1 5mg/ml rdau c1 5mg/ml Diagnostická metoda Graf : Výsledky SPT, sige a BAT u pacientů s projevy OAS na mrkev koncentrace rdau c 1 Graf : Pozitivita BAT s rdau c 1 v závislosti na ředění Alergie /7 39
Kožní prick testy a test aktivace basofilů s komerčními extrakty jablka a mrkve prokázaly nízkou senzitivitu (senzitivita pro jablko,53, pro mrkev,71 v kožním prick testu, senzitivita BAT pro jablko,1, pro mrkev,71). Vysoká senzitivita byla zaznamenána v kožním prick to prick testu s čerstvým jablkem a mrkví a také v testu aktivace basofilů se zhotoveným homogenátem jablka a mrkve (1,), zároveň spolu s vyšetřením sige na alergen jablka (1,) a na alergen mrkve (,9) (tab. 1). Tabulka č. 1 Senzitivita SPT a BAT s extrakty jablka a mrkve extrakt jablko mrkev SPT BAT SPT BAT Stallergenes,53,1,71,71 čerstvá potravina 1 1 homogenát, 1 1 1 Diskuse Naše výsledky potvrzují nízkou výpovědní hodnotu (senzitivitu) kožních prick testů s komerčními extrakty jablka a mrkve, tak jak je udáváno v literatuře (3) vlivem lability alergenů Mal d 1 a Dau c 1. Zhotovený zmražený homogenát jablka prokázal větší labilitu s nižší pozitivitou v kožním prick to prick testu než mražený homogenát mrkve.v testu aktivace basofilů byla reakce se zhotoveným homogenátem jablka vyšší oproti kožním testům. Diskrepanci v odpovědi je možno vysvětlit tvorbou hydrogelu, který vzniká při nízkém ph z pektinu a který je přítomný v potravinách (větší obsah v jablku než mrkvi). S tím souvisí zvýšení viskozity homogenátu. Důsledkem toho může být horší průnik alergenních složek do podkoží (13). Homogenát před použitím v BAT byl centrifugován a použit k aktivaci pouze supernatant. Při rozboru jednotlivých alergenů, které se podílejí na projevech zkřížené potravinové alergie ve skupině jablkových alergiků, všichni pacienti reagovali pozitivně na hlavní alergen břízy Bet v 1 jak v testu aktivace basofilů tak při stanovení sige. Pouze 1 pacient, který byl v obou testech pozitivní, reagoval současně i na vedlejší profilinový alergen Bet v. U tohoto pacienta byly zaznamenány projevy OAS i po dalším ovoci a zelenině. Všichni pacienti v testu aktivace basofilů byli pozitivní na hlavní alergen jablka Mal d 1. Naše výsledky souhlasí s udávanou vysokou prevalencí zkřížené potravinové alergie u jablka přes hlavní alergeny Bet v 1 a Mal d 1 v zemích střední Evropy (více než 9 %). Ve. skupině mrkvových alergiků reagovalo všech pacientů v BAT s hlavním břízovým alergenem rbet v 1, pacienti s vedlejším alergenem rbet v. Při stanovení sige 15 pacientů bylo pozitivních na hlavní alergen Bet v 1, 3 pacienti byli pozitivní na vedlejší alergen Bet v. 13 pacientů reagovalo pozitivně v testu aktivace basofilů s hlavním alergenem mrkve Dau c 1, z nich u dvou byla pozitivita i na vedlejší alergen Bet v. U 3 pacientů, kteří nereagovali na hlavní alergen Dau c 1 byla u jednoho pacienta zjištěna pozitivita pouze na profilinový alergen Bet v (v BAT i sige). Zkřížená potravinová alergie s projevy OAS u tohoto pacienta bude pravděpodobně prostřednictvím tohoto vedlejšího alergenu. U zbylých dvou pacientů, kteří nereagovali pozitivně na hlavní alergen Dau c 1, ale pozitivně na hlavní alergen Bet v 1 (a zároveň negativně na Bet v ) se může jednat o projevy zkřížené alergie prostřednictvím jiné isoformy hlavního alergenu mrkve Dau c 1 (3) event. prostřednictvím zkříženě reagujících determinant (CCD). Klinická relevance CCD v alergenu mrkve nebyla zatím jednoznačně potvrzena (3,). Závěr Kožní prick testy s komerčním extraktem jablka a mrkve prokázaly nízkou senzitivitu. Byla prokázána vyšší senzitivita kožních prick to prick testů s čerstvým jablkem a mrkví a testu aktivace basofilů se zhotovenými homogenáty jablka a mrkve. V obou skupinách byla zaznamenána vysoká senzitivita při stanovení sige na alergeny jablka a mrkve, výsledky