197 v prùbìhu psán více. cyklu Scenedesmus quadricauda. Pdbných závislsti byl p- 5. Regulace bunìèných cyklù øas Chceme-li pznat pvahu mechanismù, které regulují prùbìh bunìènéh cyklu, musíme pøedevším hledat dpvìdi na tøi tázky, které plžil HARTWLL (1974). V pzmìnìné frmulaci znìjí takt: (1) Jak je spøažen rùst s reprdukèními pchdy, aby za rùzných rùstvých pdmínek dšl v bdbí mezi dvìma dìleními buòky vždy k pøimìøenému zdvjení nezbytných funkèních slžek buòky? (2) Jak a kdy se spuští sled reprdukèních dìjù v buòce a ve kterých bdech mùže být bunìèný cyklus zadržen? (3) Jak je zajištìna krdinace hrmnéh mnžství elementárních dìjù v bunìèném cyklu a které dìje mají øídící úlhu v jedntlivých fázích cyklu? Specifické výhdy øas pr hledání dpvìdí na tyt tázky urèují pø devším dvì klnsti: (1) xistence mnha variant cyklù typu C umžòun je studvat nìkteré regulaèní mechanismy v situacích, s nimiž se u cyklù typu Cl setkáváme zøídka neb se u nich nevyskytují vùbec. (2) výrazná závislst rùstvých pchdù v bunìèném cyklu na ftsyntetické èinnsti chlrplastu má nìklik velmi závažných dùsledkù, neb umžòuje: (a) Synchrnizvat ppulace øas sfázváním dìjù bunìènéh cyklu s peridami svìtla a tmy; tent zpùsb je fyzilgicky pøirzený, lze jej- snadn pužívat v kulturách velkéh bjemu, je úèinný a má ještì další pøednsti. (b) Ovládat kamžitu rychlst rùstvých pchdù velmi snadn, rychle a plynule a v širkém rzmezí hdnt zmìnami vzáøensti kultury. (c) Studvat velmi dùležité vzájemné regulaèní vazby mezi realizací genetické infrmace jádra a chlrplastu a mezi syntetickými pchdy v chlrplastu a statní cytplazmì. Rzbr regulaèních mechanismù v bunìèných cyklech øas je znesnadnìn tím, že øasách typu C máme v tmt smìru nesrvnatelnì více pdrbn ných infrmací než øasách typu Cl. Krmì th mnzí autøi nebrali v úvahu specifický charakter cyklù C a tím, že pracvali pøedevším n s cykly typu Cnn (viz str. 199), analyzvali je, jak by šlcykly typu Cl' v nichž prstì v rùstvém i reprdukèním bdbí dchází k 2nnásbnému zmnžení bunìèných charakteristik míst bvykléh zdvjení. Takvé interpretace mají závažné mezery pøi výkladu mechanismù regulace, i když nìkteré becné závìry mhu i pøi tmt pstupu vyznít správnì. V dalším textu se pkusíme jasnì dlišit, které regulaèní mechanismy mají becnu platnst (pr cykly Cl a Cn) a které jsu specifické pr daný typ cyklu.
