LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A POSTUPY

LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A POSTUPY USNADNĚNÉ HYDRODYNAMICKÉ DÁVKOVÁNÍ VZORKU DO SEPARAČNÍ KAPILÁRY V LABORATORNÍCH ELEKTROFORETICKÝCH APARATURÁCH TEREZA KADLECOVÁ, FRANTIŠEK OPEKAR PETR TŮMA b Univerzit Krlov v Prze, Přírodovědecká fkult, ktedr nlytické chemie, Albertov 2030, 128 43 Prh 2, b Univerzit Krlov v Prze, 3. lékřská fkult, Ústv biochemie, buněčné molekulární biologie, Ruská 87, 100 00 Prh 10 opekr@ntur.cuni.cz Došlo 18.12.12, přijto 25.1.13. Klíčová slov: kpilární elektroforéz, lbortorní prtur, dávkování vzorku, hydrodynmické dávkování, poloutomtické dávkování Úvod V kplinové chromtogrfii se pro dávkování vzorku používjí dávkovcí smyčky, které umožňují opkovtelné ndávkování přesně definovného objemu vzorku n seprční kolonu. V kpilární elektroforéze (CE) je zjištění reprodukovtelného dávkování vzorku větším problémem, protože vzorek je dávkován z nádobky se vzorkem přímo n počátek seprční kpiláry. Ndávkovné množství vzorku je závislé jk n vlstnostech seprčního prostředí, tk i n mtrici vzorku. Proces dávkování se tk stává primárním zdrojem řdy potenciálních chyb. Vzhledem k mlým vnitřním průměrům elektroforetických kpilár (5 ž 100 m) 1 se ndávkovný objem vzorku do seprční kpiláry pohybuje v řádu desetin ž jednotek nnolitru. Přitom opkovtelnost ndávkování tkto mlých objemů vzorků do kpiláry je zákldním předpokldem pro správnou seprci kvntittivní nlýzu. Nejběžnější dávkovcí technikou v CE je hydrodynmické dávkování 2, u kterého je postupováno tk, že nádobk (vilk) se seprčním elektrolytem, v níž je ponořen dávkovcí konec kpiláry, je vyměněn z nádobku s roztokem vzorku. Poté je zvýšen tlk nd roztokem vzorku, přípdně snížen tlk v nádobce koncové. Po ndávkování vzorku je nádobk se vzorkem opět nhrzen nádobkou se seprčním pufrem; u komerčních přístrojů se běžně dávkuje tlkem 25 ž 100 mbr po dobu 0,5 10 s. Méně čsto je používáno elektrokinetické dávkování, u kterého je množství ndávkovného nlytu závislé n jeho mobilitě i n vodivosti použité mtrice 3. V lbortorních elektroforetických prturách, které jsou stále hojně používány v zákldním výzkumu 4 i ve školních lbortořích, je zvýšení hydrodynmického tlku v nádobce se vzorkem relizováno vesměs tk, že experimentátor zvedne n definovnou dobu dávkovcí konec kpiláry i s nádobkou se vzorkem do určité výšky oproti výstupnímu konci kpiláry v koncové elektrodové nádobce 2,5,6. Vzorek je ndávkován tlkovým rozdílem p = Δh g, kde Δh je výškový rozdíl hldin kpliny v nádobce vzorku v elektrodové nádobce s výstupním koncem kpiláry (obvykle 5 10 cm), je hustot roztoku vzorku g je grvitční zrychlení. Po ndávkování vzorku vrátí experimentátor dávkovcí konec kpiláry do zákldní polohy nádobku se vzorkem nhrdí nádobkou s elektrolytem. Celý postup dávkování je tk ovlivněn subjektivním přístupem experimentátor. V této práci je testován možnost dávkování zvýšeným tlkem nd hldinou roztoku v nádobce s roztokem vzorku generovným membránovou pumpou, přičemž dávkovcí konec kpiláry je stále ve stejné poloze. Dobu trvání zvýšeného tlku lze přesně objektivně řídit npř. vhodným počítčovým