Humánní cytogenetika. Introduction Biological Industries Ltd. was BIOLOGICAL INDUSTRIES

Transkript

1 Humánní cytogenetika Introduction Biological Industries Ltd. was founded in 1981, primarily for the production of biological products and to exploit the diverse Israeli scientific expertise in this field. Close relationships are maintained with Israel s scientific community and in addition, reciprocal relationships have been established with numerous companies outside Israel. We are dedicated to providing the biomedical community and biotechnology industry with products of the highest quality. Our products for the tissue culture market include sterile sera, liquid and powdered synthetic media, supplements and novel serum-free media formulations. We also manufacture products for molecular biology research laboratories. In 1992 we entered the field of cytogenetics, and today we are able to offer a wide range of various products for cytogentics laboratories. The products undergo extensive quality control, and are registered with the CE Mark for IVD. In January 2006, Biological Industries opened its new state-of-theart, fully cgmp compliant production facility. We maintain an inhouse research and development program. In addition, Biological Industries has entered into partnerships with a number of sciencebased Israeli companies active in the field of life sciences.

2 Prenatální diagnostika 02 Optimalizované médium pro kultivaci a genetickou analýzu lidských buněk plodové vody a vzorků choriových klků (CV) Karyotypizace chromozómů se vyvíjela nejprve v cytogenetice. Základním principem metody je příprava chromozómů pro mikroskopické pozorování zastavením buněčné mitózy v metafázi pomocí kolchicinu a napuštění buněk hypotonickým roztokem. Následuje standardní nebo fluorescenční barvení chromozómů, které jsou poté testovány za pomoci mikroskopu a počítačových programů za účelem seřazení a identifikace chromozómů kvůli přítomnosti genetických vad. Tato metoda v podstatě umožňuje identifikaci jakékoliv abnormality - nadbytek chromozómů nebo nedostatek chromozómů, poškozené chromozómy nebo nadbytečný genetický materiál (jako výsledek přeskupných procesů). Klinické cytogenetické laboratoře používají tuto metodu pro plodovou vodu, choriové klky, krevní buňky, kožní buňky atd., což jsou buňky, které mohou být kultivovány pro získání mitotických buněk. Většina buněk plodové vody pochází z plodu a zahrnuje fibroblasty, epitelové buňky a amniocyty. Buňky vhodné pro genetickou analýzu jsou fibroblasty a amniocyty, a preparace chromozómů z těchto buněk poskytuje jasný obraz chromozómů pro mikroskopické pozorování. Amniocentéza se zpravidla provádí 16. až 20. den těhotenství, kdy se odebere ml plodové vody pro genetickou analýzu. Buňky mohou být naočkovány na podložní sklíčko nebo do vhodné lahvičky kvůli získání kolonií nebo buněčných kultur. Protože se buňky dělí, karyotypizace chromozómu se u nich může provádět pro všeobecné genetické testování. Pro testování specifických abnormalit může být malé množství buněk odebráno z původního vzorku pro FISH a/nebo QF-PCR testy. Doba, která uplyne do získání konečných výsledků genetických analýz má značnou důležitost, jak z pohledu emocionálního - napětí a stres způsobené čekáním na konečné výsledky - tak z pohledu praktického - potřeba ukončení těhotenství, pokud se nalezne genetická abnormalita. Ukončení těhotenství v druhém trimestru prakticky znamená provedení interrupce, z toho důvodu je důležité získání výsledků tak rychle, jak je možné, pro ulehčení procedury. V minulé dekádě Biological Industries Ltd. vyvinula