RYCHLÉ ELEKTROFORETICKÉ STANOVENÍ MOČOVÉ KYSELINY V ALANTOICKÉ TEKUTINĚ S DÁVKOVÁNÍM Z KRÁTKÉHO KONCE KAPILÁRY PETR TŮMA EVA SAMCOVÁ Ústv biochemie, molekulární buněčné biologie, 3. lékřská fkult, Univerzit Krlov, Ruská 87, 100 00 Prh 10 petr.tum@lf3.cuni.cz Došlo 13.8.08, přijto 24.10.08. Klíčová slov: kpilární elektroforéz, dávkování z krátkého konce kpiláry, močová kyselin, lntoická tekutin, seprční účinnost Úvod Kvlitní klinické studie je nutné provádět n skupinách čítjících nejméně několik desítek lépe několik stovek jedinců. Je to způsobeno vysokou vribilitou v koncentrcích sledovných biologicky ktivních látek uvnitř nvenek stejnorodých skupin pcientů. Pro klinickou nlýzu z toho vyplývá poždvek n vývoj velmi rychlých metod, které nevyždují čsově náročnou úprvu vzorku. Pro stnovení specifických metbolitů v biologických mtricích lze s výhodou použít kpilární elektroforézu (CE) 1 5, která je n rozdíl od kplinové chromtogrfie nenáročná n úprvu vzorku před vlstní seprcí v mnohých plikcích plně postčuje ředění vzorku, popřípdě jednoduchá filtrce. Dobu smotné elektroforetické seprce lze význmně zkrátit snížením délky seprční dráhy. U komerčních přístrojů CE lze snížit délku seprční kpiláry mximálně n 30 cm (u přístroje HP 3D CE firmy Agilent 6 je minimální délk seprční kpiláry 33 cm). Seprční dráhy o délce několik centimetrů jsou používány v elektroforéze n čipu dob seprce n mikročipech nebývá větší než 1 min (cit. 7,8 ). Instrumentce pro čipovou elektroforézu není dosud široce rozšířen, le několikcentimetrových seprčních drh je možné dosáhnout i n běžných přístrojích pro CE. I když se minimální délk seprční kpiláry pohybuje kolem 30 cm, umožňuje většin přístrojů pro CE dávkovt vzorek z detekčního konce kpiláry, který je též oznčován jko krátký konec kpiláry 9 11. Při dávkování z krátkého konce kpiláry je pro vlstní seprci využit pouze dráh mezi detekčním koncem kpiláry detektorem, která je u přístroje HP 3D CE firmy Agilent 8 cm dlouhá. Pro názornost je stndrdní způsob dávkování z dlouhého konce kpiláry dávkování z krátkého konce kpiláry schemticky zobrzen n obr. 1. Přednosti dávkování z krátkého konce kpiláry byly demonstrovány při CE seprci jednoduchých modelových směsí 9 11 v litertuře je tké popsán jeho plikce při stnovení biomrkeru kretininu v moči krevní plsmě 12,13. V tomto příspěvku jsou srovnávány nlytické prmetry stndrdního způsobu dávkování z dlouhého konce kpiláry dávkování z krátkého konce kpiláry při elektroforetickém stnovení močové kyseliny v lntoické tekutině. Močová kyselin je u člověk sledovným klinickým mrkerem, který je spojován s celou řdou nemocí jko je hypertenze, cévní onemocnění, tvorb ledvinových kmenů, dn, Lesh-Nyhmův syndrom dlší 14,15. V klinických lbortořích se stnovení močové kyseliny rutinně provádí enzymtickými metodmi 16 metodmi kplinové chromtogrfie 17. Těchto metodických postupů ovšem nelze použít při stnovení močové kyseliny ve vzorcích lntoické tekutiny krve odebrných z čsných kuřecích embryí z důvodu velmi mlých objemů těchto vzorků. Z tohoto důvodu byl pro stnovení močové kyseliny v tělních tekutinách kuřecích zárodků vyprcován metod CE (cit. 18 ), která poskytuje reprodukovtelné hodnoty s nlyzovnými objemy biologického mteriálu o velikosti pouhého 1 l. b Obr. 1. Schemtické znázornění stndrdního typu dávkování v CE z dlouhého konce kpiláry (A) dávkování z krátkého konce kpiláry (B); 1 seprční kpilár s černě zvýrzněným úsekem využitým k seprci; 2 pozice detektoru; 3 vstupní nádobk se seprčním elektrolytem; 4 výstupní nádobk se seprčním elektrolytem; 5 nádobk se vzorkem 919