progrmem. Subjektivní přístup experimentátor je minimlizován, jeho činnost spočívá pouze ve výměně nádobek se vzorkem elektrolytem u dávkovcího konce kpiláry. Zvýšením tlku nd roztokem v dávkovcí nádobce je řešeno i promývání kpiláry mezi jednotlivými seprcemi. Jde v podsttě o zjednodušený systém používný v komerčních elektroforetických sestvách. Experimentální část Dávkovcí část prtury Sestv dávkovcí části prtury je n obr. 1. V plstovém (poly-methylmethkrylátovém) bločku (1) je plynotěsně (šroubením těsněním ze silikonového kučuku) upevněn dávkovcí konec seprční kpiláry (2), nádobk se seprčním elektrolytem nebo roztokem vzorku (3), elektroforetická elektrod (4) spojk (5). Do ní je připojen hdičk ze zdroje tlku tvořeného dvěm membránovými pumpmi (6) (7) třícestnými elektromgneticky ovládnými ventily (8) (9). N výstupech z pump jsou jednoduché mechnické mnostty pro nstvení udržování poždovného tlku, který tk lze podle potřeby měnit. Dávkovcí tlk generovný pumpou (7) je kontrolován elektronickým tlkoměrem (10), přesná hodnot promývcího tlku generovného pumpou (6) není důležitá. Činnost dávkovcí prtury je následující. Membránové pumpy jsou v činnosti, mnostty udržují n jejich 486

ventilek (8) vrcí do klidové polohy tlk v nádobce klesne n hodnotu tlku tmosférického. V testovné prtuře bylo přepínání ventilků řízeno čsovými pulsy generovnými progrmem vytvořeným v prostředí LbView odebírnými z univerzální převodníkové desky PCI-6034E (Ntionl Instruments, USA). Je zřejmé, že k jejich přepínání lze použít i jiné způsoby generce potřebných pulsů. Dávkovcí zřízení bylo uprveno tk, by umožňovlo dávkovt i ručním způsobem, tj. zvednutím dávkovcího konce kpiláry, tkže ob typy dávkování, testovné ruční, mohly být porovnány. Obr. 1. Schem dávkovcí promývcí části lbortorní elektroforetické prtury. (1) poly-methylmethkrylátový bloček, (2) dávkovcí konec kpiláry, (3) nádobk s roztokem vzorku či elektrolytu (vilk 4 ml, P-lb, ČR), (4) elektroforetická Pt elektrod, (5) vstup pro připojení ke zdroji tlku (Luer spojk AP16FLT1032N, Ark-Pls, Filipíny), (6) (7) membránové pumpy (N86KN.18, Lborport, USA), (8) (9) elektromgneticky ovládné třícestné ventilky (typ 368131230, Asco Scientific, USA), (10) elektronické měřidlo tlku (GDH 13 AN, Greisinger, Německo). (A), (B) (C) jsou jednotlivé prcovní pozice třícestných ventilků (NO NC oznčuje otevřenou zvřenou cestu při klidovém stvu ventilku), detily viz text výstupech konstntní tlk prtur může být v jednom ze tří stvů: ) V klidovém stvu třícestných ventilků, obr. 1A, je nádobk, ť již s roztokem elektrolytu nebo vzorku, spojen s tmosférou. b) Při dávkování je n definovnou dobu přepnut ventilek (9), obr. 1B, tkže n hldinu roztoku v nádobce se vzorkem působí tlk generovný pumpou (7). Po skončení dávkování se ventilek (9) vrcí do klidové polohy tlk v nádobce prkticky ihned klesne n hodnotu tlku tmosférického. c) Při promývání kpiláry po skončené seprci je n definovnou dobu přepnut ventilek (8), obr. 1C, tkže n hldinu roztoku v nádobce s promývcím roztokem působí tlk generovný pumpou (6). Po skončení promývání se Elektroforetická část prtury Lbortorní elektroforetická prtur byl sestven z výše