řadu kvalitních cytogenetických produktů, včetně médií pro kultivaci buněk plodové vody a choriových klků, BIOAMF-1, BIOAMF-2 a BIOAMF-3, které se velice úspěšně prodávají v Izraeli, Evropě a Asii. BIOAMF- 1 bazální médium a zmrazené doplňky BIOAMF-1 je médium určené pro primární kultivaci lidských buněk plodové vody a vzorků choriových klků (CV) v otevřených (5% CO 2 ) i uzavřených systémech. Médium umožňuje rychlý růst amniocytů nebo choriových klků pro použití v karyotypizaci. Nemusí se přidávat sérum nebo náhražky séra. Médium se skládá ze dvou složek: bazální médium a zmrazené doplňky. Instrukce pro použití Pro přípravu 500 ml hotového média použijte A a E. Pro přípravu 100 ml hotového média použijte B a D. Rozpusťte BIOAMF-1 Supplement kroužením ve vodní lázni při 37 o C a přeneste obsah do lahvičky BIOAMF-1 Basal Medium. Promíchejte hotové médium kroužením v lahvičce a přidejte 2mM L-Glutamine (L-Glutamine Solution 200mM, kat.č ). Antibiotika se mohou přidat, pokud je to nutné. (Pen-Strep, kat. č ). BIOAMF-1 Basal Medium je stabilní 24 měsíců od data výroby, skladováno při 2-8 o C. BIOAMF-1 Supplement je stabilní 15 měsíců od data výroby, skladováno při -20 o C. Hotové médium je stabilní 7 dnů, skladováno při 2-8 o C. Nezmrazujte hotové médium. Basal Medium a hotové médium chraňte před světlem. BIOAMF-2 hotové médium Hotové médium specificky optimalizované pro primární kultivaci lidských buněk plodové vody a vzorků choriových klků (CV) v otevřených (5% CO 2 ) i uzavřených systémech. Nemusí se přidávat sérum a doba stanovení karyotypizace chromozómů je značně zkrácena ve srovnání s použitím konvenčních médií. Poznámka: V jediné lahvičce je hotový přípravek, který obsahuje také L- Glutamin a antibiotika. Pro použití stačí pouze rozpustit! BIOAMF-2 Medium skladujte při teplotě -20 C. Po rozmražení skladujte při 2-8 C. Médium se může používat 7 dní po rozmražení. Chraňte médium před světlem. Hotové medium je stabilní 7 dnů, skladováno při 2-8oC. Nezmrazujte hotové medium. Basal Medium a hotové médium chraňte před světlem.

3 BIOAMF-3 hotové médium Vylepšená verze hotového média specificky optimalizovaného pro primární kultivaci lidských buněk plodové vody a vzorků choriových klků, používaného pro prenatální diagnostické testy. Médium je dodáváno zmražené a obsahuje L- Glutamin a antibiotika. Výhody BIOAMF-3: Rozšiřuje pufrační kapacitu v otevřených (CO 2 ) i uzavřených systémech Zlepšuje kvalitu barvení: vynikající morfologie chromozómů a metafázní struktura Zvyšuje výtěžnost metafáze Prodlužuje stabilitu média při 2-8ºC. BIOAMF-3 Medium skladujte při teplotě -20 C. Po rozmražení skladujte při 2-8 C. Médium se může používat 14 dní po rozmražení. Chraňte médium před světlem. Instrukce pro použití BIOAMF-1,2,3 Kultivace lidských buněk plodové vody 1. Centrifugujte 20 ml plodové vody při 750 rpm po dobu 10 minut. 2. Opatrně oddělte plodovou vodu od peletu buněk do sterilní zkumavky. 3. Resuspendujte buněčný pelet 2 ml plodové vody. 4. Přidejte 2ml BIOAMF média a jemně kružte. 5. Kultivujte 0.5 ml buněčné suspense na každém krycím sklíčku tkáňové kultivační misky. 6. Inkubujte kultury při 37 C v atmosféře 5% CO Druhý den přelijte kulturu 1.5 ml BIOAMF média. 8. Po 5 dnech ověřte přítomnost kolonií v kultuře. 9. Poté, co se objeví první kolonie (5-7 dní), nahraďte médium čerstvým BIOAMF médiem. 10. Pokud mají kolonie kultury dostatečnou velikost, můžete ukončit kultivaci. CV kultivace 1. Poté, co je ženě odebraná tkáň CV, uložte ji ihned do RPMI-1640 média, doplněného o 1% heparin. 