METODY VYŠETŘOVÁNÍ BUNĚČNÉ IMUNITY Veřejné zdravotnictví
METODY VYŠETŘOVÁNÍ BUNĚČNÉ IMUNITY průtoková cytometrie metody stanovení funkční aktivity lymfocytů testy fagocytárních funkcí
Průtoková cytometrie analýza jednotlivých buněk v suspenzi vlastnosti buněk (velikost, granularita, životnost,...) exprese povrchových membránových znaků obsah DNA a jiných intracelulárních molekul
Značení buněk pro průtokovou cytometrii PŘÍMÉ ZNAČENÍ excitace (laser) emise fluorescence fluorochromem značená mab membránový marker
Průtokový cytometr PE-Cy7 detektory fluorescence FITC APC PE optická soustava LASER detektory FSC SSC označené buňky PC analýza
Rozdělení leukocytů podle velikosti a granularity granulocyty scattergram monocyty lymfocyty
Dvojbarevné značení dot plot
Počet buněk FITC M1 histogram FITC FITC FITC FITC FITC Intenzita fluorescence
Uplatnění průtokové cytometrie fenotypizace buněk diagnostika primárních imunodeficitů (SCID, Brutonova agamaglobulinémie, Hyper-IgM syndrom) diagnostika leukémií a lymfomů monitorování odpovědi na léčbu sekundárních imunodeficitů (AIDS)
CD4 FITC CD8 PE Fenotypizace lymfocytů CD3+/CD4+ Th lymfocyty (52-69%) CD3+/CD8+ cytotoxické lymfocyty (27-46%) CD16+/CD56+ NK buňky (4-18%) CD19+ B lymfocyty (7-18%) 10 0 10 1 10 2 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD3 APC 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD3 APC
zdravá kontrola Diagnostika Hyper-IgM syndromu CD8 pacient CD8
Funkční testy lymfocytů proliferace cytotoxicita sekrece cytokinů
Izolace lymfocytů z krve gradientová centrifugace (oddělení buněk podle rozdílů v jejich hustotě) + trombocyty MONOCYTY
Proliferační test 3 H- tymidinový test kultivace izolovaných lymfocytů v médiu se stimulačními látkami (3-7 dní/37 C) inkubace s radioaktivně značeným tymidinem ( 3 H) inkorporace 3 H- tymidinu do DNA proliferujících lymfocytů detekce -záření čím proliferace, tím naměřená radioaktivita
Uplatnění funkčních testů lymfocytů (1) proliferační testy monitorování buněčné imunity (sekundární imunodeficity, chemoterapie, pooperační stavy) výzkum (imunoterapie nádorů, farmakologie)
Cytotoxické testy vyšetření schopnosti T lymfocytů a NK buněk zabíjet nádorové buňky CTL test založený na uvolňovaní radioaktivního chromu ( 51 Cr) z nádorových buněk nádorová buňka
Provedení testu s 51 Cr izolované lymfocyty + inkubace (37 C/3,5h) nádorové buňky inkubované s 51 Cr výpočet % cytotoxické aktivity 100x (aktivita vzorku-spon)/(max-spon) 51 Cr detekce -záření v supernatantu
Cytotoxická aktivita NK buněk Dox Dox-HPMA Splenocyty myší s SW 620 kolorektálním karcinomem Kont Říhová et al., Journal of Controlled Release
Stanovení sekrece cytokinů ELISPOT kvantifikace T lymfocytů reagujících na antigenní podnět sekrecí konkrétních cytokinů počet spotů v jamce = počet buněk sekretujících cytokiny
ELISPOT primární Ab proti cytokinu cytokin ly sekundární Ab značena biotinem streptavidin-enzym substrát
Uplatnění funkčních testů lymfocytů (2) cytotoxické testy testování nových léků (imunoterapie nádorů) ELISPOT monitorování antigenně specifických T lymfocytů v průběhu infekčních chorob
Testy fagocytárních funkcí test ingesce testy oxidačního vzplanutí
Test ingesce (1) substrát Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, polymerové partikule suspenze partikul nebo kvasinek + plná krev (inkubace 37 C/1hod) zhotovení krevního nátěru fixace a barvení odečítání ve světelném mikroskopu
Test ingesce (2) hodnocení 100 buněk, pozitivní obsahují 3 a více pohlcených částic fagocytární aktivita % fagocytů s pohlcenými částicemi ze všech fagocytujících buněk fagocytární index průměrný počet částic pohlcených jednou buňkou
Oxidační vzplanutí vyšetření schopnosti fagocytů tvořit kyslíkové radikály (aktivace NADPH oxidázy) DHR-123 test plná krev + forbolové estery + dihydrorhodamin vznik rhodaminu (působení ROI) cytometrické měření intenzity fluorescence
Diagnostika CGC zdravá kontrola pacient s X-CGC