1QR a) Spøažení rùstu a reprdukèních pchdù - bd indukce v bunìèném cyklu øas lze definvat dvì fáze: (a) r s t vu f á- z i (GP - grwth phase), v níž jsu rzhdujícími pchdy syntéza RNA, bílkvin a vytváøení energetickéh ptenciálu buòky; (b) sled r e- pr d u k èní c h dìj (RS - reprductin sequence), jehž snvu tvøí replikace DNA a pchdy spjené s rzdìlením jader, rganel a celéh prtplastu. Reprdukèní dìje prbíhají za nrmálních klnstí v pevnì urèeném sledu rychlstí, která je pr daný rganismus specifická a je závislá puze na tepltì. Rychlst rstvých pchïd závisí pøedevším na rychlsti pøísunu energie a materiálu pr syntetické pchdy z vnìjšíh prstøedí d buòky. Tereticky zaèíná RS v tm bdì bunìènéh cyklu, v nìmž se spuští replikace DNA (zaèátek S-fáze). Prakticky však je u auttrfnì rstucích øas výhdné definvat jak bd pøechdu kamžik, kdy se buòka stává schpnu rzdìlení i ve tmì. Dále budeme pr tent bd pužívat termín bd i n d u k c e (BI); je v Gl-f á z i pøedsunut jistý èasvý úsek pøed zaèátkem S-fáze. Tat skuteènst ukazuje, že u øas e- xistuje regulaèní mechanismus, který spuští RS teprve tehdy, je-li buòka schpna celý sled uskuteènit i bez dal š í h pøí s u n u e n e r g i e z ven è í. v nìkterých specifických situacích však buòky vstupí d reprdukèní fáze i tehdy, jsu-li schpny uskuteènit puze jistý její ucelený úse napø. replikaci DNA neb jaderné dìlení. U øas typu CI je puze jeden BI, v bunìèném cyklu øas typu Cn má k a ž d Ý z, n s tup ò zdvjení v 1 a s t n í B I. V buòkách vystavených svìtlu stupá s dbu svìtlení stupeò dsažené indukce n a rste také pèet dceøiných bunìk (2n) vytvøených na knci cyklu. Plha BI v bunìèném cyklu je dbøe charakterizvána urèitým bjemem syntetické práce, které je k dsažení indukce zaptøebí. as ptøebný pr dsažení BI se zkracuje s rstucí specificku r s t vu r y c hl stí kultury () a pøi auttrfním rstu bunìk se stupající rychlstí ftsyntézy. U cykl typu C se stejným zpsbem zkracun jí i èasvé dstupy mezi jedntlivými následnými BI (ZACHLDR a TLfK 1969, SNGR 1965,STNBRGN 1973). Tat závislst pøipmíná známé pravidl vztahu mezi frekvencí následných iniciací replikace DNA a specificku rychlstí rstu u prkarytních rganism (HLMSTTTR 1969a). Syntézy v GP jsu zøejmì navzájem pevnì spjaty, neb knstantnímu bjemu ftsyntetické práce vyknané pøed bdem indukce dpvídá také n n S a žen í c h a r a k t e r i s t i c k é h b j emu buò-
199 ky, mnžství RNA, bílkvin apd. V cyklech typu Cn jsu hdnty tìcht velièin charakterizující rùst pr buòky v dalších indukcích (BI2, BI3 * atd. ) pøibližnì pøíslušnými násbky (2x, 4x atd.) hdnt charakteristických pr indukci BIl (TLfK et al. 1972, ZACHLDR 1975). Bd indukce se nehdí k pøesnému urèení plhy bd U "s t a r- t u" (BS; viz HARTWLL 1974), v nìmž se skuteènì celý RS spuští. Zejména pøi vyských rychlstech ftsyntézy (které jsu pdmínku vyskéh ) se v buòce hrmadí nadbytek zásbních látek. Jejich mnžství v BI pøevyšuje mnžství ptøebné pr prùbìh RS a i p zatemnìní buòka pkraèuje ještì p jistu dbu v rùstu (ZACHLDR a TLfK 1973), než dsáhne BS stále ještì s energetickým