2. Jakmile se tento vzorek dostane do laboratoře, přeneste jej do RPMI (bez heparinu) pomocí Pasteurovy pipety do RPMI-1640 (bez heparinu). 3. Za použití sterilní jehly oddělte kousky CV od mateřské tkáně, které potom uchovávejte v RPMI Tkáň potom upravte pomocí trypsin-edta (0.25%) 60 minut při 37ºC. 5. Po separaci centrifugací přidejte ke zbytku kolagenasu typ V ( jednotek na ml) na 30 minut při 37ºC. 6. Buňky poté mechanicky separujte pomocí pipety. 7. Potom buňky suspendujte v BIOAMF a naočkujte buď do lahviček (pro biochemickou analýzu) nebo na plotny (pro genetickou analýzu). 8. Plotny: Po 2 dnech přidejte další BIOAMF. Po dalším dni všechno médium nahraďte čerstvým BIOAMF. Po dalších 5-6 dnech jsou buňky nakultivované. Lahvičky: Po 2 dnech přidejte další BIOAMF. Po dalších 5 dnech nahraďte všechno médium čerstvým BIOAMF. Název produktu BIOAMF-1 Bazální médium BIOAMF-1 Doplněk BIOAMF-2 Hotové médium BIOAMF-3 Hotové médium kat. č B A B A B A B A objem 90ml 450ml 10ml 50ml 500ml 500ml Pozn.: Doporučuje se nahradit médium čerstvým BIOAMF médiem den před ukončením kultivace.. 03

4 Kultivace lymfocytů Karyotypizace krevních buněk je důležitým nástrojem moderní lidské cytogenetiky, poskytujícím informace o chromozomálních abnormalitách, jejich četnosti v populaci a vztahu mezi specifickými chromozomálními abnormalitami a vlivy fenotypu. Lidské cytogenetické studie zahrnují vyšetření stimulovaných lymfocytů po zastavení buněčného dělení v metafázi pomocí inhibitoru tvorby vřeténka. Jaderná membrána se rozpouští a dochází ke kondenzaci chromozómů jako obvykle, ale chromozómy se nedokáží seřadit do ekvatoriální roviny. Chromozómy zůstávají volně v cytoplasmě, což poskytuje naprosto odlišný pohled oproti přirozené metafázi. Následné zpracování a barvení umožňuje jasnou viditelnost chromozómů. Chromozomy se můžou barvit buď metodou, která poskytne dostatečnou jednotnou intenzitu nebo metodou diferenciálního barvení podle délky chromozomu. Biological Industries nabízí zkumavku s plochým dnem, připravenou k použití, která obsahuje 5 ml hotového média pro karyotypizaci periferální krve. Médium obsahuje PHA (Phytohaemagglutinin). Šikmý stojan je dodáván s 10 zkumavkami, takže zkumavky jsou vloženy do inkubátoru ve správném úhlu. Výhody: Šetří čas Vynikající podpora růstu Bez potřeby dalších doplňků Šikmý stojan pro vhodnou inkubaci Karyotypizační médium pro periferní krev Karyotypizační médium pro periferní krev (Peripheral Blood (PB) Karyotyping Medium) je specificky optimalizované pro krátkodobou kultivaci lymfocytů z periferní krve pro analýzu chromozomů. Není potřeba přidání séra, glutaminu ani antibiotik. Médium je dodáváno mražené. Návod k použití Při použití Peripheral Blood Karyotyping Medium without PHA-M (kat.č ) pouze přidejte 2-4 ml PHA-M (kat. č H) na 100 ml karyotypizačního média. 1. Naočkujte přibližně 0.5 ml heparinizované plné krve do skleněné nebo plastikové zkumavky s 10 ml média. 2. Inkubujte kulturu při 37ºC v atmosféře 5% CO2 po dobu 72 hodin. 3. Přidejte ml roztoku Colcemid Solution (kat.č ) do každé kultivační zkumavky. Kulturu inkubujte dalších minut. 4. Přeneste kulturu do centrifugační zkumavky a centrifugujte 5 minut při 500g. 5. Odstraňte supernatant a resuspendujte buňky v 5-10 ml hypotonického 0.075M KCl (kat.č ). Inkubujte minut při 37ºC. 6. Centrifugujte 5 minut při 500g. 7. Odstraňte supernatant, protřepejte buněčný sediment a po kapkách přidávejte 5-10 ml čerstvého, ledově vychlazeného ustalovače připraveného z 1 dílu kyseliny octové a 3 dílů methanolu. Ponechejte 10 minut při 4ºC. 8. Opakujte kroky 6 a Centrifugujte 5 minut při 500g. Resuspendujte buněčný pelet v množství asi ml čerstvého ustalovače, nakapejte na čisté sklíčko a nechte na vzduchu uschnout. 