uvedeného dávkovcího zřízení, seprční křemenné kpiláry (Polymicro Technologies, USA) o vnitřním průměru 75 m, celkové délce 57 cm délce k bezkontktnímu vodivostnímu detektoru (C 4 D) 49 cm; detektor s prcovní frekvencí 330 khz mplitudou 14 Vpp byl zhotoven v lbortoři podle schem v práci 7. Použit byl vysokonpěťový zdroj Spellmn CZE 2000, seprce byly prováděny při npětí 25 kv, proud je uveden u jednotlivých elektroferogrmů. Testovcím roztokem byl ekvimolární směs 0,5 mm K +, N + tyrminu. Směs byl seprován v pufru 20 mm H 3 BO 3 + 10 mm LiOH, ph 9,2. Kpilár byl před měřením promyt 0,1 M NOH (10 minut), deionizovnou vodou (10 minut) poté nplněn seprčním elektrolytem. Dále byl proveden ukázková seprce šesti norgnických ktiontů (K +, B 2+, C 2+, N +, Mg 2+, Li + ) v pufru 20 mm 2-(N-morfolin)ethnsulfonová kyselin (MES) + 20 mm histidin (His), ph 6,17. Výsledky diskuse Určení vhodné doby dávkování Z předběžných experimentů vyplynulo, že vhodný dávkovcí tlk je 50 mbr, podobně jko u komerčních Tbulk I Zákldní dávkovcí prmetry pro různé doby dávkování tlkem 50 mbr počítné z Hgen-Poiseuilleovy rovnice Dob dávkování [s] Ndávkovný objem [nl] Reltivní délk vztžená k celkové délce kpiláry Délk ndávkovné zóny vzorku [cm] Reltivní počáteční délk zóny vzorku [%] 1 6,8 0,15 0,27 2 13,6 0,31 0,54 4 27,6 0,62 1,08 6 40,9 0,93 1,62 8 54,5 1,23 2,16 10 68,1 1,54 2,71 487

Obr. 2. Závislost plochy píku drselného iontu n době dávkování tlkem 50 mbr. Body jsou střední hodnoty ze tří opkovných měření, chybová úsečk předstvuje intervl spolehlivosti počítný pro hldinu význmnosti 95 % Obr. 3. Závislost výšky teoretického ptr n době dávkování tlkem 50 mbr určená pro K + ion ( ) N + ion ( ). Body jsou střední hodnoty ze tří opkovných měření, chybová úsečk předstvuje intervl spolehlivosti počítný pro hldinu význmnosti 95 % elektroforetických přístrojů. Pro odhd objemu ndávkovného roztoku vzorku do kpiláry (V inj ) byl použit Hgen-Poiseuilleov rovnice, V inj = Δpr 4 t inj /8ηL, kde Δp je tlkový rozdíl (dávkovcí tlk), r vnitřní poloměr kpiláry, t inj dob dávkování, η dynmická viskozit L celková délk kpiláry 2. Pro dnou kpiláru je ndávkovný objem vzorku určen součinem dávkovcího tlku doby dávkování. Vypočítné prmetry dávkování pro různé doby dávkování jsou shrnuty v tb. I. Promývání kpiláry mezi jednotlivými nlýzmi bylo prováděno tlkem 1000 mbr po dobu 40 s. Jk lze očekávt, plochy píků testovných iontů lineárně rostou s rostoucí dobou dávkování; pro ilustrci je n obr. 2 tto závislost uveden pro drselný ion. Tuto závislost lze znázornit i ve formátu ploch píku množství ndávkovného iontu, vypočítné z ndávkovného objemu (tb. I) známé koncentrce. Pk směrnice této závislosti udává citlivost detekce příslušného iontu z použitých experimentálních podmínek. Byly zjištěny citlivosti 0,12, 0,10 0,05 mv s pg 1 pro K +, N + tyrmin. S rostoucí dobou dávkování se zvyšuje odezv detektoru, všk, jk je zřejmé z obr. 3, kde jsou uvedeny výšky teoretických pter pro drselný sodný ion, od určité doby dávkování výšky teoretických pter vzrůstjí (seprční účinnosti klesjí). Proto, n zákldě výsledků uvedených v obr. 3, byl pro dlší měření zvolen dob dávkování 4 s, což při tlku 50 mbr odpovídá délce ndávkovné zóny rovné 1 % z celkové délky kpiláry. Toto zjištění kore- Obr. 4. Elektroferogrmy ekvimolární směsi 0,5 mm drselného (1), sodného (2) iontu tyrminu (3) získné při vyvinutém (A) ručním (B) dávkování. Seprční pufr 20 mm H 3 BO 3 + 10 mm LiOH, ph 9,2, seprční npětí/proud 25 kv/14 A 488

