Některé vlastnosti DNA důležité pro analýzu

Transkript

1

2

3 Některé vlastnosti DNA důležité pro analýzu Spiralizace Denaturace Záporný náboj Syntéza Ligace Rekombinace Mutabilita Despiralizace Reasociace Štěpení

4 Metody používané k analýze DNA Southern blotting PCR Klonování v plazmidech Elektroforéza Analýza na kapilární elektroforéze Microarray technologie Sekvencování

5 Southern blotting

6 PCR

7 PCR

8 Využití PCR

9 Alelo-specifická PCR

10 TaqMan assay

11 Inverzní PCR

12 Klonování v plazmidech

13 Elektroforéza Horizontální, separace v agarózovém gelu Vertikální, separace v polyakrylamidovém gelu Denaturační gradientní gelová elektroforéza, SSCP 2D gelová elektroforéza Kapilární elektroforéza

14 Separace molekul v kapilární elektroforéze

15 Detekce fluorescence v KE

16 Využití kapilární elektroforézy při prenatální diagnostice Vodička R., Vrtěl R., Krejčiříková E., Čapková P., Adamová K. Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny FN Olomouc

17 Microarray technologie

18 Sekvencování

19 Sekvencování

20 Aplikace metod analýzy DNA na našem pracovišti Cystická fibróza, deltaf508, del2,1 Využití kapilární elektroforézy v PD Detekce mikrodelecí na Y chromozomu u sterilních mužů Kvantifikace Y pozitivních pacientek s TS Analýza mutací genů TSC1 a TSC2 u pacientů s tuberózní sklerózou Huntingtonova chorea

21 Možnosti využití QF PCR v PD

22 Základní metodika

23 Detekce aneuploidií využití STR

24 Využití mikrosatelitních sekvencí (STR) ke stanovení počtu alel 2-4 bp opakující se jednotka Po celém genomu Velká variabilita délky Heterozygozita v populaci Předpoklad: 1alela = 1 chromozom; Pečlivý výběr vhodných primerů

25 Výběr vhodných lokusů a sestavení funkčních multiplexů 21, 21 21, 18 X/Y, Y, 13 18, 13

26 Rozmístění STR lokusů v karyotypu 46,XY D13S631/13q31-32 D18S535/18q MBP/18q23 D21S1411/21q22.3 D21S1412/21q22.3 D21S1414/21q21 AMX/p22.3 DYZ3/centromera AMY/q11.1

27 QF PCR v lokusech D21S1414 a MBP (18) D21S1414 Trizomie 21

28 Srovnání fyziologického nálezu s trizomií 21 QF PCR

29 Prenatální detekce aneuploidií: Cytogenetika vs. FISH vs. QF PCR Získaná informace Finance Pracnost Čas

30 Posun limitů QF PCR v r.2003 možnost účinně detekovat i vzácné gonozomální mozaiky - vytvoření kalibrační křivky ze vzorků s různým poměrem gonozomální mozaiky možnost hodnotit vzorky s příměsí maternální krve paralelní vyšetření DNA z periferní krve matky

31 Stanovování mozaik různým ředěním DNA byly vytvořeny umělé mozaiky, podrobeny PCR a odebrány po jednom cyklu v rozmezí PCR cyklů kalibrační křivka pro odečtení mozaik byla sestrojena z geometrických průměrů podílů RFUX a RFUY v jednotlivých mozaikách Ln (RFUY/RFUX + 1) Ln (RFUY/RFUX+1) = (Mosaics, %) Mozaic (% ) Model regression line 95% confidence for calibration predictions Experimental data: mean estimates Experimental data: range of values

32 Analýza kontaminovaných vzorků Paralelní analýza DNA plodu a matky s použitím shodných STR lokusů Vyhodnocení výstupů z KE

33 Srovnání výstupů z kapiláry plod vs. matka Lokus D21S1435 dvojče A dvojče B matka Lokus D21S1446 dvojče A dvojče B matka

34 Prenatální detekce aneuploidií pomocí QF PCR od roku 2001 Celkový počet vyšetření 164 Trizomie 21 3 Trizomie 18 6 Trizomie Falešně pozitivní 0 Falešně negativní 1 Celkem 10 nalezených patologií ze 164 = 6,09 %

35 FISH a QF PCR Rychle dostupný výsledek Malé množství výchozího materiálu Možnost zpětného vyšetření uložených vzorků (odpadá nutnost opakovaného odběru)

36 Srovnání efektivnosti FISH a QF PCR FISH QF PCR Rychlost Pracnost Finační náročnost malé množství materiálu velmi malé množství ( 3-5 ml) materiálu (0.5-1 ml) vhodné pro čerstvé preparáty vhodné k detekci mozaik vzorky kont. maternální krví nelze hodnotit nezáleží na stáří preparátu (i zmražené vzorky) mozaiky lze detekovat u vybraných chromozomů vhodné i pro analýzu kontaminovaných vzorků

37 Využití fetální DNA (RNA) v maternálních tkáních v neinvazivní prenatální diagnostice

38 Analýza fetálních molekul v maternálních tkáních Jaderné fetální buňky fetální erytroblasty 1 in Fetální buňky v apoptóze?????? Volná fetální DNA 5% Fetální cdna??????

39 Diagnostické využití fetálních molekul v periferní krvi Separace fetálních buněk Rozpoznání fetální DNA Přesná kvantifikace Analýza zodpovědných lokusů

40 Metodika separace fetálních buněk (MACS FACS)

41 FISH na fetálních erytroblastech Major problems with FISH is that 1 2% of normal diploid cells give three-signal nuclei and about 10 20% of trisomic cells give two-signal nuclei

42 Detekce fetálních apoptických buněk TUNEL test Komet test Systém založen na detekci kaspázové aktivity

43 Komet test

44 Analýza volné DNA (RNA) z maternální plazmy Izolace DNA ze séra Značení Amplifikace Kvantifikace požadovaného lokusu Rozpoznání patologie

45 Kvantifikace fetální DNA Real time PCR amplifikace DNA v reálném čase IQF PCR amplifikace DNA v reálném čase + separace v kapilární elektroforéze

46 Detekce fetální alely D21S1446 v maternálním séru

47 Detekce lokusu TSPY v maternální plazmě

48 Organizace lidského genomu

49 DNA člověka 3,2 Gb, Euchromatin 2,95Gb Proteiny kodující DNA 1,1-1,4%, transkribující DNA 5%-28% genů (pův. odhady ), kvasinka 6.000, moucha , rostliny ,

50 DNA člověka repetitivní sekvence 50%: parazitické elementy 45% (většinou vznikly reverzní transkripcí RNA), krátké repetice 3%, duplikace dlouhých segmentů DNA 5% Náš genom se podobá moři reverzně transkribované cizorodé DNA s malou příměsí genů.( D. Baltimore).

51 DNA člověka Pouze 94 z 1278 proteinových rodin v našem genomu je specifických pro obratlovce. Základní buněčné funkce zůstaly fixovány od bakterií a kvasinek až po člověka. Největší rozdíly mezi člověkem a např. červem nebo mouchou spočívají ve větší komplexnosti proteinů.: více domén, složitější kombinace domén. Evoluce je v podstatě novější a kvalitnější stavba pořád ale ze stejných cihel. Zdá se, že některé geny pocházejí přímo z bakterií. Je zřejmé, že náše DNA je chiméra a obsahuje geny z několika organizmů. Další odlišnosti mezi organismy je možné odvodit z alternativního sestřihu a vlastních interakcí mezi proteiny.

52 DNA člověka

53 DNA člověka

54

55

56

57

58