BÍLKOVINY = PROTEINY Polymery aminokyselin propojených peptidovou vazbou

BÍLKOVINY = PROTEINY Polymery aminokyselin propojených peptidovou vazbou 20 AK 20 18 variant pro peptid složený z 20 AK!!! Průměrná bílkovina 300 AK Relativní molekulová hmotnost (bezrozměrné číslo) Molární hmotnost (g/mol) Molekulová hmotnost (MW) - jednotka Dalton (Da) resp. kda

Klasifikace proteinů 1. Funkce specifické, obecné 2. Chemické složení 3. Tvar 1. Funkce obecné: zdroj energie a dusíku Účinné pufry (krev, cytosol) Přispívají významně k udržení osmotického tlaku vně i uvnitř buněk

1. Specifické funkce proteinů Typ proteinu Příklad Výskyt & funkce Katalytické (enzymy) Regulační (hormony) Ochranné Skladovací transportní Strukturní Kontraktilní Genetické funkční proteiny Toxické proteiny Trypsin DNA polymerasa Insulin Růstový hormon Protilátky Interferon Kasein Ferritin Hemoglobin Myoglobin Kolagen Ribosomální proteiny Myosin Actin Histony Represory Ricin Cholera toxin Hydrolysa peptidové vazby Synthesa DNA Stimulace metabolismu glc Stimulace růstu kostí Vazba na cizorodé látky Brání replikaci virů Mléčná bílkovina Zásoba Fe v játrech Transport O 2 v krvi Transport/skladování O 2 ve svalu Vláknité pojivové tkáně Ribosomy Svalová vlákna Asociace s DNA v chromosomech Blokují expresi genu Toxický protein z Ricinus communis Bakteriální toxin

2. Chemické složení Jednoduché Složené polypeptidová + neproteinová část Metaloproteiny Fosfoproteiny Glykoproteiny Lipoproteiny Nukleoproteiny Prosthetické skupiny

3. Rozdělení proteinů podle tvaru molekul Globulární Fibrilární Membránové Další možné způsoby dělení proteinů: Podle lokalizace nebo dějů ve kterých působí: Krevní bílkoviny Mléčné bílkoviny Membránové receptory Elektrontransportní systémy

Primární struktura bílkovin pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci zápis: od N-konce k C-konci N-konec C-konec Primární struktura determinuje prostorové uspořádání a funkci proteinů ZÁKONITOSTI: Primární struktura je zapsána v DNA (gen) Neexistuje společná sekvence, ani částečně Kombinace AK bez omezení Proteiny se stejnou funkcí z jedinců jednoho druhu jsou identické Polymorfismus bílkovin ("isobílkoviny") - Zákon isopolárních záměn. Bílkoviny jeví druhovou specifitu (sekvenční homologie)

Homologie proteinů % identity % podobnosti

URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků (kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 110 ºC, 24 h) B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace disulfidických můstků) 2. Určit N-konec a C-konec 3. Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním (kam až to jde) 4. 2 nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy) 5. Opakovat bod 3 6. Sestavit primární strukturu řetězce 7. Určit způsob propojení původních řetězců

2. Určení N-koncové AK např.: - DNF - dansyl chlorid

2. Určení C-koncové AK Specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy) Redukce -COOH LiBH 4 na -OH, identifikace aminoalkoholu Hydrazinolýza (NH 2 -NH 2 ) aminoacyl hydrazidy AK

3. Edmanova reakce určení pořadí AK v kratších úsecích (peptidech) - reakce s fenylisothiokyanátem příslušné AK

4. Specifické štěpení polypeptidového řetězce Trypsin štěpí specificky za basickými aminokyselinami Lys, Arg Chymotrypsin štěpí za aromatickými aminokyselinami (Phe, Tyr, Trp) (CNBr štěpí za Met) Separace peptidů (chromatografie) Určení sekvence Edmanovo odbourání N-Leu-Val-Phe-Asp-Lys-Glu-Tyr-Gly-Ile-Arg-Ser-Phe-Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp-Lys-His-Met-Arg-Trp-Gly-C leu-val-phe-asp-lys Glu-tyr-gly-ile-arg Ser-phe thr-lys Cys-pro-ala-trp-lys His-met-arg Trp-gly Leu-Val-Phe Asp-Lys-Glu-Tyr Gly-Ile-Arg-Ser-Phe Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp Lys-His-Met-Arg-Trp Gly

