Současné možnosti vakcinační prevence lymeské boreliózy Weigl, E., Křupka, M., Raška, M. LF UP lomouc, 2012
Lymeská borelióza je chronické multisystémové infekční onemocnění klinicky popisované pod různými názvy již v druhé polovině 19. století Příklad: Garin-Boujadoux- Bannwarth syndrome
Počátkem padesátých let bylo žjištěno, že klinický obraz chroby může být ovlivněn antibiotiky
Borrelia burgdorferi byla objevena v roce 1982 Williamem Burgdorferem během oligoarthritické epidemie ve městě Lyma, Connecticut, USA
Člověk je koncový článek vývoje bakterií není přirozený hostitel U přirozených hostitelů probíhá infekce většinou asymptomaticky
Teoretické možnosti jiných vektorů?
Klinický průběh lymeské boreliózy U 10-15% pacientů progreduje onemocněné bez ohledu na správně aplikvanou atb terapii
Elektronová mikroskopie B. burgdorferi délka 20-30 µm, šířka 0.2-0.3 µm, bičíky 7-11 Barbour-Stonelovo-Kelyovo médium
Alternativní morfologické formy B. burgdorferi
Druhový komplex Borrelia burgdorferi Species Patogenita pro člověka Výskyt B. burgdorferi sensu stricto Potvrzená, USA i Evropa USA a záp. Evropa B. garinii Potvrzená, Evropa Evropa včetně ČR, část Asie B. afzelii Potvrzená, Evropa Evropa včetně ČR, část Asie B. japonica??? Dálný východ, Japonsko B. andersonii??? Severní Amerika B. tanukii??? Asie B. turdi??? Asie B. valaisiana Potenciální Irsko, Německo, Holandsko B. lusitaniae??? Portugalsko, Tunis, stř. Evropa B. sinica??? Čína B. bissettii Potenciální Severní Amerika
Existuje kauzální souvislost mezi genospecies borelií a klinických obrazem? B. burgdorferi s.s. pojivová tkáně (artritidy) B. garinii - neuroborelióza B. afzelii kožní symtom. (acrodermatitis chronica)
Rozšíření lymeské boreliózy ve světě
rganizace genomu B. burgdorferi s. l. Lineární chromozom (910.725 pb, 853 kódujících sekvencí) lp5 lp17 lp21 cp9 cp26 Cirkulární plazmidy lp25 lp28 (1 4 kopie) lp36 lp38 lp49 lp56 Cp 32 (7 kopií) Lineární plazmidy Plazmidy celkem 430 kódujících sekvencí
Genom B. burgdorferi Chromosom 5 x menší než u E. coli Lineární plasmidy nesplňují obecně platná pravidla pro pojem plasmid přesnější by byl asi pojem minichromozom Horizontální přenos Mechanismy variability
Relaps fenomenon Týká se proteinů kontrolovaných z plazmidů Antigenní variace jsou ovlivňovány selekčním tlakem prostředí a mohou být reakcí nejen na imunitní odpověď hostitele, ale též např. na terapii, případně na změnu podmínek vnějšího prostředí. Důsledkem této proměnlivosti je skutečnost, že i v jedné přírodní lokalitě se mohou nacházet kmeny různých serotypů. Tato skutečnost se odráží nejen v průběhu onemocnění u infikovaného jedince, ale může mít také zásadní význam pro protektivní imunizaci.
Mlčící kazety Exprese proteinu VlsE (Vmp-like sequence, expressed) gen se skládá z 15 neexprimovaných genových kazet a jednoho expresního místa rekombinací mezi jednotlivými kazetami vzniká funkční gen zdroj antigenní variability. Rekombinace nastává pouze in vivo.
