VAZEBNÁ ANALÝZA Vazba genů Americký genetik Thomas Morgan při genetických pokusech s octomilkami (Drosophila melanogaster) popsal zákonitosti o umístění genů na chromosomech, které existují až do současnosti jedno ze základních genetických pravidel. a) Na každém páru homologních chromosomů existuje stabilní sada genů. Geny jsou na chromosomech uspořádány lineárně. Mají na chromosomu přesné umístění (své lokusy). b) Soubor lokusů jednoho chromosomového páru tvoří vazebnou skupinu. Počet vazebných skupin organismu je shodný s počtem homologiích párů chromosomů; tzn, že člověk má 23 vazebných skupin. c) Mezi geny homologních chromosomových párů může prostřednictvím crossing-overu docházet k výměně genů (alel). Frekvence crossing-overů je přímo úměrná vzdálenosti genů. Pro geny lokalizované na shodném chromosomu platí, že do určité vzdálenosti jejich lokusů nesegregují do gamet podle pravidel Mendelovské dědičnosti o náhodné segregaci genů do gamet. V F2 generaci nebo při zpětném kříž pak nacházíme odlišné fenotypové i genotypové štěpné poměry, než jaké byly popsány Mendelem při lokalizaci dvou genů na odlišných párech chromosomů (viz Dihybridismus). Vazbu mezi dvěma geny je možné sledovat a definovat na pokusných zvířatech (nebo rostlinách) v hybridizačním pokusu (v F2 generaci) nebo při zpětném (testovacím kříž). V lidské populaci matematickým vyhodnocm dědičnosti znaků v souborech rodin. Experimentální ověř vazby genů Zejména zpětné kříž dvojnásobného heterozygota (AaBb) s dvojnásobným recesivním homozygotem (aabb) umožňuje při dostatečném počtu potomků relativně snadno zhodnotit, zda jsou sledované geny ve vazbě, nebo zda se rozcházejí do gamet podle pravidla o volné kombinovatelnosti genů. Hodnoc frekvence fenotypů F2 generace vyžaduje vět soubor pokusných jedinců ve srovnání s hodnocm pomocí zpětného kříž. Při lokalizaci genů dvojnásobného heterozygota na shodném chromosomu alely těchto dvou genů mohou na homologních chromosomech zaujímat dvě odlišné pozice. Na jednom chromosomu mohou být lokalizované dominantní alely obou genů (A a B ) a na homologním chromosomu recesivní alely (a a b) - AB/ab. Nazývá se vazebnou fází cis (coupling). ál Jeho Jeho žit elům m a dal
Fáze cis a b Paternální chromosom Pár homologních chromosomů A B Maternální chromosom Druhá možnost uspořádání genů (alel) je vazebná fáze trans - Ab/aB. Znamená přítomnost dominantní alely jednoho lokusu a recesivní alely druhého lokusu na témže chromosomu. Fáze trans Paternální chromosom a B Pár homologních chromosomů A b Maternální chromosom Pokud jsou geny jedné vazebné skupiny lokalizované na chromosomu do určité vzdálenosti, dědí se uspořádání jejich alel častěji společně než odpovídá náhodné segregaci genů do gamet. Při vazbě genů neplatí Mendelův zákon o náhodné segregaci genů do gamet. Pokud by nedocházelo v profázi prvního meiotického děl ke crossing-overu a výměně genetického álu mezi homologními chromosomy, dědilo by se uspořádání alel genů jedné vazebné skupiny vždy společně. Rekombinace Crossing-over (překříž) nastává v profázi I. meiotického děl jak mezi sesterskými, tak mezi nesesterskými chromatidami homologních chromosomů (viz Meióza). Vede k vzájemné výměně genetického álu, k rekombinacím. Jelikož sesterské chromatidy představují identické kopie, má pro vznik rekombinací význam ze překříž a výměna genetického ál Jeho Jeho žit elům m a dal