6. Sestavení primární struktury hledání překrývajících se sekvencí peptidů N-Leu-Val-Phe-Asp-Lys-Glu-Tyr-Gly-Ile-Arg-Ser-Phe-Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp-Lys-His-Met-Arg-Trp-Gly-C

URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků (kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 110 ºC, 24 h) B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace disulfidických můstků) 2. Určit N-konec a C-konec 3. Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním (kam až to jde) 4. 2 nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy) 5. Opakovat bod 3 6. Sestavit primární strukturu řetězce 7. Určit způsob propojení původních řetězců (disulfidické vazby)

Kovalentní struktura ( primární struktura + posttranslační modifikace) 1. Propojení řetězců kovalentními vazbami, disulfidové můstky 2. Odštěpení částí řetězců 3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin nekódované AK 4. Připojení mastných kyselin 5. Glykosylace (Asn, Ser/Thr) 6. Fosforylace (dočasné či trvalé) 7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...) 8. Metaloproteiny (koordinačně kovalentní vazby různé síly) 1-3: jednoduché bílkoviny 4-8: složené bílkoviny

2. Odštěpení částí řetězců - příklad

Obecné znaky prostorového uspořádání proteinů (obecně organisovaných biopolymerů) Nativní struktura (konformace) - prostorové uspořádání, jež umožňuje biopolymeru vykonávat biologickou funkci 1. Nativní struktura odpovídá minimu Gibbsovy energie, dané výhodností nekovalentních interakcí 2. Nativní struktura je určena kovalentní strukturou 3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s okolím. 4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické (primární, kovalentní, sekundární, terciární, kvarterní struktura) 5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformačně dynamické systémy) 6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).

Prostorové uspořádání proteinů je dáno primární (kovalentní) strukturou : - Charakter peptidové vazby planární uspořádání!! - Vlastnosti postranních řetězců 60% 40% trans konfigurace

Konformace peptidového řetězce Torzní úhly Φ a Ψ Plně natažený polypeptidový řetězec, trans konfigurace Φ=Ψ=180º až -180 º Sterická omezení

Ramachandranův diagram povolené kombinace torzních úhlů Polyala polygly Stericky zakázané jsou takové konformace, v nichž kterákoli nevazebná vzdálenost mezi atomy je menší než odpovídá van der Waalsovým meziatomovým vzdálenostem

Prostorové uspořádání bílkovin je fixováno nekovalentními interakcemi Typ interakce Příklad * Vazebná energie (kj/mol) vodíkové vazby: voda (led) -O-H...O= 17 peptidové vazby =N-H...O=C 15 neutrální a nabitá skupina -COO -...HO-CH 2-15 elektrostat. interakce * ion-ion -COO -... + H 3 N- 20-30 interakce dvou permanentních dipolù C + =O -...C + =O - 2 Londonovy dispersní interakce patrové interakce?? hydrofobní interakce ** mezi dvěma alifatickými atomy C mezi dvěma aromatickými kruhy Phe mezi dvěma methylovými skupinami mezi dvěma postranními řetězci valinu 0,11 6 1,2 6

Sekundární struktura proteinů obecné charakteristiky Linus Pauling, Robert Corey (1951) Pravidelné nebo periodické uspořádání polypeptidového řetězce Vzájemné prostorové uspořádání blízkých částí řetězce Fixovány především vodíkovými můstky NH..CO Předpoklady: Peptidová vazba a okolní atomy C α tvoří planární útvar a jsou v trans konfiguraci Vazebné úhly a meziatomové vzdálenosti v proteinech odpovídají těmto veličinám v malých organických molekulách Prostorové uspořádání proteinů vyžaduje tvorbu maximálního počtu vodíkových můstků α-helix a β-struktury

α- helix pravotočivá šroubovice parametry: Stoupání závitu: 0.54 nm 3,6 Ak zbytku/závit Počet atomů 11

Ochota polypeptidového řetězce tvořit helikální struktury závisí na: a) Přítomnosti AK zabraňujících tvorbě α-helixu prolin, hydroxyprolin b) AK s objemnými postranními řetězci c) Iontové interakce závisí na ph př. polylys, polyglu

Skládaný list (β-struktura)

Další pravidelné struktury β-ohyby: -X-gly-pro-Y- X,Y polární AK Pozor: Pravidelné sekundární struktury netvoří celý řetězec

Vyšší pravidelné struktury - motivy

Triosafosfát isomerasa

Terciární struktura Prostorové uspořádání vzdálených částí řetězce Fixace disulfidovými můstky a nekovalentními interakcemi!!