sponduje s učebnicovým doporučením pro prktické CE nlýzy, podle kterého by délk ndávkovné zóny neměl překročit 1 2 % z celkové délky kpiláry 8. Porovnání testovného ručního dávkování Pro testovné ruční dávkování byly zvoleny stejné dávkovcí podmínky, by bylo možno přímo porovnt zjištěné nlytické seprční prmetry: 50 mbr 4 s pro testovné 10 cm (přibližně 10 mbr) 20 s pro dávkování ruční. Ilustrční elektroferogrmy testovné směsi směsi šesti ktiontů registrovné při dávkování oběm metodmi jsou n obr. 4 5. N obr. 5 je pro porovnání uveden i modelový elektroferogrm generovný progrmem Pek Mster 9,10 (by bylo možno experimentální modelový elektroferogrm přímo porovnt, jsou uvedeny v normovné formě). Zákldní sledovné prmetry obou metod dávkování jsou uvedeny porovnány v tb. II III. Z obr. 4, 5 především z dt v tb. II III je zřejmé, že ob způsoby dávkování jsou zcel ekvivlentní z hledisk ndávkovného množství vzorku do kpiláry při zchování stejné hodnoty Δp t inj. Reltivní směrodtné odchylky (RSD) pro plochu píku jsou pro vyvinuté dávkování cc o 50 % nižší než při ručním dávkování. Tento fkt jednoznčně dokládá, že u vyvinutého dávkování je do znčné míry eliminován vliv činnosti experimentátor. Hodnoty RSD z plochy píku pro vyvinutý způsob dávkování se pohybují v rozmezí 1,15 1,3 %, což odpovídá opkovtelnosti hydrodynmického dávkování u komerčních přístrojů CE (RSD 1 2 %) 2,11. Testovné dávkování je proto vhodnou náhrdou běžně používného ručního dávkování se zvedáním dávkovcího konce kpiláry s několik dlšími výhodmi: ) s kpilárou není třeb pohybovt, je ve stbilní poloze; b) vzorek je ndávkován s vyloučením subjektivních chyb experimentátor pouhým stisknutím tlčítk čsovče ovládjícího dobu přepnutí třícestného ventilku; Obr. 5. Normovné elektroferogrmy modelové ekvimolární směsi 0,05 mm drselného (1), brntého (2), vápentého (3), sodného (4), hořečntého (5) lithného (6) iontu získné při vyvinutém (A) ručním (B) dávkování; modelový elektroferogrm vytvořený progrmem PekMster (C). Seprční pufr 20 mm MES/His, ph 6,17, seprční npětí/proud, 25 kv/7 A Tbulk II Porovnání zákldních prmetrů ručního vyvinutého hydrodynmického dávkování roztoku vzorku o ekvimolární koncentrci 0,5 mm drselného sodného iontu tyrminu. Výsledky jsou z pěti opkovných měření, intervly spolehlivosti jsou počítány pro hldinu význmnosti 95 % Anlyt K + N + Tyrmin Podíl ploch píků 1,09 ± 0,03 1,05 ± 0,02 1,05 ± 0,01 Podíl výšek píků 1,05 ± 0,01 1,05 ± 0,02 1,04 ± 0,01 Podíl výšek teoretického ptr 0,99 ± 0,01 0,99 ± 0,12 1,08 ± 0,08 Podíl: ruční dávkování/vyvinuté dávkování Tbulk III Reltivní směrodrné odchylky (RSD) ploch výšek píků určených z pěti opkovných měření roztoku vzorku o ekvimolární koncentrci 0,5 mm drselného sodného iontu tyrminu při vyvinutém ručním hydrodynmickém dávkování. RSD jsou počítány pro hldinu význmnosti 95 % Vyvinuté dávkování Ruční dávkování Anlyt K + N + tyrmin K + N + tyrmin RSD plochy píků 1,29 1,20 1,15 2,41 2,46 2,34 RSD výšky píků 0,80 1,20 0,86 1,22 1,54 1,82 489