Nutnost vyrovnat se s výrazně rozdílnými podmínkami - Trávící trakt klíštěte - Adheze ke stěně trávicí trubice - Přechod do slinných žláz a dále do organismu obratlovce - Krevní oběh a tkáně hostitel - Mechanismy nespecifické imunity (komplement, fagocyty) - Mechanismy specifické imunity (protilátky) - Adheze a penetrace do tkání
Interakce s imunitním systémem člověka
Mechanismy účastnící se adheze a penetrace do tkání Průnik extracelulární matrix Exprese DbpA a DbpB (Decorin binding protein) proteiny vázající decorin proteoglykan asociovaný s kolageními vlákny v pojivové tkání Fibronectin binding protein (BBK 32) protein schopný vázat glykoprotein fibronectin vyskytující se v plasmě a extracelulární matrix Borrelia glycosaminoglycans binding protein (Bgp) protein vázající se na glykosaminoglykany pojivové tkáně
Mechanismy úniku účinkům nespecifické imunity CRASP (complement regulator-acquiring surface proteins) Erp (uter surface protein E/F related proteins). Tyto proteiny interagují s faktorem H a H like proteinem komplementové kaskády jako kofaktory degradace C3b borelie jsou tak chráněny před opsonizací a tvorbou membrane attacking complex. Schopnost přežívat v prostředí s nedostatkem iontů železa eliminace metaloproteinů připadně náhrada Fe Mn
Mechanismy úniku účinkům specifické imunity Protein Salp 15 ze slin klíštěte inhibuje aktivaci CD 4 + lymfocytů blokací funkce Lck kinázy v kaskádě přenosu signálu z receptoru CD 4
První vakcína byla vyvinuta pro psy v USA (1990). Vakcína je celobuněčná, inaktivovaná chemickou cestou. Tato vakcína nebyla doporučena pro humánní použití.
Veterinární vakcíny proti Lymeské borelióze Vakcína Stát Složení Merilym Německo Lyzát + adjuvans Rekombitek USA rspa LymeVax USA Lyzát + adjuvans GalaxyLyme USA Lyzát + adjuvans ProLyme USA rspa + adjuvans Biocan B Česká republika Lyzát + adjuvans
Pro vývoj lidské vakcíny bylo významné zjištění, že k protekci organismu je dostatečná indukce humorální imunitní odpovědi. Byla tak naznačena možnost vývoje subjednotkové vakcíny.
Lidská subjednotková vakcína: povrchový antigen spa 1998-2002 LIMErix Smith Kline Beecham USA
Mechanismus účinku spa vakcíny vakcína spa krev klíště ztrácí infekciozitu anti spa
TRSPA receptor a SALP 15 protein Hovius, J.W. 2007
Vnější povrchový antigen A (SPA (B)) je hlavím povrchovým antigenem, který je exprimován, když je B. burgdorferi rezidentní v klíštěti. V okamžiku, kdy klíště začne nasávat krev na savcích, je syntéza tohoto antigenu reprimována. Naopak je indukována syntéza antigenu spc. Takto se spc stává hlavním antigenem vnější povrchové membrány včasné fázi infekce.
Přesmyk povrchových antigenů během sání klíštěte 24 C > > 24 C změna teploty spa spc
Mohou mikrobiální mimikry indukovat autoimunitní reakci? spa 165-173 AMK Borélie Člověk Human Leukocyte Fusion Associated Protein 332-340 AMK
uter surface protein C Borrelia sp. - membránový lipoprotein, M. W. nativního proteinu 23 kda - struktura z větší části helikální (čtyři dlouhé helikální úseky a jeden kratší) - v membráně Borrelií se vyskytuje ve formě dimeru, v membráně kotven lipidovou částí - jeden z hlavních povrchových antigenů, prokázána možnost indukce protektivní odpovědi - význam při kolonizaci savčího hostitele Produkce spa Produkce spc Cesta přenosu
Molekulární struktura spc Skládaný list α helix Lipidizační sekvence Imunodominantní epitopy Kumaran D et al.(2002). The EMB Journal 20 (5): 971 978.
