Roentgenova krystalografie X-ray Crystallography. - Krystal - Roentgenovo záření - Difrakce, rozptyl - Strukturní analýza - Strukturní model

Transkript

1 Roentgenova krystalografie X-ray Crystallography - Krystal - Roentgenovo záření - Difrakce, rozptyl - Strukturní analýza - Strukturní model

2 William Henry Bragg a Max von Laue Max von Laue Nobelova cena za fyziku in 1914 (difrakce) W.H. Bragg a W. Lawrence Bragg - Nobelova cena za fyziku 1915 (NaCl) W.H.B M.v.L.

3 SCHEMATIC ILLUSTRATING BRANCHES OF MODERN CRYSTALLOGRAPHY, THEIR APPLICATIONS, AND THE RELATION OF CRYSTALLOGRAPHY TO THE NATURAL SCIENCES Heart of this scheme

4 Strukturní analýza malých molekul Difrakce na krystalech měření intenzit Redukce dat. Matematické výpočty Elektronová hustota. Atomy jejich polohy Geometrie molekul. Chemické vazby. Tepelné kmity atomů

5 Standardní schéma RTG krystalografie je experimentální technika, která využívá difrakce X- paprsků na krystalech. Na základě difrakčního obrazce získaného z periodického uspořádání molekul nebo atomů v krystalu, je možné rekonstruovat elektronovou hustotu a tím určit uspořádání atomů. Data Processing Structure Solution and Refinement X-ray source X-ray preparation Diffraction Detection

6 Výběr a montáž krystalu Velikost - Asi mezi mm Tvar - Musí být monokrystal (single crystal) - čím kulatejší, tím lepší Mosaicita Goniometrická hlavička umožní aby krystal zůstal v paprsku RTG záření v každé orientaci

7 Experimentální data Vlnová délka: λ Mřížkové parametry: a, b, c, α, β, γ Symetrie: možné prostorové grupy Orientace krystalu, krystalové plochy Intenzity: (h, k, l), I, σ(i), 2θ, profil Empirická absorpce Hustota krystalu Chemické složení, sekvence Redukce, korekce, konverze na (h, k, l), F

8 Určování struktur Teorie u proteinové krystalografie Počítačové programy SHELXS, SHELXL, SIR (Il millione), SnB Grafika ORTEP, MERCURY, DIAMOND Polohy atomu, teplotní kmity Meziatomové vzdálenosti, úhly, torzní uhly Vodíkové vazby

9 Struktura [Co(cmasp)(en)] monoclinic_h-m Cc, Z 4 (x, y, z),(x, -y, z+1/2) (x+1/2, y+1/2, z) (x+1/2, -y+1/2, z+1/2) a=11.626(1) α=90.0 b=14.546(1) β=122.4(1) c=10.056(1) γ= 90.0 Co1 O (2) O6 Co1 O (8) N14 Co1 O2 C2 156(4) D H A D-H H...A D...A D-H...A symm O11 H11W O5 0.95(7) 1.84(2) 2.742(5) _555

10 Deformační hustoty Neutronová difrakce - jádra RTG difrakce elektrony Deformační (rozdílová) hustota elektronová hustota chemické vazby. Nejpřesnější a nejkvalitnější analýzy

11 Proteinová krystalografie Co je (bio)makromolekulová krystalografie Bernal Strukturní genomika Penicilín, vitamín B12, DNA, proteiny, trna,viry, ribosomy. Krystalografie. Molekulová biologie a genetika. Přístrojová technika, elektronika, počítače. Drug design.

12 A Brief History of Macromolecular Diffraction 1895: W. C. Roentgen discovers X rays. 1912: Max von Laue discovers X-ray diffraction by crystals. 1913: W. L. Bragg reports the crystal structure of NaCl, providing the first experimental evidence for the absence of salt "molecules" : Dorothy Crowfoot Hodgkin et al. solved the structures of penicillin (1949) and vitamin B-12 (1957). 1958: Structures of myoglobin (Kendrew) and hemoglobin (Perutz). 1965: Structure of the first enzyme (lysozyme) by Phillips et al. 1974: Transfer RNA structure determined by Klug and Rich. 1985: Photosynthetic reaction center (first membrane protein) by Huber. 1990s: Structures of the ribosome (Steitz, Ramakrishnan, Noller) (Nobel p. 2009] Structures of ion channels (MacKinnon)

13 Protein model I

14 Protein model II

15 Protein model III

16 t-rna

17 30S r-rna

18 50S r-rna

19 B-DNA

20 Nucleosome

21 Protein structure determination Crystallization Purified protein Crystal Phase problem X-ray Diffraction Electron density Biological interpretation 3D structure

22 První krok: Krystalizace -přírodní materiál & genové inženýrství - protein: purifikace, koncentrace 10mg/ml - ph, srážecí roztoky PEG, NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4 - nativní krystal, 30-80% voda - difuzní kanály - izomorfní deriváty [HgI 4 ] 2-, UO 2 2+, Xe - selenometionín, RbBr -buňky 5-10 nm, nm - flash cooling, cryocrystallography, cryoprotectant -magie, umění - velikost 0.1 mm