Experimentální část Experimentální podmínky pro CE Elektroforetická měření byl proveden n přístroji kpilární elektroforézy HP 3D CE (Agilent Technologies, Německo) s vestveným detektorem s diodovým polem (diod-rry detector) kontrolovným ChemSttion softwrem. Elektroferogrmy byly zznmenávány vyhodnocovány při vlnové délce 292 nm, při které močová kyselin silně bsorbuje. Pro stnovení močové kyseliny byl použit křemenná kpilár (Composite Metl Services, Velká Británie) o celkové délce 80 cm, vnitřním průměru 75 m vnějším průměru 363 m. Vzdálenost detektoru od dlouhého konce kpiláry je 71,8 cm od krátkého konce kpiláry 8,2 cm. Před prvním použitím byl nová kpilár ktivován promytím 0,1 M-NOH, který byl v kpiláře ponechán po dobu 2 h, poté byl kpilár promýván deionizovnou vodou po dobu 15 min nkonec seprčním elektrolytem po 20 min. Před kždou seprcí modelového vzorku i biologického mteriálu byl kpilár promyt v sekvenci: 1 min 0,1 M-NOH, 1 min deionizovná vod 2 min seprční elektrolyt. Ndávkovné množství vzorku bylo z dlouhého i krátkého konce kpiláry stejné, tlkem 20 mbr po dobu 10 s. Všechny seprce probíhly při npětí 20 kv konstntní teplotě 25 C. Pro sttistické výpočty byl použit progrm Origin 7.0 (OriginLb Corportion, USA). Chemikálie Veškeré použité chemikálie doshovly nlytického stupně čistoty. Močová kyselin, tris(hydroxymethyl) minomethn (Tris), hexdimethrin bromid (polybren) NOH byly dodány firmou Fluk; 2-(N-morfolin) ethnsulfonová kyselin (MES) p-minoslicylová kyselin byly od firmy Sigm. Pro příprvu všech roztoků byl použit deionizovná vod (Millipore, USA). Zásobní roztok močové kyseliny (1 mg l 1 ) p-minoslicylové kyseliny (1 mg l 1 ) byly získány rozpuštěním pevných látek v deionizovné vodě s přídvkem 1 M-NOH do úplného rozpuštění. Seprční pufr o složení 60 mm-mes + 30 mm-tris + 0,001% polybren (ph 6,1) byl připrvován denně čerstvý. ph seprčního elektrolytu bylo měřeno lbortorním ph metrem (pmx 3000, Wissenschftlichen-Technischen-Werkstätten, Německo). Odběr úprv biologického mteriálu Alntoická tekutin byl odebírán z 8 ž 14 dní strých kuřecích zárodků podle metodiky vyprcovné prováděné n prcovišti Fyziologického ústvu AV ČR (cit. 19 ). Vzorky lntoické tekutiny byly dlouhodobě uchovávány v 0,5 ml nádobkách Eppendorf při teplotě 80 C. Před elektroforetickým stnovením byly vzorky lntoické tekutiny rozmrženy zprcovány podle následujícího postupu: 50 l lntoické tekutiny bylo smícháno s 20 l 1 mg l 1 roztoku p-minoslicylové kyseliny, 100 l 0,1 M-NOH 830 l deionizovné vody. Alntoická tekutin je tímto postupem 20 ředěn, výsledná koncentrce p-minoslicylové kyseliny ve zprcovném vzorku je 20 mg l 1 koncentrce NOH je 0,01 mol l 1. p-aminoslicylová kyselin je použit jko vnitřní stndrd pro zvýšení přesnosti elektroforetického stnovení NOH je přidáván z důvodu mlé rozpustnosti močové kyseliny ve