spc protein je vysoce stabilní během infekce, je však značně variabilní v přirozené populaci borélií
Sekvenční diference spc Asociace s virulencí < 2% 8% >14 % Celkem 21 alelických skupin (A-U). Asociace s virulencí: skupiny A,B, D,E a K jsou nejčastějšími patogeny člověka Seinost et al.1999
Variabilita spc antigenů 1. 21-23 alelických skupin nebo typů 2. Variabilita je koncentrována do domén, které jsou současně významnými antigenními epitopy 3. Epitopy jsou lineární
Variabilita hlavních proteinů Species spa types spc types DbpA types A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, Borrelia 1 L, M, N,, P, burgdorferi s. s. Q, R, S, T, U, I 72a, Szid Borrelia afzelii 2 Borrelia garinii 3, 4, 5, 6, 7, 8 Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25 Smar, Pli, H13, PFiM, Pmit, Pki, Pbes, HT22, Phez, Pwa II III, IV
Rekombinantní spc vakcinační konstrukty 1. Tetravalentní vakcína - použity spc z alelických skupin A,B,K a D (Earnhart,Ch.G., Marconi,R.T. Vaccine 2007) 2. ktavalentní vakcína rozšířena o skupiny E,N,I a C Earnhart,Ch.G., Marconi,R.T. Human Vaccine 2007
Variabilita hlavních proteinů Species spa types spc types DbpA types A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, Borrelia 1 L, M, N,, P, burgdorferi s. s. Q, R, S, T, U, I 72a, Szid Borrelia afzelii 2 Borrelia garinii 3, 4, 5, 6, 7, 8 Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25 Smar, Pli, H13, PFiM, Pmit, Pki, Pbes, HT22, Phez, Pwa II III, IV
Naše experimenty s polyepitopovou spc vakcínou Základní problémy: 1. Dostatečná exprese 2. Imunogenita 3. Nosiče 4. Adjuvans
Exprese nelipidované formy spc MKKNTLSAILMTLFLFIS CNNSGKDGNTSANSADE. - lipidizovaná forma obtížně exprimovatelná v E.coli - nelipidizovaná forma jen slabě antigenní R H 2 C C C CH S MKKNTLSAILMTLFLFIS CNNSGKDGNTSANSADE. R H 2 C C R R C CH S R C NH CNNSGKDGNTSANSADE.
Efektivita exprese po odstranění lipidizační sekvence
Exprese rekombinantního spc Připraveny dva genové konstrukty lišící se pozicí His-tagu, proteiny byly exprimovány v E. coli, purifikovány metaloafinitní chromatografií a zbaveny endotoxinu fázovou separací spc C-term (plasmid pet101) ATG spc His spc N-term (plasmid pet200) ATG His spc
Konstrukce vakcinačního antigenu s adjuvans Lipidové spojky H H N spc rekombinantní konstrukt - vlastní antigen H N H H N H Polyhistidinová kotva Metalochelatační zakončení Lipozomový nosič - fosfolipidy Muramyl dipeptid molekulární adjuvans
Transmision electron microscope photographs of A: liposome B. Imunogold labeled spc on the surface of liposome
Vakcinace spc proteiny Experimentální skupiny složeny z 5 myší Balb/c, vakcinace opakována po 14 dnech 14 dni po druhé dávce odebráno sérum Skupina/použitá vakcína A - N-term volné spc B - N-term AlH C - N-term Montanid D - N-term MT06 liposomy E - N-term MPLA liposomy 1 - C-term volné spc 2 - C-term AlH 3 - C-term Montanid 4 - C-term MT06 liposomy 5 - C-term MPLA liposomy Kontrola sérum myší vakcinovaných proteinem p24-hsp70 MPLA monofosforyl lipid A MT06 netoxický derivát muramyl dipeptidu AlH Alum adjuvans užívané v humánní medicíně Montanid komerční adjuvans
Hodnocení vakcinační účinnosti 1. ELISA test u myší 2. Westernblott 3. Imunofluorescenční potvrzení vazby protilátek na buňky B. burgdorferi Pozn. Mikrobicidní testy provedeny nebyly
Analýza anti-spc IgG2a protilátek metodou ELISA
Děkuji za pozornost