10. V této fázi je možné preparát barvit Orecinem nebo podle Giemsy. Barvení podle Giemsy se stalo nejpoužívanější metodou a nejběžnějším postupem tohoto barvení je ošetřit sklíčka činidlem Trypsin-EDTA 10X (kat.č ). PB Karyotyping Medium skladujte při teplotě -20 C. Po rozmražení skladujte médium při 2-8 C. Médium použijte do 10 dní po rozmražení. Chraňte médium před světlem. Název produktu Peripheral Blood Karyotyping Medium, without PHA Peripheral Blood Karyotyping Medium, with PHA Peripheral Blood Karyotyping Medium, with PHA with rack kat. č. vel B B H-10 10X5ml 04

5 Kultivace buněk kostní dřeně Cytogenetická analýza lidských hematopoetických buněk za použití aspirátů kostní dřeně je standardní technikou v hematologii. Zlepšení kultivace buněk a zpracovatelských metod umožnilo identifikaci řady recidivujících abnormalit u solidních nádorů a hematologických maligních chorob. Existuje více dostupných údajů u leukémií a lymfomů, než u solidních nádorů, kvůli relativně snadnému získání kostní dřeně nebo vzorků periferní krve od pacientů s leukémií. Studie chromozomálních abnormalit u leukémie slouží dvěma funkcím: první funkcí je podpora přesnější diagnózy, poskytnutí prognostické informace a umožnění racionálnějšího výběru terapie pro jednotlivé pacienty. Druhou funkcí je identifikování míst odpovídajících přesmyků, poskytující přesnou lokalizaci, potřebnou pro izolaci a klonování DNA z těchto míst. Použitím molekulárních technik mohou být rozpoznány funkce genů a mohou být stanoveny mechanismy, jimiž jsou jejich pozměněné funkce spojeny se vznikem nádorů. V minulosti se předpokládalo, že cytogenetická analýza hematologických maligních poruch se provede nejlépe přímo na nekultivovaných vzorcích kostní dřeně. Nicméně, pozdější studie uváděly, že analýza kultivovaných vzorků odhalila klonální abnormalitu, která by nebyla objevena, pokud by byla použita pouze přímá metoda. Proto tedy u řady vzorků byly chromozomální přesmyky často objeveny pouze po analýze kultivovaných preparátů. Karyotypizační médium pro kostní dřeň Karyotypizační médium pro kostní dřeň je určené pro krátkodobou kultivaci primárních buněk kostní dřeně za účelem hodnocení chromozomů. Základem Bone Marrow Karyotyping Média je bazální médium RPMI-1640, obohacené o L-Glutamin, fetální hovězí sérum a antibiotika (penicilin a streptomycin). Médium neobsahuje mitogeny nebo podmiňující médium. Bone Marrow Karyotyping Médium je dodáváno mražené a po rozmražení je připravené k použití. 1. Naočkujte přibližně 0.5 ml suspenze kostní dřeně do plastikové zkumavky nebo na misku pro tkáňovou kulturu s 10 ml média. Zkumavku jemně obraťte, aby došlo k promíchání vzorku. 2. Kulturu inkubujte při 37ºC v atmosféře 5% CO 2 72 hodin. 3. Přidejte ml roztoku Colcemid Solution (kat.č ) do každé kultivační zkumavky. Kulturu inkubujte ještě dalších minut. 4. Přeneste kulturu do centrifugační zkumavky a centrifugujte 5 minut při 500g. 5. Odstraňte supernatant a resuspendujte buňky v 5-10 ml hypotonického 0.075M KCl (kat.č ). Inkubujte minut při 37ºC. 6. Centrifugujte 5 minut při 500g. 7. Odstraňte supernatant, protřepejte buněčný sediment a po kapkách přidávejte 5-10 ml čerstvého, ledově vychlazeného ustalovače připraveného z 1 dílu kyseliny octové a 3 dílů methanolu. Ponechejte 10 minut při 4ºC. 8. Opakujte kroky 6 a Centrifugujte 5 minut při 500g. 10.Resuspendujte buněčný pellet přibližně v ml čerstvého ustalovače, nakapejte na čisté sklíčko a nechte na vzduchu uschnout. 