álu mezi nesesterskými chromatidami. Výsledkem je jiné postav alel než jaké bylo na homologních chromosomech rodičů (viz výše fáze cis a trans). Rekombinace jsou jednou z příčin, že dal generace může mít jinou kombinaci znaků než rodiče. Obrázek představuje profázi meiózy I. Došlo k synapsi homologiích chromosomů, následoval crossing-over (v tomto schematu překříž nesesterských chromatid). Výsledkem je výměna genetického álu mezi chromosomem původu maternálního a paternálního. Převzato: www.regentspre.org ; text upraven Morganovo číslo, mapová vzdálenost Pravděpodobnost vzniku crossing-overu mezi dvěma lokusy závisí na jejich vzdálenosti. Jestliže jsou dva geny na chromosomu umístěné dostatečně daleko od sebe, dochází mezi nimi ke crossing-overu s 50% pravděpodobností. Alely těchto genů, i když se geny nacházejí na stejném chromosomu, segregují do gamet nezávisle, to znamená s pravděpodobností 25% pro každou kombinaci alel obdobně při lokalizaci dvou genů na různých párech chromosomů. Tuto situaci popisujeme volnou kombinovatelnost. Mezi lokusy, které jsou blízko sebe, dochází ke crossing-overu s frekvencí odpovídající jejich vzdálenosti, vazba mezi takovými lokusy je neúplná. Existují i lokusy, mezi kterými ke crossing-overu nedochází, vazba je úplná a potomci dědí vždy stejné uspořádání alel mají jeho rodiče. ál Jeho Jeho žit elům m a dal
Uspořádání alel na párových chromosomech při zaháj meiózy: fáze trans ab/ab a A B b Paternální chromosom Maternální chromosom Homologní chromosomy Každý se skládá ze dvou sesterských chromatid (geneticky identických) Chromatidy paternálního a maternálního chromosomu jsou chromatidy nesesterské Crossing-over vznik rekombinace a a B b chromatida bez rekombinace chromatida s rekombinací A B chromatida s rekombinací A b chromatida bez rekombinace Ke crossing-overu dochází v profázi I. meiotického děl (pachyten). Crossing-over nastává jak mezi sesterskými tak mezi nesesterskými chromatidami homologních chromosomů. Pro vznik rekombinací má význam překříž nesesterských chromatid. Výsledné kombinace alel dvou genů lokalizovaných na homologiím páru chromosomů gametách Původní vazebná fáze trans A a b B Čtyři gamety redukovaný počet chromosomů Rekombinace nová kombinace alel dvou sledovaných genů a ál Jeho Jeho žit elům m a dal A b B
Četnost rekombinací je funkcí délky a struktury chromosomu. Tato zákonitost je základem pro sestavování rekombinačních (genetických) map. Mapová vzdálenost se udává v jednotkách nazývaných centimorgany (cm). Název vznikl podle genetika T. H. Morgana. Jedna mapová jednotka, jeden centimorgan (1 cm), odpovídá jednomu procentu rekombinací mezi nesesterskými chromatidami dvou sledovaných lokusů. Jednotky mapové vzdálenosti (cm) nejsou shodné se skutečnou fyzikální vzdáleností genů. Vztah mezi počtem rekombinant a skutečnou vzdáleností, udanou v párových bázích genových lokusů, závisí na několika dalch faktorech (je nutné uvažovat možnost např. dvojitých crossing-overů, existuje odlišná četnost crossing-overů na autosomech ženy a muže a dal faktory). Mezi vzdálenými geny dochází pravidelně ke crossing-overu. Důsledkem toho je 50ti procentní pravděpodobnost vzniku rekombinant (mapová vzdálenost 50 cm). V takovém případě tvoří dvojnásobný heterozygot AaBb čtyři typy gamet s následujícími kombinacemi alel: AB, Ab, ab, ab. Gamety vznikají se shodnou pravděpodobností (25%, nebo-li s frekvencí 0,25. Segregace genů do gamet je nezávislá. Recesivní homozygot aabb Gamety (frekvence) ab (1.0) AB AB/ab Heterozygot AaBb ab ab/ab ab ab/ab Ab Ab/ab Tabulka znázorňuje zpětné kříž s frekvencí genotypů. Fenotypové zastoup je: vlastnost A i B má 25% jedinců, vlastnost A, ale nikoliv B má 25% jedinců, vlastnost B, ale nikoliv A má 25% jedinců