23 Proteinové krystaly Sperm whale myoglobin See Hampton Research: their Photo Gallery.

24 Kryo-metoda

25 Druhý krok: RTG difrakce Experimentální uspořádání Monochromatické záření nebo několik vlnových délek, případně polychromatické záření Páry kapalného N 2 Zdroj RTG beam stop goniometr detektor

26 Difraktometrie- experiment - Synchrotronové zdroje. Konvenční RTG zdroje. - Monochromátory - RTG kolimace, fokusace, zrcadla -Difraktometr - Detektory klasická fotografie imaging plate (1980) charge-coupled device (CCD, 1990) - Kryosystem (chlazení) - Software na sběr dat (Data Collection) - DENZO, MOSFILM

27 Výhody Synchrotronů Vysoká Intensita BíléRTG záření x 10 6 Monochromatizované x Více dat z radiačně citlivých krystalů Rozklad zářením závisí na Celkové radiační dávce ta se nemění Na čase účinku volných radikálů čas je kratší při intensivní expozici Rozlišení blízkých difrakčních stop Větší molekuly jemnější stopy Virusy, ribozomy Nastavitelné λ určování fází pomocí"mad".

28 Filters,Monochromators Collimators and Mirrors To obtain the best results, the X-ray beam used in the diffraction experiment should all be of a single wavelength and they should be as parallel as possible. To accomplish this in practice, we use filters, monochromators and collimators. More information can be found at: tes/xray.html

29 Filters. Absorption depends on wavelength Overall: µ m λ 3. Discontinuities a.k.a. absorption edges Just enough energy to expel e - from orbital Same wavelengths as characteristic lines Absorption edges depend on atomic number. K α Ni (At#28) slightly less than K α Cu(At#29) CuK β at maximum of Ni μ m. CuK α near minimum. Ni foil allows CuK α at ~100 x intensity of any other wavelength.

30 Monochromators. Crystals: nλ = 2dsinθ (Bragg's law). Consider (1) polychromatic incident beam (2) single reflection. Direction of diffraction (2θ) λ Narrow window highly monochromatic. Inefficient: I(1 reflection) << I(incident). Stable single crystal commonly graphite.

31 Collimation. X-rays diverge from source. A collimator is a tube with smaller tubes (0.5 mm) that attempts to reduce the dispersion of the X-ray beam and limits the diameter of the beam. Fine beam required for spatial resolution of diffraction pattern. Collimator: 2 pinholes mounted in long cylinder Prealigned. Slits: 1 pair horizontal; 2nd pair vertical. Adjustable, but requires alignment.

32 Mirrors. Reflect off "bent" mirrors. Divergent beam or convergent. Focus at sample or detector. Low refractive index beam nearly mirror (1/3 ). Filtering: Can be set close to critical angle, so that K α reflected, but K β refracted (lost). One mirror to focus horizontally, one vertically. Until 15 years ago Alignment difficult only when fine, intense beam needed (e.g. viruses). Modern optics Multilayer coated lenses Alignment stable Now in many laboratories

33 Difraktometr

34 Lab

35 Detektory RTG záření RTG záření může být detekováno pomocí různých zařízení ( Pro většinu použití, hlavní rozdíl mezi různými detektory je daný počtem reflexí, které mohou být měřeny v daném čase. Bodové detektory mohou měřit pouze jednu reflexi v daném čase a k vůli tomuto nedostatku se už nepoužívaní v běžné krystalografii. Tento nedostatek se projevuje v dlouhých časech měření od několika dní do několika týdnů. Plošné detektory mohou měřit mnoho reflexí současně a proto se jim dává přednost v rutinním sběru dat. Příkladem takových detektorů jsou CCD, Image Plates, a také RTG-film (v minulosti).

36 Detektory

37 Difrakční snímek

38 Diffraction Diffuse scattering (from the fibre loop) image Water ring Direct beam Beam stop reciprocal lattice (this case hexagonal) Increasing resolution Reflections (h,k,l) with I(h,k,l h,k,l)

39 DNA vlákno

40 Sběr dat. Data collection Pomalá rotace (oscilace) krystalu okolo osy, měření jednoho image na každý ~1 o rotace. ~ 100 images with ~ reflections each = ~ reflections Extreme 10 6 reflections

41 Indexování a integrace 1. Přiřazení indexů h,k,l každé reflexi 2. Určení intensity každé reflexe 3. Integrace 4. Odečtení pozadí h = 8 k = 12 l = 13 I = > F = 111.2

42 Kvalita. Krystalografické rozlišení 1.2 Å 2 Å 3 Å - Resolution d min = λ/(2sin θ max) -R-factor = Σ [ F obs - F cal ]/ F obs ( dobrá zhoda)

43 Třetí krok: Určení Fází Difraktovaný paprsek: Amplituda a fáze Oba údaje potřebujeme na rekonstrukci krystalové struktury: Amplituda: odmocnina intensity Fáze?