11.V této fázi je možné preparát barvit Orecinem nebo podle Giemsy. Barvení podle Giemsy se stalo nejpoužívanější metodou a nejběžnějším postupem tohoto barvení je ošetřit sklíčka činidlem Trypsin-EDTA 10X (kat.č ). Bone Marrow Karyotyping Medium skladujte zmražené při -20 C. Po rozmrznutí uchovávejte při 2-8 C a spotřebujte do 10 dnů. Médium chraňte před světlem. Návod k použití: Metoda karyotypizace buněk kostní dřeně byla vyvinuta pro získávání informací o chromozomálních abnormalitách. Médium je připravené k použití a je určené pro kultivaci buněk kostní dřeně bez jakéhokoliv mitogenu nebo podmiňujícího media. Po hodinách se přidá inhibitor mitózy pro zastavení dělení ve stadiu metafáze. Po promytí hypotonickým roztokem, fixaci a barvení je možné v mikroskopu pozorovat chromozomy a vyhodnotit abnormality. 05

6 Hematopoietic Cell Karyotyping Medium Cytogenetická analýza lidských hematopoetických buněk z aspirátů kostní dřeně je standardní technikou v hematologii. Čerstvé buňky nebo buňky, které rostou v krátkodobých koloniích zpravidla neposkytují dostatečný počet mitotických buněk a je třeba opakovat odběr. Hematopoietic Cell Karyotyping Medium (Karyotypizační medium pro hematopoetické buňky) bylo vyvinuto pro stimulaci množení lidských hematopoetických buněk získaných jak z kostní dřeně tak i z periferní krve. Toto médium je zvláště účinné pro karyotypizaci akutní ne-lymfocytické leukémie a různých stadií chronické myelogenní leukémie, stejně jako i dalších hematologických poruch jako je myelodysplastický syndrom a primární polycythemia (PCV). Základem Hematopoietic Cell Karyotyping Média je MEM-Alpha bazální médium obohacené o L-Glutamin, fetální hovězí sérum, antibiotika (penicilin a streptomycin) a podmiňující medium. Hematopoietic Cell Karyotyping Medium je dodáváno mražené a po rozmražení je připraveno k použití. Návod k použití Metoda karyotypizace hematopoietických buněk byla vyvinuta pro získávání informací o abnormalitách chromozomů. V přítomnosti podmiňujícího media jsou buňky akutní a chronické nelymfocytické leukémie v kostní dřeni a periferní krvi stimulovány k zahájení mitózy replikací DNA. Po hodinách je přidán inhibitor mitózy pro zastavení dělení ve stadiu metafáze. Po promytí hypotonickým roztokem, fixaci a barvení je možné v mikroskopu pozorovat chromozomy a vyhodnotit abnormality. 1. Naočkujte přibližně 0.5 ml suspenze kostní dřeně nebo 0.5-1x10 7 Ficollseparovaných buněk periferní krve do plastikové zkumavky nebo na misku pro tkáňovou kulturu s 10 ml média. Zkumavku jemně obraťte, aby došlo k promíchání vzorku. 2. Kulturu inkubujte při 37ºC v atmosféře 5% CO 2 72 hodin 3. Přidejte ml roztoku Colcemid Solution (kat.č ) do každé kultivační zkumavky. Kulturu inkubujte ještě dalších minut. 4. Přeneste kulturu do centrifugační zkumavky a centrifugujte 5 minut při 500g. 5. Odstraňte supernatant a resuspendujte buňky v 5-10 ml hypotonického 0.075M KCl (kat.č ). Inkubujte minut při 37ºC. 6. Centrifugujte 5 minut při 500g. 7. Odstraňte supernatant, protřepejte buněčný sediment a po kapkách přidávejte 5-10 ml čerstvého, ledově vychlazeného ustalovače připraveného z 1 dílu kyseliny octové a 3 dílů methanolu. Ponechejte 10 minut při 4ºC. 8. Opakujte kroky 6 a Centrifugujte 5 minut při 500g. 10.Resuspendujte buněčný pellet v množství asi ml čerstvého ustalovače, nakapejte na čisté sklíčko a nechte na vzduchu uschnout. 11.V této fázi je možné preparát barvit Orecinem nebo podle Giemsy. Barvení podle Giemsy se stalo nejpoužívanější metodou a nejběžnějším postupem tohoto barvení je ošetřit sklíčka činidlem Trypsin-EDTA 10X (kat.č ). Název produktu Bone Marrow Karyotyping Medium Hematopoietic Cell Karyotyping Medium kat. č B B objem 06