a vlastnost A ani B nemá 25% jedinců. Při vzdálenosti genů 50 cm je možné stanovit, zda dva geny patří do jedné vazebné skupiny pomocí třetího genu - tříbodovým testem. Pro ilustraci: sledované lokusy označíme A a C. Dal gen označíme B. Mezi lokusy A a C je mapová vzdálenost 50 cm (frekvence rekombinant 0,5 = 50%). Pokud vznikají rekombinanty mezi lokusy A a B a mezi lokusy B a C s men frekvencí než 0,5, pak jsou lokusy A, B, C lokalizovány na stejném chromosomu. Při men vzdálenosti genů se zmenšuje pravděpodobnost vzniku crossing-overu frekvence rekombinant klesá. Četnost rekombinací při neúplné vazbě genů se pohybuje mezi nulou a 50ti procenty v závislosti na vzdálenosti lokusů, to znamená v rozmezí 0 cm 50 cm. ál Jeho Jeho žit elům m a dal
Při neúplné vazbě tvoří dvojnásobný heterozygot čtyři typy gamet, jejich zastoup se však li od poměru 1:1:1:1, typického pro nezávislou kombinovatelnost. Častěji jsou vždy zastoupeny rodičovské kombinace alel. Následující tabulka ukazuje výsledek zpětného kříž (Bc) při neúplné vazbě (mapová vzdálenost 10 cm). Recesivní homozygot aabb Gamety (frekvence) ab (1.0) AB (0.45) AB/ab (0.45) Heterozygot AaBb ab (0.45) ab/ab (0.45) ab (0.05) ab/ab (0.05) Ab (0.05) Ab/ab (0.05) Frekvence rekombinovaných gamet je 10 % (10 cm) a této frekvenci odpovídá zastoup genotypů. Testovací kříž umožňuje matematicky snadněj hodnoc fenotypů, které je následující: vlastnost A i B má 45% jedinců, vlastnost A, ale nikoliv B má 5% jedinců, vlastnost B, ale nikoliv A má 5% jedinců a vlastnost A ani B nemá 45 % jedinců. Celkový počet rekombinant je 10%. Vazebná fáze je cis. Nulové zastoup rekombinant (0 cm) představuje úplnou vazbu genů, kdy mezi geny nedochází ke crossing-overu. Dvojnásobný heterozygot tvoří jen dva typy gamet se shodným postavm alel (se shodnou vazebnou fází) na homologních chromosomech u jeho rodičů. Recesivní homozygot aabb Gamety (frekvence) ab (1.0) Heterozygot AaBb AB (0.5) AB/ab (0.5) ab (0.5) ab/ab (0.5) Při testovacím kříž vznikají ze dvě kombinace genotypů. Fenotypové zastoup je následující: znak A i B má 50% jedinců, 50% jedinců má znak, který odpovídá recesivní alele. Nevznikají rekombinace. Vazebná fáze je cis. Testovací kříž (backcross - Bc) je kříž dvojnásobného heterozygota (AaBb) s dvojnásobným recesivním homozygotem (aabb). ál Jeho Jeho žit elům m a dal
Pomocí testovacího kříž se mapová vzdálenost vypočítá dělm počtu rekombinant (odlišných fenotypů než jaké jsou v parentální generaci) celkovým počtem potomků a násobeným stem: součet rekombinant x 100 součet všech jedinců Genetické poradenství, marker geny Urč vazebných skupin na homologních chromosomech má, mimo jiné, význam v genetickém poradenství. Společná segregace lokusů vazebné skupiny, vazebná analýza, je v klinické genetice jedna z významných diagnostických metod. Pro posouz přenosu mutované alely do dal generace se využívá přítomnosti markeru (znam, značka), který je polymorfní, a který je na chromosomu lokalizován poblíž genu, jehož mutovaná alela podmiňuje dědičné onemocnění. Jako marker gen je vybrán polymorfní a dobře prokazatelný gen, například gen, který kóduje krevně skupinové nebo transplantační antigeny. Polymorfním genem je míněn gen, který se v populaci vyskytuje v odlišných formách (dvě nebo i více možných alel). Čím je mapová vzdálenost mezi marker genem a sledovaným genem men, tím je urč genotypu přesněj. Přesnost stanov genotypu je ovlivněna vznikem rekombinant. Rodokmenová studie Situaci je možné demonstrovat např. na segregaci genů HLA systému, které kódují histokompatibilitní (transplantační) antigeny a jejich vazbě s genem, který kóduje enzym 21- hydroxylasu, enzym nezbytný pro biosyntézu kortisolu (steroidní hormon). Mutace v genu pro syntézu 21-hydroxylasy (AR dědičnost) vede k nedostatku enzymu (deficience 21-hydroxylasy) a tím je blokována biosyntetická dráha odpovědná za regulaci androgenů (hormony). Enzym se tvoří v kůře nadledvin; onemocnění se jmenuje vrozená adrenální hyperplázie, postižena jsou obě pohlaví. U děvčátek, dochází k maskulinizaci vnějho genitálu, vývoj vaječníků je normální. Postiž chlapci mají vněj genitál většinou normální, trpí se zvýšenou frekvencí nádory varlat. Incidence vrozené adrenální hyperplázie je přibližně 1 na 12 500 porodů. Následující obrázek schematicky znázorňuje lokalizaci genů HLA komplexu (viz dále Imunogenetika) a genu kódujícího enzym 21-hydroxylasu, který leží v oblasti molekul III. třídy HLA, která nesouvisí s kódováním transplantačních antigenů, byla je do oblasti HLA ál Jeho Jeho žit elům m a dal včleněna během chromosomálních přestaveb v průběhu evoluce.
Schéma zjednodušené genetické mapy HLA komplexu Chromosom 6 Dlouhá raménka Centromera Krátká raménka Molekuly II. třídy Molekuly III. třídy HLA 6p21.1-21.3 Molekuly I. třídy DP DM DQ DR C4 C2 Hsp TNF B C E A G F Gen kódující 21-hydroxylasu Genetický rozbor založený na vazbě sledovaného genu s marker genem (HLA molekuly I. třídy) je odvozen z rodokmenové studie. Mapová vzdálenost (cm) udává s u pravděpodobností může mezi geny dojít k rekombinaci, čili s u pravděpodobností je závěr rodokmenové analýzy přesný. Rodokmenovou analýzu vazby genu kódujícího enzym 21-hydroxylasu s geny kódujícími histokompatibilitní antigeny probereme podrobně v kapitole zabývající se imunogenetikou. Vazebná analýza - polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Diagnostika založená na polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP restriction fragment length polymorphism) (viz Molekulární genetika Southern-blot) využívá pro detekci mutované a nemutované alely sledovaného genu vazbu genu s restrikčními místy ohraničujícími fragment DNA, na kterém je tento gen lokalizován. Na vláknech DNA se v různé vzdálenosti vyskytují krátká shodná pořadí několika bazí, která představují sled nukleotidů, ve kterém je DNA štěpena specifickým restrikčním enzymem (restriktasou). Restriktasy jsou enzymy, které se přirozeně vyskytují v baktériích. V baktérii jsou schopné štěpit cizorodou dvouvláknovou DNA, např. DNA viru, který baktérii infikuje. V lékařské genetice se restriktasy využívají například pro práci s DNA vyšetřovaných osob. Markerem ál Jeho Jeho žit elům m a dal pro identifikaci fragmentů DNA, které nesou sledovaný gen, je sonda (proba). Sonda je krátký
jednovláknový nebo dvouvláknový úsek DNA nebo RNA označený například zabudovanými radioaktivně značenými nukleotidy. Intragenová sonda má komplementární sekvenci basí k sekvenci basí ve sledovaném genu. Extragenová sonda hybridizuje s komplementární sekvencí basí na fragmentu DNA poblíž sledovaného genu. Přesnost diagnostiky pak závisí na mapové vzdálenosti mezi genem a sondou a i mezi genem a restrikčním místem. Mezi sondou a genem, nebo i mezi genem a restrikčním místem, může docházet ke crossing-overu a vzniku rekombinací. Fragmenty DNA, které vznikají po štěp toutéž restriktasou (např. restriktasou EcoRI - zkratka je odvozena od baktérie, ze které byla restriktasa izolována) mohou mít variabilní délku. Délka fragmentu závisí na vzdálenosti restrikčních míst v molekule DNA. Variabilita ve vzdálenosti restrikčních míst v molekulách DNA u různých jedinců populace vznikla v průběhu evoluce různým typem mutací, například bodovou mutací nebo tandemovými duplikacemi (viz Molekulární genetika). Výsledkem je polymorfismus délky restrikčních fragmentů. RFLP tedy znamená, že se v rámci populace po štěp DNA shodnou restriktasou mohou vyskytovat u jednotlivých členů populace fragmenty různé délky. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů je fyziologický jev. Délka fragmentů je udávána v kilobasích (kb), např. 6.2 kb DNA, 1.8 kb DNA atp. Velikost fragmentů se stanovuje elektroforézou (viz Molekulární genetika metody). Délka restrikčních fragmentů je děděná podle pravidel Mendelovské genetiky. Sledovaný gen může být v populaci identifikovaný specifickou sondou na fragmentech různé délky (polymorfismus), jedinec pak může být buď homozygot nebo heterozygot v délce restrikčních fragmentů. Která alela sledovaného genu bude ve vazbě s fragmentem určité délky je náhodný jev. Genetická analýza metodou RFLP je metoda nepřímá. Vyžaduje rodokmenovou studii, ve které je postižený jedinec, a vyšetř DNA od více členů rodiny. Mezi genem (alelou) a restrikčním místem může dojít ke crossing-overu, jehož důsledkem je vznik rekombinace. Přesnost diagnostiky závisí na vzdálenosti mezi genem a restrikčním místem, to znamená že závisí na frekvenci rekombinací. ál Jeho Jeho žit elům m a dal
Hypotetický polymorfismus ve výskytu druhého restrikčního místa u pěti jedinců v populaci (situace na jednom chromosomu v bezprostřední blízkosti sledovaného genu). extragenová sonda gen Jedinec homozygot v délce restrikčních fragmentů (pár homologních chromosomů) gen sonda gen sonda Jedinec heterozygot v délce restrikčních fragmentů (pár homologních chromosomů) gen gen sonda sonda Přítomnost dominantní nebo recesivní alely n podmíněná délkou fragmentu, jsou to dva na sobě nezávislé jevy. V rodině se dědí konkrétní alela genu ve vazbě s určitou délkou fragmentu. Vazebnou jednotku může porušit crossing-over během gametogeneze. Rodokmenová analýza založená na RFLP se řídí pravidly Mendelovské dědičnosti. Dále bere v úvahu jednotky mapové vzdálenosti mezi sledovaným lokusem a polymorfním restrikčním ál Jeho Jeho žit elům m a dal
místem. Jednu z možných situací u autosomálně dominantně děděného onemocnění ukazuje následující schéma. I 1 2 II 6.2 kb 4 1 2 3 4 5 4 1.8 kb Oba rodiče jsou heterozygoti v délce restrikčních fragmentů. Otec je zdráv, tedy recesivní homozygot (aa) v alelách příslušného genu; postižená matka je heterozygotka Aa. Mutovanou alelu (dominantní) přená postižená matka na fragmentu dlouhém 1,8 kb, alela recesivní (nemutovaná) je u obou rodičů na fragmentu dlouhém 6,2 kb. U zdravého otce (recesivního homozygot) je na fragmentu 1,8 kb také nemutovaná (recesivní) alela. Stanov vazby mutované alely s fragmentem 1,8 kb vyplynulo ze situace, kdy jejich postižené děti II/1 a II/3 jsou postižené (Aa) a zároveň homozygoti pro fragmenty dlouhé 1,8 kb. Zdravá dcera II/2 je homozygotka v délce fragmentů 6,2 kb a má genotyp aa. Stejně tak chlapec II/4 i druhá dcera II/5. Výsledek vyšetř je plně informativní, poskytuje informaci o genotypu všech členů rodiny. V jiné rodokmenové studii (jiná rodina) může být výsledek nepřímé diagnostiky jen částečně informativní (jen z poloviny- buď ze strany otce nebo matky) a nebo může nastat situace, že rodina informativní n, tzn., že nelze stanovit genotypy potomků. Na stejném schematu autosomálně dominantně děděného onemocnění je znázorněna situace částečně informativní vazebné analýzy. ál Jeho Jeho žit elům m a dal