vodě. Výsledky diskuse CE stnovení močové kyseliny v lntoické tekutině bylo provedeno v seprčním pufru s výsledným složením: 60 mm-mes + 30 mm-tris + 0,001% polybren, ph 6,1. Nízká iontová vodivost kyselé složky MES i zásdité Tris umožňuje použití vysoké koncentrce pufru, která je výhodná pro seprci biologických vzorků s vysokým obshem solí. V koncentrovných pufrech dochází k zostření zón nlyzovných látek, které se od sebe sndněji oddělí zároveň se tké zvýší citlivost jejich stnovení. Přídvek povrchově ktivní látky polybrenu obrcí elektroosmotický tok, který má stejný směr jko je migrce niontů kyseliny močové, což zkrátí dobu jejího stnovení. Při ph 6,1 je močová kyselin dosttečně ionizován (hodnot pk A pro první disociční stupeň je 5,4) poměrně rychle migruje s hodnotou pozorovné pohyblivosti 54,9 10 5 cm 2 s 1 V 1 určenou pro dávkování z dlouhého konce kpiláry. Pro zvýšení přesnosti CE stnovení močové kyseliny v biologickém mteriálu byl do lntoické tekutiny přidáván interní stndrd p-minoslicylová kyselin, který je chemicky stbilní dobře bsorbuje při stejné vlnové délce jko močová kyselin (292 nm). Prmetry klibrčních závislostí pro dávkování z dlouhého i z krátkého konce kpiláry jsou shrnuty v tbulce I. Citlivost stnovení určená z plochy píku je stejná pro ob způsoby dávkování, což dobře koresponduje se stejným bsolutním ndávkovným množstvím močové kyseliny do kpiláry. Zásdní rozdíl mezi oběm typy dávkování je v citlivosti určené z výšky píku s tím souvisejícím limitem detekce (LOD) stnovení. Citlivost stnovení je pro dávkování z krátkého konce 3 vyšší dosžený LOD 3 nižší v porovnání s normálním způsobem dávkování. Výšk píku odpovídá ktuální koncentrci nlytu v zóně, která kontinuálně klesá v průběhu seprce vlivem disperze zóny způsobené difuzí, elektroosmózou dsorpcí nlytu n stěnu kpiláry. Všechny tyto efekty, které zpříčiňují rozmývání zóny nlytu, budou menší n krátké seprční dráze. Volb krátké seprční dráhy je tk účinným nástrojem pro zvýšení citlivosti CE stnovení umožňuje nenáročnou cestou dosáhnout submikromolárních LOD. Z porovnání seprčních prmetrů pro ob typy dávkování jednoznčně vyplývá výrzné zkrácení migrčního čsu v krátké kpiláře (tbulk II). Pozorovný migrční čs (t m ) močové kyseliny je v krátké kpiláře 10 menší v porovnání s dávkováním z dlouhého konce kpiláry. Šířk píku v polovině výšky (w 1/2 ) je v krátké kpiláře 3 menší, což přesně souvisí s 3 vyšší výškou píku. Dlším 920
Tbulk I Klibrční závislosti určené z plochy výšky píku kyseliny močové pro dávkování z krátkého dlouhého konce kpiláry Prmetr krátký konec dlouhý konec ploch píku Testovný dynmický rozsh, mg l 1 1 200 1 200 Směrnice, mau min l mg 1 1,77 ± 0,01 1,73 ± 0,02 Úsek, mau min 2,74 ± 1,24 3,63 ± 1,41 R 0,9998 0,9998 výšk píku Lineární dynmický rozsh, mg l 1 1 50 1 50 Směrnice, mau min l mg 1 2,15 ± 0,03 0,72 ± 0,01 Úsek, mau min 0,91 ± 0,64 0,28 ± 0,28 R 0,9998 0,9997 LOD, mg l 1 0,14 0,42 LOD, M 0,8 2,5 Klibrční závislosti byly experimentálně změřeny pro 5 různých koncentrcí, kždá koncentrce byl měřen 3. Hodnoty LOD byly určeny jko výšk píku odpovídjící trojnásobku průměrné hodnoty šumu kritickým prmetrem je počet teoretických pter (N), který byl vypočten ze vzthu N = 5,54 (t m /w 1/2 ) 2. 