Pokroky v prenatální diagnostice Cytogenetická laboratoř Brno, s.r.o Brno, 8.11.2016
Historie prenatální diagnostiky Do počátku 20. století stetoskop, palpace Začátek 20.století RTG 50. a 60. léta 20 století UZ (II. Trimestr gravidity) Rok 1970 poprvé se zdařila kultivace plodové vody v ČR (ve světě 1966) Rok 1971 první prenatální diagnostika Downova sy (ve světě 1968) Rok 1980 první CVS, screening II. trimestru Rok 1990 screening I. trimestru Prenatální diagnostika = cytogenetické laboratorní vyšetření Prenatální diagnostika
Prolínání oborů: embryologie, gynekologie, porodnictví, ultrasonografie, biochemie, klinická genetika, biostatistika, bioinformatika Klinická genetika v prenatální diagnostice Genetická poradenství Genetické testy Preventivní a léčebná opatření Prenatální diagnostika
Genetické poradenství Diagnostické hodnocení, sestavení rodokmenu, (rodinná anamnéza) Odhad rizika opakování chorob v rodině Nabídka řešení možnost prenatální diagnostiky Genetické testy Cytogenetické x molekulárně-genetické Diagnostické testy pro stanovení dg x presymptomatické x prenatální Reprodukční genetika Integrace reprodukční medicíny, asistované reprodukce a vývojové genetiky Prenatální genetická a prekoncepční vyšetření párů s různými poruchami reprodukce Preimplantační genetická diagnostika Prenatální diagnostika v I. a II.trimestru gravidity Klinická genetika
Soubor metod a postupů využívaných u ještě nenanarozeného dítěte s cílem včasného odhalení závažných VVV Cílem není jen odhalit VVV a umožnit ukončení těhotenství, ale: Informovaný výběr dalšího postupu U párů s vysokým rizikem narození dítěte s konkrétním postižením nabízí možnost ověření, zda plod je či není nositelem postižení V situaci před narozením postiženého dítěte nabídnout optimální postup z hlediska péče o těhotenství, vedení porodu a postnatální péče Umožnit případnou prenatální léčbu postiženého plodu Prenatální diagnostika VVV
Definice pojmu Strukturální, funkční nebo vývojová abnormalita přítomná při porodu nebo později během života, způsobená genetickými nebo negenetickými faktory působícími před porodem V ČR cca 3-4% narozených dětí Primární a sekundární prevence vzniku VVV Vrozené Vývojové Vady
Rozdělení vrozených vad PODLE MECHANISMU VZNIKU: Malformace způsobeny abnormálním vývojem orgánu/tkáně, přičemž tento vývoj byl abnormální od samého začátku Disrupce způsobeny patologickým procesem, který naruší vývoj orgánu, který původně probíhal normálně, např. cévní poruchy vedou k atresii střeva Deformace způsobeny zásahem zevní síly (fyzického charakteru), která poškodí doposud zdravý orgán (např. komprese v amniové dutině) Dysplazie abnormální uspořádání buněk, formujících daný orgán PODLE ČETNOSTI A KOMPLEXNOSTI: Izolované vady např. izolovaná polydaktylie Sekvence mnohočetné vady, vznikající jako následek patologické kaskády dějů (např. sekvence Potterové, Robinova) Asociace nenáhodný výskyt dvou nebo více vad, které se často vyskytují společně (např. VACTERL) Syndrom komplex fenotypových vlastností, které jsou typické pro definovanou klinickou diagnózu. Je známa příčina a riziko opakovaného výskytu (např. Downův syndrom Vrozené Vývojové Vady
Příčiny vrozených vad Genetické faktory (30%) Chromozomové aberace (numerické, strukturní, 6-7%) Genové mutace Zevní faktory (faktory prostředí) 10% Biologické Chemické Fyzikální Multifaktoriální Neznámá etiologie (60%) Neznámá etiologie Multifaktoriální dědičnost Chromozomové abnormality Mutantní geny Faktory prostředí Vrozené Vývojové Vady