ptenciálem pstaèujícím pr u- skuteènìní RS. Srvnání rùzných výsledkù ukazuje, že BI pøedchází zaèátek S-fáze jednu až ètyøi hdiny pdle rychlsti ftsyntézy. Pnìvadž dsud nemáme kritérium pr urèení plhy BS v cyklu, je pr úvahy spuštìní RS vhdnìjší klást jej blíže zaèátku S nežli gi. Pkud jde charakter s p ø a žen í r ù s t v Ý c h a r e- pr d u k èní c h fází existují dvì základní varianty cyklù C : (1) n V bunìèném cyklu varianty C je n úplných jaderných cyklù s fázemi G np l až cytkineze, které se èásteènì pøekrývají v èase, kauzálnì jsu však pslupné. Sknèením S-fáze prvníh cyklu (Sl) se zahajuje Gl-fáze druhéh Cy klu (G12) atd. (2) V bunìèném cyklu varianty C nepøetržitý rùst nn bsahu hlavních slžek a bjemu buòky na 2n-násbek pèáteèní hmty pøedchází reprdukèní fázi, v níž pìt replikace DNA, dìlení jader a prtplastu prbìhnu nkrát v tìsném sledu za sebu. výklad regulaèníh mechanismu spøahujícíh GP a RS v cyklech typu Cn musí pøedevším vysvìtlit, prè v buòkách vystavených trvalému svìtlení stupá pèet dceøiných bunìk, které se na knci bunìènéh cyklu vytvøí, s rstucí hdntu (s rstucí záøenstí ppulace). Na základì existujících údajù (TLfK et al. 1972, ZACHLDRaTLfK 1973, ZACHLDR 1979) mùžeme vztahy urèující výsledný pèet dceøiných bunìk v cyklech typu C pøi rùzných rychlstech rùstu za nepøetržiténp 1 1 h svìtlení charakterizvat takt: V BS se spuští RS sestávající z sl-+ G-+Ml-+ G;-+CKl; rychlst prùbìhu tht sledu je na nezávislá. Suèasnì s G se spuští Gi, jejíž délka a také plha Bs2 závisí na rychlsti rùstu. Jestliže k Bs2 djde v prùbìhu G, s2 dsune Ml, dkud nesknèí, v G; prbìhne G a M2 a BS2 se prjeví v pètu vytvøených dceøiných bunìk. Obdbné pravidl platí pr každý další dstartvaný Ohrnná délka následných RS se zkracuje (pøíèiny th nejsu jasné) a * Pøíslušnst dané fáze k pslupným cyklùm znaèujeme indexem nahøe, který lze dlišit d indexù dle u Gl' G2 a G). Jak tázi G) znaèujeme bdbí mezi sknèením jadernéh dìlení (M) a zaèatkem cytkineze (CK), které je pr jedntlivé jaderné cykly v bunìèných cyklech typu C dsti dluhé. n
200 tak v. jistém stupni n djde k tmu, že BSn padne na èasvé se dìj y n-l n-l n v bunce d úseku M neb G3. S se v tm pøípadì buq vbec nespu í y n-l t, neb (napr. u Scenedesmus quadricauda) prbìhne v G3 ' ale další pstup RSn je zastaven v G (cytkinezí, jež nastupuje záhy p Mn-l). V takvém pøípadì prbìhne pak zbytek RSn až v nvì vytvøených dceøiných buòkách, které se stanu dvjjadernými; t je u Scenedesmus quadricauda dsti èastý jev. Jaký mechanismus øídí vztah mezi, délku svìtlení a pètem vytvøených dceøiných bunìk v cyklech tyu C, není jasné. nn b) Spuštìní sledu reprdukèních pchdù - zadržení v G1-fázi Jedním z d11kaz11 pr význam regulaèní funkce umístìné v bd u s t a r- t u je, že se vývj bunìk øas zadržuje v Gl-fázi, kdykli nastane n e- d s t a t e k n ì k t e r é ne z byt n é ž i v i n y. Buòky øas vzaté ze stacinární fáze jednrázvé asynchrnní kultury (která bývá nejèastìji limitvána svìtlem) jsu dbøe synchrnizvány v Gl-fázi a èast služí jak inkulum pr synchrnní kultury. Synchrnní ppulace