10 nižší hodnotu N pro dávkování z krátkého konce lze vysvětlit krátkou drhou, n které probíhá seprce. Srovntelnějším prmetrem chrkterizujícím seprční účinnost je počet teoretických pter přepočítný n jeden metr kpiláry, jehož hodnot je pro dávkování z obou konců kpiláry přibližně shodná. Tké rozlišení píku kyseliny močové p- minoslicylové je menší v krátké kpiláře, což opět souvisí s krátkou seprční drhou. N druhou strnu je hodnot rozlišení 3,9 pro krátkou kpiláru dostčující výrzně převyšuje kritickou hodnotu 1,5, jejíž dosžení je povžováno z úplné rozdělení dvou píků 20. Úplného oddělení kyseliny močové p-minoslicylové bylo dosženo nejen v modelové směsi těchto dvou látek, le i v komplexním vzorku lntoické tekutiny (obr. 2). Přednosti dávkování vzorku z krátkého konce ve srovnání s normální typem dávkování jsou jsně ptrny z elektroferogrmů zobrzených ve stejném měřítku n obr. 2. N krátké kpiláře trvá seprce si 1 min Tbulk II Migrční čs chrkteristiky seprční účinnosti Prmetr krátký konec dlouhý konec Migrční čs, s 52,4 ± 0,2 523,2 ± 2,1 Šířk píku 0,7 ± 0,0 2,1 ± 0,0 v polovině výšky w 1/2, s N 33 300 ± 900 338 800 ± 6100 N, m 1 391 800 ± 10 600 473 800 ± 8500 b Rozlišení R S b 3,9 ± 0,1 13,1 ± 0,2 Všechny prmetry byly určeny pro koncentrci močové kyseliny 10 mg l 1. b Rozlišení píku močové kyseliny vnitřního stndrdu p-minoslicylové kyseliny Obr. 2. Elektroferogrm vzorku lntoické tekutiny s dávkováním z krátkého (A) dlouhého (B) konce kpiláry; identifikce píků: 1 p-minoslicylová kyselin, 2 močová kyselin 921
Tbulk III Stnovené koncentrce močové kyseliny ve vzorcích lntoické tekutiny Vzorek číslo krátký konec [mg l 1 ] dlouhý konec [mg l 1 ] 1 1853 1447 2 968 728 3 373 283 4 485 462 5 306 271 Uvedené hodnoty jsou průměrem ze třech měření v porovnání s 9 min při stnovení v dlouhé kpiláře. Tké výšky píků při stnovení téhož vzorku jsou při dávkování z krátkého konce kpiláry mnohem vyšší. Nvíc je v dlouhé kpiláře pozorováno chvostování píku p-minoslicylové kyseliny, které se nestčí projevit n krátké seprční dráze. Použitelnost dávkování z krátkého konce kpiláry pro stnovení močové kyseliny v lntoické tekutině byl porovnáván s normálním způsobem dávkování. Párový t- test neprokázl sttisticky význmný rozdíl n hldině význmnosti 0,05 mezi oběm způsoby dávkování při stnovení močové kyseliny v pěti vzorcích lntoické tekutiny (tbulk III). Z provedených experimentů jsně vyplývá, že n krátké seprční dráze lze oddělit pouze velmi jednoduché směsi látek (počet teoretických pter i rozlišení je nižší v porovnání s dlouhou seprční drhou). V tomto přípdě le byl seprční dráh o délce pouhých 8 cm s úspěchem použit pro stnovení močové kyseliny ve velmi složité biologické mtrici, jkou je lntoická tekutin, která obshuje kromě močové kyseliny stovky dlších biologicky ktivních látek. To, že n elektroferogrmu lntoické tekutiny jsou ptrné pouze dv dominntní píky močové kyseliny p-minoslicylové, kyseliny je dáno volbou selektivního detektoru. Při vlnové délce 292 nm nebsorbují osttní nlyty přítomné v biologickém vzorku, které potom nemusí být úplně odděleny od sledovného nlytu tyto interferenty nejsou detegovány. Závěr Zkrcování délky kpiláry v CE n velikost několik