Genetické faktory - CHROMOZÓMOVÉ ABERACE Vrozené nebo získané odchylky karyotypu, týkající se struktury chromozómu nebo počtu chromozómů v buňce numerické abnormality Odchylky od normálního počtu chromozomů, gameta haploidní (n) a somatická b. diploidní počet chromozomů (2n) o Euploidie - celý násobek n (diploidie, triploidie, tetraploidie) o Aneuploidie změny počtu chromozomů, trizomie (2n+1), monozomie (2n-1) o Trizomie vznik nondisjunkcí v 1. nebo 2. meiotickém dělení, riziko výrazně roste s věkem matky, většina autozomálních trizomií nedovoluje Přežití (výjimka trizomie 21, 18, 13) o Monozomie přežívá pouze monozomie X strukturní aberace o balancované (zachováno původní množství genetického materiálu) o nebalancované (část materiálu chybí nebo přebývá) Vrozené Vývojové Vady
Genetické faktory GENOVÉ MUTACE
Genetické faktory GENOVÉ MUTACE Monogenní onemocnění Autozomálně dominantní poruchy Autozomálně recesivní poruchy (AR) X- vázané dominantní/recesivní poruchy Vrozené Vývojové Vady
Autozomálně dominantní poruchy Neurofibromatóza (NF), Marfanův Huntingtonova Postihuje syndrom, růst buněk choroba 7-17:10 v nervové (HD), 000 tkáni 5-7:100 000 Příznaky: Onemocnění Poruchy nádory chování, pojivové kůže, vnitřních koordinace, tkáně orgánů s klinickými a dystonie nervů, mohou projevy se objevit v silné orgánových Odumírání bolesti kostí, systémech: neuronů poruchy chování, v zrak, mozku učení, kosterní ztráty a sluchu kardiovaskulární a zraku. Neurofibromatóza systém Nástup kdykoli typ I, běhen 17:10 života, 000 nejčastěji ve středním Mutace Mutace věku v genu NF1 (chr.17) (neurofibromin) ve FBN1 genu (fibrilin) 50% Expanze mutací de novo trinukleotidu CAG v genu pro huntingtin Neurofibromatóza typ II, 1:60 000 Mutace v genu NF2 (chr.22) (merlin) 50% mutací de novo Intrakraniální a intraspinální nádory, hluchota, kožní nádory Achondroplázie (Gly380Arg, FGFR3 gen) Monogenně podmíněné choroby
Autozomálně recesivní poruchy (AR) Cystická fibróza (CF) Mutace v genu CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance regulator), kóduje transport chloridových iontů přes buněčnou membránu Obstrukční plicní onemocnění, nadměrná tvorba hlenu v plicích a v trávicí soustavě Fenylketonurie, srpkovitá anémie. Monogenně podmíněné choroby
X- vázané dominantní/recesivní poruchy Hemofílie A/B Mutace v genu F8 / FIX Porucha srážlivosti krve Syndrom Fragilního X, 1:4000 mužů/1:6000-8000 žen Mutace v UTR oblasti genu FMR1 ( expanze trinukleotidu CGG) Mentální retardace Monogenně podmíněné choroby
Neinvazivní pro matku minimálně zátěžové, nijak neohrožují plod, nepřímo lze stanovit riziko postižení plodu UV a jiné zobrazovací metody vyšetření vzorku krve matky Invazivní pro ženy z geneticky rizikových skupin a v případě rizika zjištěného screeningem; existuje riziko ztráty plodu po výkonu (0,5-1%) k jejich indikaci vypočtené riziko VV plodu musí být vyšší než riziko potratu Ultrazvukem kontrolované metody odběru: Biopsie choria (CVS) od 10.tg Amniocentéza (AMC)-po15.tg Odběr fetální krve punkce pupečníku (kordocentéza)-po 20t.g. fetoskopie Human Embryology, Larsen, 1993 Prenatální diagnostika VVV
Screeningová Cílená Z hlediska časové aplikace. I. trimestr (do 14. týdne gravidity) II. trimestr (do 18. týdne gravidity) III. trimestr (od 19. týdne gravidity) Prenatální diagnostika VVV