Chamydmna8 reinhardtii a chlrkkálních øas nasazené na pèátku cyklu d média nebsahujícíh dusík, síru neb fsfr zadržují se v Gl- -fázi, a t buq hned v prvním, neb v nìkterém dalším jaderném cyklu (TAMIYA 1963, LIN a KNUTSN 1973). U rzsivek lze dsáhnut zastavení v Gl-fázi, dejme-li se z živnéh rztku køe m í k, který ptøebují pr stavbu bunìèné stìny, ale který má tak rzhdující význam pr spuštìní replikace DNA (DARLY a VOLCANI 1969, SULLIVAN a VOLCANI 19?3b). K zadržení dchází tìsnì pøed zaèátkem S-fáze a syntéza DNA je prvním pchdem, který lze p pøidání Si k vyhladvìné kultuøe analytickými metdami zjistit. Aktivita DNA- -plymerázyadexytymidinaminfsfátkinázy však stupá døíve nežli hladina DNA, takže prvními pchdy spuštìnými pøidáním Si jsu zøejmì syntézy specifických bílkvin neb snad i transkripce pøíslušných RNA. U ppulací zadržených dnìtím N, P a S je pøadí analyticky stanvených syntéz vyvlaných pøidáním chybìjícíh prvku zcela zøetelnì nejprve RN pak bílkviny a naknec DNA (jsu tedy zadrženy vždy dsti dalek pøed BSI. Nìkteøí autøi se dmnívají, že syn t é z a b í 1 k v i n v c hl rp 1 a s t u má bezprstøední úlhu ve spuštìní RS (MI- HARA a HAS 1971a, b, 1975) neb knkrétnìji v iniciaci replikace jaderné DNA (BLAMlR et al. 1974). Autøi usuzují tak na základì pzrvaných úèinkd specifických inhibitrd prtesyntézy, které pdsbí na chlrp1astvých 70 S ribzómech, resp. na transkripci chlrnl.."t-n.,6
201 DNA. Tyt inhibitry však také pmìrnì rychle snižují neb zcela ptlaèují ftsynteticku aktivitu chlrplastu narušením jeh funkèních struktur (tylakidù) a zastavením syntézy významných enzymù (ribulózbisfsfátkarbxylázy).chybí tedy jednznaèný dùkaz, zda pzrvané úèinky nejsu druhtným dùsledkem ptlaèení ftsyntézy (srv. HOWLL et al. 1975). Sledvání úèinkù krátkých pul s ù c hl r a m fen i k 1 u, c Y k 1 h e x i m i d u a 6 - m e tyl P u r i n u pdaných v rùzných fázích bunìènéh cyklu na jeh další prùbìh (MIHARA a HAS 1971b, 1975) pøedstavuje jeden z velmi perspektivních pøístupù k analýze regulaèních mechanismù v cyklu. dèinky chlramfeniklu jsu nejvýraznìjší na pèátku rùstvé fáze cyklu a úèinky cyklheximidu na pèátku reprdukèních pchdù (ke knci cyklu je úsek necitlivý k bìma inhibitrùm); 6-metylpurin je velmi úèinným a snadn vladatelným inhibitrem syntézy RNA v buòkách øas. Krátký puls (30 min) v urèité fázi bunìènéh cyklu ChZamydmnas reinhardtii zcela ptlaèí již indukvané RS a buòky se v daném cyklu nerzdìlí. K rzdìlení djde, rstu-li buòky dále na svìtle p dbu ptøebnu k prbìhnutí jednh úplnéh cyklu; dìlí se pak na pèet bunìk dpvídající rùstu p dbu dvu cyklù. Pdbné vymazání již prbìhléh vývje bunìk jsme pzrvali v pkusech s cyklheximidem uscenedesmus quadricauda. Je-li ChZreZZa prtthecides pìstvána na svìtle v médiu s nízkým bsahem dusíku bsahujícím glukózu, degenerují její chlrplasty v prplastidy. získá se tak ppulace bunìk zadržených v Gl-fázi, která se mùže dále vyvíjet p pøenesení d média bez glukózy s dstateèným mnžstvím dusíku (OKI a HAS 1964). Jeden bunìèný cyklus zaèínající èásteènu regenerací chlrplastu (vytvøení