testu aktivace basofilů ve srovnání se stanovením sige na alergeny Bet v 1 a Bet v nebyly významně odlišné. Potvrdili jsme vysokou prevalenci zkřížené potravinové alergie u našich břízových alergiků prostřednictvím hlavních alergenů Mal d 1 a Dau c 1, která je udávaná pro země střední Evropy (). Přesné určení alergenu, který je zodpovědný za projevy zkřížené potravinové alergie odhalí individuální profil alergika a může pomoci v dalších dietních doporučeních. Podpořeno v rámci výzkumného projektu MŠMT B139 Inaktivace alergenů v potravinách pomocí vysokotlaké pasterizace. MUDr. Ivana Šetinová Imumed s. r. o Mlynářská 1 Praha 1 LITERATURA 1. Asero R. Plant food allergies: a suggested approach to allergen-resolved diagnosis in the clinical practice by identifying easily available sensitization markers. Int Arch Allergy Immunol 5;13:1-11.. Asero R, Mistrello G, Roncarolo D, Amato S et al. Detection of clinical markers of sensitization to profilin in patients allergic to plant-derived foods. J Allergy Clin Immunol 3;11:7-3. 3. Ballmer-Weber B.K,Wangorsch A,Bohle B, Kaul S et al.component-resolved in vitro diagnosis in carrot allergy: Does the use of recombinant carrot allergens improve the reliability of the diagnostic procedure? Clin Exp Allergy 5;35:97-97.. Ballmer-Weber B.K, Wüthrich B, Wangorsch A, Fötisch K et al. Carrot allergy: double blinded, placebo controlled food chalenge and identification of allergens. J Allergy Clin Immunol 1;:31-37. 3 Alergie /7
5. Bohle B, Zwölfer B, Heratizadeh A, Jahn-schmid B et al. Cooking birch pollen-related food: Divergent consequences for IgE- and T cell-mediated reactivity in vitro and in vivo. J Allergy Clin Immunol ;11:-9.. Fernández-Rivas M, Bolhaar S, González-Mancebo E, Asero R. et al. Apple allergy across Europe: How allergen senzitization profiles determine the clinical expression of allergies to plant foods. J Allergy Clin Immunol ;11:1-. 7. Ferrer A, Carbes J, Gallego T, Andréu C et al. Characterization and improvement of apple extracts for the diagnosis of apple IgE-mediated allergy. Ann Allergy Asthma Immunol 5; 95:-7.. Havranová M. Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit. Patentový spis. Věstník č./3 9. Ma Y, Gadermaier G, Bohle B, Bolhaar S et al. Mutational analysis of amino acid positions crucial for IgE-binding epitopes of the major apple(malus domestica) allergen, Mal d 1. Int Arch Allergy Immunol ;139:53-. Ma Y,Zuidmeer L,Bohle B,Bolhaar S.TH. et al.characterization of recombinant Mal d and its application for component-resolved diagnosis of apple allergy. Clin Exp Allergy ;3:7-9. 11. Mari A. Multiple pollen sensitization: a molecular approach to the diagnosis. Int Arch Allergy Immunol 1;15:57-5. 1. Osterballe M, Scheller R, Stahl Skov P, Andersen K.E. et al. Diagnostic value of scratch-chamber test, skint prick test, histmaine release and specific IgE in birch-allergic patients with oral allergy syndrome to apple. Allergy 3;5:95-953. 13. Polovic N, Blanusa M, Gavrovic-Jankulovic M, Atanaskovic- Markovic M et al. A matrix effect in pectin-rich fruits hampers digestion of alergen by pepsin in vivo and in vitro. Clin Exp Allergy 7;37:7-771.. Sancho A.I, Rigby N.M, Zuidmeer L, Asero R et al. The effect of thermal processing on the IgE reactivity of the non-specific lipid transfer protein from apple, Mal d 3. Allergy 5; :-. 15. Scheurer S. Improvment of the diagnosis of allergy by using purified allergens. Clin Exp Allergy ;3:3-.. Šetinová I, Havranová M, Honzová S. Test aktivace basofilů s využitím rekombinantních alergenů v diagnostice alergie na pyl břízy. Alergie 5;:-. 17. Zuidmeer L, Leeuwen van W.A, Budde K.I, Breiteneder H et al. Allergenicity assesment of apple cultivars: hurdles in quantifying labile fruit allergens. Int Arch Allergy Immunol ;1:3-. Alergie /7 311