Kombinovaný test I. trimestru Biochemie: sérový PAPP A, těhotenský plasmatický protein A volný β-hcg, (podjednotka hcg) UZ: průkaz těhotenství, určení počtu plodů, místa jejich implantace, velikost plodu UZ vyšetření zaměřené na screening Downova syndromu (11.-13. týden), velikost šíjového projasnění = NT (nuchální translucence), přítomnost nosní kůstky Screening I.trim zachytí až 90% VVV Výsledek testu: Riziko 1:50 a více : možnost CVS Riziko nižší než 1:1000 : test negativní Riziko mezi 1:51 až 1:1000: vyšetření dalších markerů: NB, průtok krve na trojcípé chlopni v srdci(tr), v žilní spojce ductus versus (DV), měření frontomaxilárního úhlu (FMF) Kombinovaný test II. Trimestru Biochemie: 16 t.g. Tripple test (pokud nebyl proveden test v I. trimestru) AFP, α-fetoprotein hcg, lidský choriový gonadotropin ue3, nekonjugovaný estriol Stanovení Rh protilátek, infekce UZ (18.-20. týden): vyhledávání VV (hypotrofie plodu, defekty nervové trubice, anomálie močového ústrojí, defekty břišní stěny, srdeční vady, končetinové vady, obličejové defekty včetně rozštěpů) Samostatně : nízký záchyt, vysoká falešná pozitivita III. trimestr UZ (30.-32. týden) růst plodu, uložení a funkce placenty Prenatální diagnostika VVV
Integrovaný test Stanovuje riziko Edwardsova, Downova a Patauova syndromu Věk těhotné Hodnoty PAPP-A, NT v I.trimestru a AFP, hcg, ue3, inhibinu A v II.trimestru Nevýhoda: stres pro těhotné (výsledek testu až po II. trimestrální části screeningu) Integrovaný screening zachytí až 95% VVV Modifikace : sekvenční test Prenatální diagnostika VVV
Ultrazvuková vyšetření I.trimestr Biometrie, anatomie a NT Lze diagnostikovat většinu fetálních malformací, stanovit riziko fetální aneuploidie II.trimestr Nejzásadnější vyšetření v těhotenství Detekce strukturálních defektů plodu, nepřímé UZ markery VVV (gastroschíza, spina bifida, defekt komorového septa, omfalokéla nebo anencefalie III.trimestr Zaměřené na detekci VVV, které se vyvíjejí v pozdějších fázích těhotenství VVV uretropoetického traktu, VVV srdce, VVV gastrointestinálního traktu, VVV mozku, deficity neurální trubice Prenatální diagnostika VVV
Prevence vzniku Primární prevence (pro všechny těhotné) ŽIVOTNÍ STYL Acidum folicum 0,4mg/den před plánovanou graviditou a v I. Trimestru Očkování proti rubeole Sekundární prevence (pro všechny těhotné) PRENATÁLNÍ SCREENING Specifická sekundární prevence (pro indikované skupiny) Speciální metody prenatální diagnostiky UPT z genetické indikace Preimplantační diagnostika Vrozené Vývojové Vady
Indikace ke speciálním prenatálním vyšetřením Speciální vyšetření: Pozitivní screening Věk těhotné >35 let<18 let event. Součet věku rodičů >75 let dnes už VYJÍMEČNĚ Patologický UZ nález u plodu (VVV, hypotrofie..) Balancovaná VCHA v rodině Kontakt se škodlivinami pozitivní ZCHA Prenatální diagnostika VVV
Metody prenatální diagnostiky Invazivní metody odběru biologického materiálu plodu Karyotyp FISH QF PCR acgh Digitální PCR NGS Neinvazivní metody odběru biologického materiálu Detekce aneuploidií pomocí analýzy cffdna (NIPT) Detekce monogenních onemocnění pomocí analýzy cffdna Využití cfrna Využití mirna Prenatální diagnostika VVV
Cytogenetická prenatální diagnostika V I. a II. trimestru gravidity Karyotyp Kondenzované chromozomy v metafázi Kultivace buněk plodu (2 až 3 týdny po odběru) Invazivní technika odběru buněk plodu Techniky karyotypování: G-pruhování Q-pruhování R-pruhování Speciální techniky: C-pruhování, HRT Prenatální diagnostika VVV
46, XX Cytogenetická prenatální diagnostika
46, XY Cytogenetická prenatální diagnostika
46, XY +mar Cytogenetická prenatální diagnostika