7 Související produkty Phytohaemagglutinin M (PHA-M) Fytohemaglutinin je lektin extrahovaný ze semen fazole zahradní (Phaseolus vulgaris). Tento protein se skládá ze dvou druhů molekul, leuko-aglutinin (PHA-L) a erytroaglutinin (PHA-E). Každý z proteinů obsahuje skupinu pěti isolektinů, z nichž každý je tetramer, držící pohromadě nekovalentními vazbami. PHA-M je forma mukoproteinu, jako surový extrakt se používá pro stimulaci množení buněk u kultivace lymfocytů. PHA-M má také silné erytroaglutinační vlastnosti a původně byl užívám pro separaci leukocytů z celé krve. PHA-M od traktu z vybraných semen fazole zahradní. Každá lahvička se rehydratuje přidáním 5 ml sterilní destilované vody sterilní stříkačkou. Po rehydrataci každý ml obsahuje 5-10 mg proteinů. Působnost: Každá série je testovaná a standardizovaná pro stimulaci mitózy, primárně pro lidské lymfocyty z periferální krve. Použití: 2-4 ml rehydratované PHA-M se použije na 100 ml kultivačního média Trypsin-EDTA 10X Barvení podle Giemsy se stalo nejpoužívanější technikou používanou pro běžné barvení chromozómů. Nejběžnější metodou provedení tohoto barvení je ošetření sklíček trypsinem. Tato procedura umožňuje roztřídění chromozómů a barvení s vysokým rozlišením. Trypsin-EDTA 10X od Biological Industries obsahuje Trypsin (1:250) 5 g/l a EDTA 2 g/l. Skladujte při -20ºC. Název produktu Phytohaemagglutinin M (PHA-M) Colcemid (Demecolcine) Solution Potassium Chloride, conc M Trypsin-EDTA 10X kat. č H D B C B objem 5ml 10ml 20ml Colcemid (Demecolcine), 10μg/ml Solution Kolcemid (Colcemid, N-deacetyl-N-methylcolchicine) je derivát kolchicinu, ale při studiích na laboratorních zvířatech se zjistilo, že je mnohem méně toxický. Kolcemid zastavuje mitózu kultivovaných buněk v metafázi a doporučuje se opatrné zacházení, protože má mutagenní, karcinogenní a teratogenní účinky. Roztok Colcemid Solution od Biological Industries je připraven v PBS a doporučovaná koncentrace pro použití je 0.1 μg/ml pro kultivační médium. Kolcemid se doporučuje pro použití u chromozómové analýzy při karyotypizaci lymfocytů, u chromozómové analýzy buněk plodové vody a u synchronizace buněk. Colcemid Solution skladujte při 2-8ºC a chraňte před světlem M KCl Hypotonický roztok chloridu draselného ve vodě pro použití při preparaci lymfocytových chromozómů - hypotonické ošetření způsobuje, že se buňky zvětší. 07

8 Biological Industries Ltd. Kibbutz Beit Haemek Tel (972) Fax (972) info@bioind.com Biological Industries Ltd. byla založena v roce 1981, primárně pro pro produkci produktů pro biologii a pro rozvoj rozmanité vědecké kvalifikace v tomto oboru v Izraeli. Firma úzce spolupracuje s izraelskou vědeckou komunitou a s významnými společnostmi ve světě. Věnujeme se poskytování produktů nejvyšší kvality pro biomedicínu a biotechnologický průmysl. Mezi naše produkty pro trh s tkáňovými kulturami patří sterilní séra, tekutá a prášková syntetická média, doplňky a nově také bezsérová média. Vyrábíme také produkty pro výzkumné laboratoře molekulární biologie. V roce 1992 jsme vstoupili na pole cytogenetiky a dnes jsme schopni nabídnout široký rozsah produktů pro cytogenetické laboratoře. Produkty podstupují rozsáhlou kontrolu kvality a mají registrovanou značku CE pro IVD. V lednu 2006 Biological Industries zahájila novou úroveň technologie, zařízení plně odpovídající standardu kvality cgmp. Udržujeme vlastní výzkumný a vývojový program. Biological Industries navíc vstoupili do partnerství s řadou vědecky orientovaných izraelských společností v oboru Life Science. Tzalam Tzalemet