centimetrů vede k dosžení velmi krátkých seprčních čsů nižších než 1 min. Pro dosžení tkto rychlých elektroforetických seprcí není nutné vybvovt lbortoř málo rozšířenou čipovou elektroforézou, le lze s úspěchem využít i stndrdní přístroj CE zvolit dávkování z krátkého konce seprční kpiláry. I když se n krátké seprční dráze oddělí pouze jednoduché směsi látek, lze volbou selektivního detektoru provádět stnovení biologicky ktivních látek i v tk komplexních mtricích, jkými jsou biologické tekutiny, které obshují stovky dlších komponent. Zároveň lze touto strtegií snížit LOD CE n submikromolární úroveň. Tto práce byl podporován Grntovou genturou ČR (grnt č. 203/07/0896) MŠMT České republiky (výzkumný záměr č. MSM0021620814). Seznm zkrtek CE kpilární elektroforéz MES 2-(N-morfolin)ethnsulfonová kyselin Tris tris(hydroxymethyl)minomethn LOD limit detekce LITERATURA 1. Shihbi Z. K., Friedberg M. A.: Electrophoresis 18, 1724 (1997). 2. Jbeen R., Pyne D., Wiktorowicz J., Mohmmd A., Petersen J.: Electrophoresis 27, 2413 (2006). 3. Huck C. W., Bkry R., Bonn G. K.: Electrophoresis 27, 111 (2006). 4. Tům P., Smcová E.: Chem. Listy 101, 200 (2007). 5. Tům P., Smcová E.: Čs. lék. čes. 146, 593 (2007). 6. http://www.chem.gilent.com/scripts/generic.sp? lpge=389, stženo 1. říjn 2008. 7. Wu D., Qin J., Lin B.: J. Chromtogr., A 1184, 542 (2008). 8. Li S. F. Y., Krick L. J.: Clin. Chem. 52, 37 (2006). 9. Altri K. D., Kelly M. A., Clrk B. J.: Chromtogrphi 43, 153 (1996). 10. Euerby M. R., Johnson C. M., Ciklo M., Brtle K. D.: Chromtogrphi 47, 135 (1998). 11. Geiser L., Rudz S., Veuthey J.-L.: Electrophoresis 26, 2293 (2005). 12. Zinellu A., Crru C., Usi M. F., Sotgi S., Dein L.: Electrophoresis 25, 1096 (2004). 13. Cost A. C. O., d Cost J. L., Tonin F. G., Tvres M. F. M., Micke G. A.: J. Chromtogr., A 1171, 140 (2007). 14. Murry R. K., Grnner D. K., Myes P.A., Rodwell V. W.: Hrperov biochemie. H & H, Prh 1998. 15. Devlin T. M.: Biochemistry with Clinicl Correltions. Wiley-Liss, New York 1992. 16. Kolektiv utorů: Doporučené metody v klinické biochemii. Avicenum, Prh 1992. 17. Husen A., Fuchs D., König K., Wchter H.: Clin. Chem. 27, 1455 (1981). 18. Mtějčková J., Tům P., Smcová E., Zemnová Z.: J. Sep. Sci. 30, 1947 (2007). 19. Zemnová Z., Murphy M. J., v knize: New Insights into Fundmentl Physiology nd Peri-ntl Adpttion of Domestic Fowl (Yhv S., Tzschentke B., ed.), str. 141. Nottinghm University Press, Nottinghm 2006. 922
20. Opekr F., Jelínek I., Rychlovský P., Plzák Z.: Zákldní nlytická chemie. Krolinum, Prh 2002. P. Tům nd E. Smcová (Institute of Biochemistry, Moleculr nd Cell Biology, Third Fculty of Medicine, Chrles University, Prgue): Fst Electrophoretic Determintion of Uric Acid in Allntoic Fluid with Injection from the Short End of the Cpillry Using short seprtion pth mkes it possible to chieve very fst electrophoretic seprtions. Such pths re vilble in cpillry electrophoresis instruments on the condition tht smple is introduced into the cpillry from the short end side. This procedure ws successfully used in the determintion of uric cid in llntoic fluid of chicken embryos. The LOD of the optimized method is 0.8 m l l 1 nd the seprtion time is shorter thn 1 min. 923