Terciární struktura Prostorové uspořádání všech částí Správné uspořádání je podmínkou funkce (biologické aktivity) Zahrnuje: nevazebné interakce disulfidové můstky nebílkovinné složky rentgenostrukturní analysa Karbonanhydrasa Domény globulární nižší obsah sek. struktur, core x obal, fibrilární vláknité, tyčovité, dlouhé úseky sekundárních struktur

Domény Kvarterní struktura uspořádání podjednotek

Kvarterní struktura hemoglobinu

Příklady bílkovin s kvarterní strukturou Bílkovina Rel.mol.hm oligomeru (Da) Počet podjednotek Charakter, funkce hemoglobin (lidský) 64 500 4 2 + 2 podjednotky dvou typů ( 2 2 tetramer), přenos kyslíku -amylasa (lidská) 97 600 2 identické podjednotky, enzym (hydrolytické štěpení škrobu) alkoholdehydrogenasa (kvasinky) 150 000 4 enzym (katalysuje redukci acetaldehydu na ethanol) ferritin (lidský) 480 000 20 skladování železitých iontů glutaminsynthetasa (E.coli) 592 000 12 enzym (synthesa Gln z Glu), kulovité podjednotky tvoří 2 šestiúhelníky umístěné nad sebou pyruvátdekarboxylasa (E.coli) 4 400 000 72 enzymový komplex, podjednotky 3 typů, každá katalysuje jednu dílčí reakci hemocyanin (plži) 8 000 000 160 metaloprotein obsahující Cu 2+ ; přenos O 2 ; dutý válec 40x40 nm virus tabákové mozaiky 39 300 000 2130 helikálně uspořádané identické podjednotky (rel.m.h. 17 500) tvořící komplex s RNA

Levinthal s Paradox: Skládání (svinování) proteinů We assume that there are three conformations for each amino acid (ex. α-helix, β-sheet and random coil). If a protein is made up of 100 amino acid residues, a total number of conformations is 3 100 = 515377520732011331036461129765621272702107522001 5 x 10 47. If 100 psec (10-10 sec) were required to convert from a conformation to another one, a random search of all conformations would require 5 x 10 47 x 10-10 sec 1.6 x 10 30 years. However, folding of proteins takes place in msec to sec order. Therefore, proteins fold not via a random search but a more sophisticated search process.

Skládání (svinování) proteinů - neprobíhá náhodným způsobem - probíhá postupně: 1. malé dočasné periodické struktury 2. supersekundární struktury, strukturní domény a "roztavená" glubule 3. Nativní struktura - závěrečné úpravy za účasti enzymů (peptidylprolin-cis-transisomerasa, proteindisulfid-isomerasa) - Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky? Chaperony

[ ] [deg.cm 2.dmol -1 ] Vlastnosti proteinů Jsou málo stabilní - denaturují Nábojové vlastnosti Rozpustnost v závislosti na pi Denaturace ztráta nativní konformace Kooperativita (denaturační přechod) Příklad: teplotní denaturace -3500 F D -4500-5500 -6500-7500 Faktory způsobující denaturaci Fyzikální teplo, záření Chemické organická rozpouštědla, soli, kyseliny, zásady, chaotropní činidla (močovina, quanidin HCl), detergenty -8500 F N 20 30 40 50 60 70 80 teplota [ C]

Kooperativita (příklad hemoglobin x myoglobin) aneb jak struktura ovlivňuje funkci proteinů

Symetrický model popisuje chování hemoglobinu Kooperativní vazba O 2 na Hb je řízena allosterickým efektem vazba jednoho ligandu je ovlivněna vazbou dalšího ligandu (efektoru, modulátoru) o protein je oligomer o protein existuje ve dvou stavech R a T o T stav má nižší afinitu k ligandu

Příklady struktury některých proteinů Imunoglobuliny = protilátky Funkce obraný, imunitní systém Základní pojmy: antigen, hapten, epitop

Myosin molekulární motor

α-keratin Gly, ser, cys Protofibrily propojeny S-S můstky

β-keratin (fibroin z hedvábí)

Kolagen 1/3 Gly, 1/5 Pro or Hyp Triplet Gly-X-Pro (nebo Gly-X-Hyp) se často opakuje Levotočivá šroubovice, 3 AK zbytky /otáčku Superšroubovice pravotočivá ze 3 levotočivých helixů LH RH