etiplastu) mùže takt prbìhnut i ve tmì. c) Sepìtí a zadržení sledu reprdukèních pchdù Ze srvnáni mnha údaj cyklech typu C vyplývá, že èasvé sepìtí men zi replikaci DNA, dìlením jádra a dìlením prtplastu je d znaèné miry vlné.mže prbíhat nejprve nìklik nás 1 e d n Ý c h r e p 1 i- k a c i DNA, ptm d p v i d a j i c i pè e t j a d e r- n Ý c h dìl e n i a psléze dìl e n i b u ò k Y (Saenedesmus) neb p n ì k 1 i k a s tup nic h r e p 1 i k a c e DA se pøi slušné s tup nìj a der n é h a b u n ì è n é hd ì- 1 e n i s tøi d a j i (Chlrella, Chlamydmnas reinhardtii, udrina aalifrniaa) neb se také s tøi d a j i r e p 1 1 k a c e DNA s jaderným dìlením a všechna dìleni pr tp 1 a s tup rb i haj i a ž v m nh j a d e r-
202 n é b u ò c e (ChZamydmnas geitzeri a z mál prstudvaných mdelù napø. Hydrdiatyn). Pravdìpdbnì.se najdu další kmbinace. Krmì th mhu být u jednh rganismu pøechdy d jednh typu k druhému pdle pdmínek rùstu, které táké mhu urèvat, zda cykly budu prbíhat s minimálním bsahem jednh, dvu neb i ètyø genmù v jádøe dceøiné buòky (Saenedesmus). T r v á n í G2 - f á z e j e dn tli v Ý c h j a der n Ý c h c Y klù jet e d y z naè n ì p r. m ì n 1 i v é a mùže být pzmìnìn v prùbìhu dalších jaderných cyklù neb jiných dìjù v buòce. Naprti tmu pøíklady dluhdbéh zadržení bunìèných cyklù v G -fázi 2 vnìjšími pdmínkami jsu pmìrnì øídké. U ChZreZZa vuzgaris BIJRINCK je znemžnìn jaderné dìlení, je-li ppulace pìstvána v e x t r é m n í tep 1 t ì (pøi 43 c, ptimurn rùstu 36 C). Syntetické a rùstvé pchdy pstupují dále a støídání následných stupòù Gl- a S-fází pkraèuje, až se v jádøe nahrmadí 16 až 32násbek mnžství DNA dpvídajícíh jednmu genmu (pzypzidie, ev. pzytenie). Zdá s že pøíèinu blku je knfrmaèní zrnìna bílkviny nezbytné pr jaderné dìlení. Ihned p snížení teplty se bøí jádraabuòky zaèínají dìlit a rzbíhají se intenzívnì syntézy makrmlekul (ST- LfK et al. 1975). Buòky velkých rzmìrù získal také GRIFFITHS (1970) pìstváním ChZreZZa vuzgaris (kmen mersn) za h e t e rt r f n í c h p d- rn í n e k védiu bsahujícím glukózu a nrmální mnžství dusíku. Buòky mìly degenervané chlrplasty a nedcházel u nich k jadernému dìlení. P pøenesení d média bez glukózy a na svìtl dšl pøibližnì za 15 h k dìlení. jader a za 18 h k dìlení na 16 až 32 dceøiných bunìk. Pùsbením k 1 c h i c i n u zastavuje se dìlení jádra a prtplastu u ChZreZZa (WANKA 1968). V jádøe se nahrmadí až 16 genmù (p 1 Y P 1 i d i e). Je-li klchicin dmyt až v dbì, kdyvkntrlní ppulaci již prbìhl bunìèné dìlení, buòky se ve tmì již nerzdìlí. Prdìlají-li však další cyklus na svìtle, v nìmž djde k další replikaci genmù, rzdìlí se nejprve na buòky plyplidní; v dalších dìleních se pstupnì dstanu d haplidníh stavu až na malý pdí'l bunìk, který zùstane diplidní neb i ve vyšších stupních plidie. Inhibitry syntézy bílkvin v cytplazmì zastavují syntézu DNA v ppulaci témìø kamžitì (WANKA a MOORS 1970, SULLIV a VOLCANI 1973a). Syntéza bílkvin je také ptøebná pr pchdy dìlení jádra a prtplastu, které však nevyžadují již nvu transkripci, jak ukazují pkusy s inhi hi f-,,..