c) prmetry dávkování (tlk, dob) lze při optimlizci dávkování velice sndno reprodukovtelně měnit (především při využití počítčem sistovné obsluhy); d) dávkování je rychlé, což umožňuje nlýzu většího počtu vzorků z jednotku čsu; e) stejného principu jko pro dávkování lze využít i pro promývání kpiláry nejen mezi jednotlivými seprcemi, le i npř. při ktivci kpiláry, úprvě jejího vnitřního povrchu tp. Závěr Vyvinutá metod výrzně usndňuje urychluje dávkování vzorku do seprční kpiláry v lbortorně sestvovných elektroforetických prturách. Lze ji vřdit do počítčového progrmu řídícího seprční proces ovládání vysokonpěťového zdroje, sběr zobrzování dt z detektoru, tp., tím minimlizovt vliv lidského fktoru při provádění nlýz. Princip je s výhodou využitelný i při promývání kpiláry. N experimentátor zbývá pouze výměn nádobek s pufrem, vzorkem přípdně s promývcím roztokem. Práce vznikl z finnční podpory GA ČR, projekt P206/10/1231 MŠMT ČR, projekt MSM 0021620857. LITERATURA 1. Jorgenson J. W., Lukcs K. D.: Anl. Chem. 53, 1298 (1981). 2. Luer H. H., Rozing G. P.: High Performnce cpillry Electrophoresis, A Primer. Agilent Technologies, Wldbron 2010. 3. Hung X. H., Gordon M. J., Zre R. N.: Anl. Chem. 60, 375 (1988). 4. Vochyánová B., Opekr F., Tům P., Štulík K.: Anl. Bionl. Chem. 404, 1549 (2012). 5. Novotný M., Opekr F., Jelínek I., Štulík K.: Anl. Chim. Act 525, 17 (2004). 6. Kšičk V., Prusík Z., Pospíšek J.: J. Chromtogr. A 608, 13 (1992). 7. Novotný M., Opekr F., Jelínek I.: Chem. Listy 99, 132 (2005). 8. Altri K. D., Fbre H.: Chromtogrphi 40, 313 (1995). 9. Gš B., Coufl P., Jroš M., Muzikář J., Jelínek I.: J. Chromtogr., A 905, 269 (2001). 10. http://web.ntur.cuni.cz/gs, stženo 14.12. 2012. 11. Ahuj S., Jimidr M. I.: Cpillry Electrophoresis Methods for Phrmceuticl Anlysis. Elsevier, Sn Diego 2008. T. Kdlecová, F. Opekr, nd P. Tům b ( Deprtment of Anlyticl Chemistry, Fculty of Science, Chrles University, Prgue, b Deprtment of Biochemistry, Cell nd Moleculr Biology, Third Fculty of Medicine, Chrles University, Prgue): Fcilitted Hydrodynmic Smple Introduction into Seprtion Cpillry in Lbortory Electrophoretic Devices A simple nd fst method of pressure smple introduction of smple into seprtion cpillry of electrophoretic device is described. Except mnul exchnge of the vessel with seprtion buffer for tht with smple, the other smpling steps re computer-controlled. Without moving the cpillry, the smple is introduced by pressure generted by membrne pump nd djusted with simple mechnicl mnostt pplied to vessel with the smple solution for defined time period. The method ws tested on seprtion of 0.5 mm K +, N + nd tyrmine mixture. The results were compred with those obtined by mnul smpling utilizing n elevtion of the cpillry smpling end. Under the sme smpling conditions, the results of both methods re quite comprble. The repetbility of the described method is better thn tht of the mnul method. The sme principle cn be used for cpillry wshing or for its ctivtion. 490