Rychlé prenatální diagnostické metody FISH (fluorescenční in situ hybridizace) Vazba fluorescenčně značených DNA sond ke specifickým částem chromozómů na základě vzájemné komplementarity Detekce aneuploidií - interfázní jádra (nekultivované amniocyty) diagnostika strukturálních změn na submikroskopické úrovni (metafázní chromozómy) Výsledek do 48 hod. od odběru plodové vody Prenatální diagnostika VVV
FISH 46, XY + 20p Prenatální diagnostika VVV
acgh arr20p13q11.21(1-30,556,996)x3 Prenatální diagnostika VVV
Rychlé prenatální diagnostické metody QF PCR (quantitative fluorescent polymerase chain reaction) Detekce aneuploidií bez kultivace buněk plodové vody Amplifikace a vizualizace specifických sekvencí DNA (STR) pomocí fluorescenčně značených primerů Multiplexové uspořádání jednotl. STR oblastí Poprvé použita v roce 1993 (Mansfield, 1993) Výsledek do 24 hod. od odběru buněk plodové vody Statim do 5 hodin Prenatální diagnostika VVV
STR markery (ATGC) n 8 repetic 10 repetic
PLOD NORMÁLNÍ KARYOTYP 8 repetic 10 repetic 12 repetic 14 repetic
PLOD TRISOMIE 21 8 repetic 10 repetic 6 repetic??? 12 repetic 14 repetic 16 repetic?
PLOD TRISOMIE 21 8 repetic 10 repetic 10 repetic? 12 repetic 14 repetic 14 repetic?
Detekce aneuploidií pomocí QF PCR
Detekce aneuploidií pomocí QF PCR
Detekce aneuploidií pomocí QF PCR
Detekce aneuploidií pomocí QF PCR
Detekce aneuploidií pomocí QF PCR
Detekce aneuploidií pomocí QF PCR
FISH vs. QF PCR Z hlediska senzitivity a specificity srovnatelné metody FISH náročnější na provedení QF PCR nižší náklady více STR současně schopnost detekovat maternální kontaminaci, nonpaternitu, uniparentální dizomii, zygozitu dvojčat Prenatální diagnostika VVV
Digital PCR Prenatální diagnostika VVV
cfrna Nalézt takové mrna, které by umožňovaly přímou diagnostiku plodu nezávislou na genetickém pozadí matky PLAC4 (Placenta specifický gen), chr. 21 (RNA-SNP) SERPINB2 (serpinový inhibitor peptidáz B5), chr.18 mirna Patří do rodiny malých nekódujících RNA, které se podílejí na postranskripční regulaci genové exprese (inhibicí translace nebo přímou degradací mrna) Placentární mirna (mir517a.) jsou přítomny v plazmě těhotných žen ve vysoké koncentraci Budoucnost: kvantitativní stanovení určitých typů mirna -alternativní marker patologického těhotenství Prenatální diagnostika VVV
MLPA Prenatální diagnostika VVV
Novorozenecký screening Vyhledávání onemocnění na základě stanovení koncentrace specifické látky či průkazu genové mutace v suché kapce krve odebírané všem novorozencům na území daného státu. Testování je zaměřeno na choroby, které pokud se zachytí včas, lze je zásadně ovlivnit. V ČR se nyní testuje cca 13 chorob, např.: CYSTICKÁ FIBRÓZA: výskyt 1:2 500, dědičnost AR, mutace genu zodpovědného za regulaci transmembránové vodivosti, porucha přenosu iontů a solí přes buněčnou membránu, tvorba abnormálně vazkého hlenu, postižení plic, pankreatu; nositelem mutace je v naší populaci každý 25. člověk KONGENITÁLNÍ HYPOTHYREÓZA: výskyt 1:3 000, dědičnost AR, mutace v genech pro jodidové transportéry, bez léčby rychlý rozvoj těžké psychomotorické retardace, při hormonální substituci normální vývoj KONGENITÁLNÍ ADRENÁLNÍ HYPERPLAZIE: -výskyt 1:11 000, dědičnost AR, deficit 21- hydroxylázy, bez léčby adrenální krize, předčasná puberta, hormonální substituce normální vývoj FENYLKETONURIE: -výskyt 1:6 500, dědičnost AR, deficit fenylalaninhydroxylázy, bez diety poškození činnosti mozku, mentální retardace