203 d) Sled a vzájemné sepìtí dìjù v bunìèném cyklu Naše znalsti dìjích mezenéh èasvéh trvání, které se dehrávají v rl1zných fázích cyklu a jsu nepstradatelné pr další vývj buòky, se v psledních létech znaènì rzšiøují. Vedle nvých pznatkl1 prdbìhu syntézy enzymd v cyklu je t pøedevším výsledek studia úèinku inhibitrd a chvání tep 1 t n ì z á v i s 1 Ý c h mu t a n t, u nichž se defekt prjevuje zastavením prdbìhu bunìènéh cyklu pøi restrikèní tepltì. V bu psledních smìrech pøinesly nejvìtší pkrk u øas práce HOWLLOVYa splupracvníkd s Chamydmna8 peinhapdtii (HO- WLL 1974, HOWLL et al. 1975). Tit autøi vypracvali velmi úèinný pstup, jak zjištvat na nesynchrnních ppulacích: (a) bd cyklu, v nìmž se pøestává uplatòvat bezprstøední úèinek inhibitru neb tepltnì závisléh genvéh prduktu (blck pint, transitin pint, bd pøechdu); (b) kritický kamžik, v nìmž zásah zadrží další pstup bunìk v cyklu (executin pint, terminatin pint, pr bjí bd zadržení). Metda se mdže uplatnit i pøi studiu kauzálníh sepìtí rdzných elementárních dìjd v cyklu (HOWLL 1974). Z prací využívajících synchrnních kultur pøinášejí pdnìtné výsledky pøedevším pkusy s krátkdbými pul s Y i n h i bit r d (MIHARA a HAS 1971b, 197,5'), tmy (ZACHLDR 1979) a znaèených sluèenin. Na br. 78 jsu zachyceny plhy rùzných klíèových bdù a prùbìh dìjùvbunìènélli cyklu Chlamydmnas reinhardtii, jak je lze sestavit na základì prací "mnha autrù, zejména HOWLLA a splupracvníkù, LVINA a splupracvníkù a MlHARY a RAS. Pøi sestavení schématu jsme se dpustili øady nepøesnstí zejména prt, že rùzné typy údajù byly získány a rùzných pdmínek kultivace kmene Chlamydmnas, a prt pøesná vzájemná plha dìjù, zejména tìch, které jsu vyznaèeny v rùzných mezikružích, je nìkdy sprná. Tyt nepøesnsti budu však dalším výzkumem snadn dstranìny. Pèátek bunìènéh cyklu se shduje s pèátkem svìtlení v plze O; jedntlivé ètvrtiny cyklu jsu vyznaèeny uprstøed schématu. Dba svìtlení v experimentech všech autrù trvala 12 h a dba tmy také 12 h. Na vnitøním prstenci jsu znaèeny bdy pøechdu dsud definvaných tepltnì citlivých mutant; jejich znaèení je ve vnitøním mezikruží. Jde vesmìs b mutanty, u nichž se pøesunem d restrikèní teplty p jisté dbì zastaví prùbìh bunìènéh cyklu, pnìvadž byla narušena nìjaká funkce, jež je nezbytnì nutná pr dknèení bunìènéh cyklu. Bd pøechdu (BP) znaèuje plhu ve sledu bunìèných dìjù, kde ještì napsled má pøesun d restrikèní teplty blkující úèinek. Ve støedním prstenci jsu znaèeny plhy bdù pøechdu pr úèinek rùzných inhibitrù a nìkterých jiných brzdících faktrù; jejich symbly jsu ve støedním mezikruží. V bvdvém prstenci jsu vyznaèeny prùbìhy èasvì mezených a pr prùbìh bunìènéh cyklu závažných pchdù, a t bdem ležícím uprstøed trvání danéh dìje. Nedstatkem schématu je, že neukazuje délku trvání jedntlivých dìjù, která je velmi rùzná - d