I 1 2 II 6,2 kb 1,8 kb 41 2 3 4 5 4 Oba rodiče jsou heterozygoti v délce restrikčních fragmentů. Otec je zdráv, tedy recesivní homozygot (aa) v alelách příslušného genu; postižená matka je heterozygotka Aa. Mutovanou alelu (dominantní) přená postižená matka na fragmentu dlouhém 1,8 kb, alela recesivní (nemutovaná) je u obou rodičů na fragmentu dlouhém 6,2 kb. U zdravého otce (recesivního homozygot) je na fragmentu 1,8 kb také nemutovaná (recesivní) alela. Stanov vazby mutované alely s fragmentem 1,8 kb vyplynulo ze situace, kdy jejich děti II/1 a II/2 jsou postižené (Aa) a zároveň homozygoti pro fragmenty dlouhé 1,8 kb, z nichž fragment zděděný od matky nese mutovanou dominantní alelu. Zdravá dcera II/3 je homozygotka v délce fragmentů 6,2 kb a má genotyp aa. V dalm těhotenství jsou oba plody (dvojčata) heterozygoti v délce restrikčních fragmentů. Nelze určit od kterého z rodičů zdědily fragment dlouhý 1.8 kb a od kterého fragment dlouhý 6.2 kb. To znamená, že nejsme schopni pomocí RFLP určit jejich genotyp. Ten je s 50 % pravděpodobností v daném genu aa nebo Aa. Výsledek vyšetř je částečně informativní, neposkytuje informaci o genotypu dvojčat II/4 a II/5. Mapování Mapování je urč pozice genových lokusů na chromosomech. Mapování a stanov pořadí nukleotidových basí (sekvencování) má bezprostřední význam pro medicínu a farmakogenetiku. Znalost umístění genu na chromosomu je nezbytná pro DNA diagnostiku. Sekvencování umožňuje určit strukturu genu a identifikovat v genu mutace. Na základě těchto znalostí je pak možné hledat nové cesty ke kauzální terapii. Fyzikální a genetická mapa ál Jeho Jeho žit elům m a dal
Fyzikální (skutečná) mapa udává v absolutních hodnotách pozici genových lokusů, vzdálenost stanovenou například identifikací lokusu na základě hybridizace s odpovídající sondou (viz Cytogenetika metoda FISH) a dále vyjádřenou počtem párů basí (viz dále Molekulární genetika - sekvencování). Genetická mapa udává relativní pozici genového lokusu podle frekvence rekombinací. Vzdálenosti jsou udávány v centimorganech. Pomocí rekombinačních studií byla stanovena délka lidského genomu 3000 cm. Haploidní genom představuje 3 x 10 9 párů basí, jeden cm odpovídá přibližně 10 6 párům basí (1 Mb). Vztah mezi genetickou mapovou jednotkou a skutečnou vzdáleností lokusů n lineární. Například v oocytech se vyskytují rekombinace přibližně dvakrát častěji než ve spermatocytech, a proto je genetická mapa u žen o 40 procent del než u mužů. Genetická mapa znázorňuje schematicky lokalizaci jednotlivých genů na chromosomu. Pro DNA diagnostiku je také významná restrikční mapa. Restrikční mapa je mapa restrikčních míst na určité molekule DNA pro jednu nebo více restrikčních endonukleas. DNA rozdělená na jednotlivé fragmenty je pak dále detailně analyzována (např. sekvencováním) a informace o jednotlivých fragmentech jsou pak kompletovány v rámci jednotlivých chromosomů. Projekt mapování lidského genomu (Human Genome Project) V roce 1986 vznikl mezinárodní projekt pro identifikaci lidského genomu. Jeho cílem je sestavit jak fyzikální, tak genetické mapy všech 22 autosomů a heterochromosomů. Má umožnit identifikaci genů a i jejich izolaci. Lidský genom podle posledních údajů obsahuje 22 000 25 000 genů. Mezinárodní úsilí je koordinováno organizací nazvanou HUGO (Human Genome Organization). Organizace pořádá pracovní porady a na základě nových výsledků, sestavuje seznam všech zmapovaných lidských genů. Každoročně vydává inovovaný informativní katalog, plynule ňuje údaje do počítačové sítě. ál Jeho Jeho žit elům m a dal