204 - :J.- C QJ L-.c (.) \11 --' :J a..d "O, - L- '- > :) In a. "- a. c OJ.OJ "O m Ir) :) 'OJ VI U'") >- O VI O M "O U'") - U'"). N O 'O. '- >.c.- U :Y: O O >- U ::J In a. 1- -"'..c {) c OJ.OJ u "O :.:: g-. '<lj.:?:-;:, >. '<lj In >- "Jl<' >In 00..SI O >-x... c: In.-'" O,O O O..."" c..!::..00 aj.!:: (,) "-:...O <lj I c: / g 0;00 't- Q) VI LOOOLS "- O O - L. U1 "tj O- O- >- N-= 0- N C "tj Oè "tj C O.; >- '-. I"'OOL"' ọ.. "t) - '--' 'c QJ.QJ "D x Q).c'C.9 >-c: XO- >- > U L..u "tj./ C -'N "Cc.: 00- ->- L n In.' D c u "èi c-. :) :) 0--0.>-.a,- X "O QJ.c:.Y. -.Y. L. >-.Y. () L[")= -r n- :c., c c.- -- u -- OJ.c In u >- - 71,OO < Z QJO u 'QJ a c:.;ý.... :.:: QJ 0.1:) QJ.... :J - '+- V> N V> -.-.c >. x N 'O.c L- :J O..c 'L: -=--- 'u e ::) -.. '" Lnï "'-, :J 'QJ >. QJ > "tj 'QJ N -- QJ C:""tn c ""-.,.. - :J.:x: - a. >- QJ L-QJtn 0\.DO-O -.>QJO QJ '+-; Q.N -'" '0 :J U c O QJ "I: a.vj:j.:x:-;a. a.">. 10:J"'" ""QJ >.:x: -O >. 1 CUlD '" C.:f 0 aj:j "\ >--L- 00 -- In In "O.- :J "tj -.- QJ "OL- C :L:.D, ::c 0.0 aj I :J tu.d,- C QJ tn a +-' In M toul '0 L-.c U O +.- >. U / /.:f - C aj L-.C :J :J C;' : :J x.x- OJ c - )0 "O.X-.X- 0.>-.X- O O OJ L. VI > -O :J,C \ \\,
205 mnha hdin (syntéza ribulózbisfsfátkarbxylázy) p necelu hdinu (syntéza jaderné DNA, dìlení prtplastu). Krmì th jsu ve vnìjším prstenci vyznaèena bdbí, v nichž krátkdbé pulsy chlramfeniklu a cyklheximidu zpdsbují zpždìní reprdukèních pchdd dbu trvání pulsu a pulsy 6-metylpurinu zruší úèinek prbìhlé èásti cyklu na indukci reprdukèních pchdd a cyklus se zdánlivì vrací ke svému zaèátku. Nápadné je, že BP pr rdzné inhibitry a cb mutanty leží nejèastìji ve druhé a ètvrté ètvrtinì bunìènéh cyklu. Naprti tmu krátkdbé pulsy inhibitrd mìly nejvýraznìjší úèinky v první a tøetí ètvrtinì cyklu. Je t zøejmì drazem skuteènsti, že v p r v ní a tøe t í ètv r t i nì pr b í haj í d dle žit é syn t é z y pr r d s t a pr.r e pr d u k.è n í dìj e, kdežt ve druhé ètvrtinì leží rzhdující regulaèní f u n k c e a ve ètv r t ér z hd ují c í r e pr d u k èní k r - k y, k t e r é u m ž ò ují pøe c hd d dal š í h c Y klu. Obr. 78. Mapa èasvì mezených dìj, bd pøechdu a regulaèních uzl v bunìèném cyklu Chamgdmnas reinhardtii. Vnitøní mezikruží: tepltnì citlivé mutanty získané HOWLLM a splupracvníky a znaèené bdy pøechdu pr TS 1001 až 50040. Støední mezikruží: bdy pøechdu pr psbení rzných inhibitrajiné zásahy. Inhibitry byly pužity v tìcht kncentracích (g.ml ): rifampicín 250, 5-brmuracil I, spectinmycin 3D, ethidiumbrmid ID, DCMU (dichlórfehyldimetylurea 5, chlramfenikl 500, p-chlórmerkuribenzát ID, aktinmycín D 20, mycstatin I, kyselina 3-indlctvá ID, akridinvá ranž ID, hydrxymèvina ID, cyklheximid 1; v mm klchicin 5, kyanid draselný I, azid sdný 0,5, 2,4-dinitrfenl 1. Cásti cyklu, kdy jsu buòky citlivé ke krátkdbému pulsu chlramfeniklu, resp. cyklheximidu, a èást cyklu, kdy buòky reagují na puls cyklheximidu, resp. 6-metylpurinu návratem na pèátek bunìènéh cyklu, jsu vyznaèeny tlustými bluky. U syntetických pchd znaèuje plha úseèky v mezikruží støed intervalu, v nìmž prbíhá syntéza dané látky neb skladba dané struktury; cgt 553, cgt 559, cgt 563-cytchrómy. Prázdná a plná èást prstence pd vnìjším mezikružím znaèuje èást cyklu, kdy je kultura na svìtle a kdy ve tmì. Vzhledem k tmu, že údaje bdech pøechdu byly získány na nesynchrnní, stále svìtlené kultuøe, je z kruhu vypuštìna dba dvu hdin (pøerušení èernéh prstence), kteru jevsynchrnní kultuøe tøeba pøièíst.