44 Každá reflexe nese informaci o všech atomech Strukturní faktory F(hkl) a elektronová hustota ρ(xyz) jsou propojeny přes Fourieru Transformaci 1 v ρ( x, y, z) = F( hkl)exp{ 2πi( hx + ky + lz)} V hkl v ( hkl) = V ρ( x, y, z)exp{ 2πi( hx + ky lz) }dxdydz F + unit cell

45 Fázový Problém Pokud známe α hkl a strukturní faktory F(hkl) potom: ρ( x, y, z) = = 1 V 1 V hkl hkl v F( hkl)exp{ 2πi ( hx + v F( hkl) exp { iα } můžeme počítat elektronovou hustotu ρ(x,y,z) do elektronové hustotu stavíme 3D atomový model Bohužel, α hkl neznáme na začátku řešení struktury! hkl ky + lz)} exp{ 2πi ( hx + ky + lz)}

46 Strukturní faktory a Fourier Transformace

47 Kevin Cowtan Fourier duck

48 Krystal a FT

49 How important are these phases?? Fourier transform photo s of Karle (top left) and Hauptman (top right) (two crystallography pioneers) F K, α K F H, α H Combine amplitudes F K with phase α H and inverse-fourier transform Combine amplitudes F H with phase α K and inverse-fourier transform F K, α H F H, α K (Taken from: Randy J. Read)

50 Jak můžeme řešit fázový problém? Přímé metody. Direct Methods malé molekuly až po menší proteiny Patterson Methods malé molekuly až po menší proteiny small molecules. Metoda těžkého atomu. Použití v metodách MIR, SAD, MAD Diferenční methody s využitím těžkých atomů multiple isomorphous replacement (MIR). Izomorfní záměna anomalous scattering (AS). Anomální roztyl combinations (SIRAS,MIRAS) Differenční methody s využitím několika vlnových délek Multiple wavelength anomalous diffraction (MAD) single wavelength anomalous dispersion (SAD) Použití homologické structury molecular replacement AMORE. Molekulové nahrazování Fázování v nízkém rozlišení. Elektronová difrakce

51 Direct Methods - Ab initio needs atomic resolution data (d < 1.2 Å) - Density modification - Random phases - Shake-and-Bake (SnB) - Half Bake (SHELXD, SHELXE) - Structure seimiinvariants SIR - Pattterson based methods (XFPA, SIR) - ACORN (York, UK)

52 Pattersonova funkce I P(r)= Σ F 2.cos(2πH.r) - Čtverce strukturních faktorů (žádné fáze) - mezi-atomové vektory místo poloh atomů - Funkce je centro-symetrická -A.L. (Lindo) Patterson (1934) -David Harker. Symmetry. Harker sections -Dorothy Wrich. Image theory -Martin Buerger. Implication theory. -Martin Buerger. Image-seeking function -W.N. Lipscomb. SMF symmetry minimum function

53 Pattersonova funkce II Pattersonova funkce obsahuje meziatomové vektory. N atomů davá N 2 vektorů, z kterých N je v počátku Krystal Patterson 11, 22, 33 v počátku

54 Molecular replacement Molekulová náhrada AMoRe (Automatic Molecular Replacement) PHASER Homologous protein Rotační funkce Translační funkce Rafinace

55 Determination of the Orientation Crystal Patterson Patterson Compare Vectors w/in molecule Vectors between molecules Self-vectors shorter Depend only on internal structure Not on position w/in unit cell Orientation depends on molecular orientation

56 Orientation from Patterson. Overlap Patterson Rotate Patterson Assess overlap Rotate again Is the overlap better? Repeat for all orientations Stepping over 3 angles

57 MIR - Patterson methods Localization of heavy atoms Isomorphous Replacement difference Patterson (F PH -F P ) 2 P - protein, PH - protein with heavy atoms Anomalous Scattering difference Patterson (F + -F - ) 2 F(h,k,l), F(-h,-k,-l)

58 Multiple isomorphous replacement 1. Soak a heavy atom (U, Hg, Pt, Au, Ag ) into your crystal 2. Hope that (a) the heavy atom is specifically binding to a few positions on the protein and (b) the binding does not change the protein conformation or crystal cell parameters ( isomorphism ) 3. Collect a new diffraction data set from the derivatized crystal -> F PH1 4. Repeat for at least one another derivative -> F PH2 5. Then there is a computation procedure that yields an estimate of protein ( native ) phases: F P (native protein crystal) F PH1 (derivative 1) -> φ P (estimate) F PH2 (derivative 2) 6. Do a Fourier synthesis with F P and φ P

59 Fázování IR F P F H F P +F H =F PH F PH

60 Fázování MIR

61 f (electrons) Δf (electrons) Anomalous scattering λ(å) Se K edge 30 electrons Max 30% change

62 Multi-wavelength Anomalous Dispersion (MAD) Se, Hg, Yb, Ho, etc XAFS x-ray absorption fine structure, measure by fluorescence intensity off of protein crystal as a function of x-ray energy

63 Heavy Atom Structure Factors Imaginary f rotates structure factor anti-clockwise F H (+h) F H (-h) Different directions F PH (+) = F P + F H (+) F PH (-) = F P + F H (-) Friedel s law breaks Can use F PH (+), F PH (-) as 2 derivatives As slightly different As know α P (+) = -α P (-) i F anom (+) F regular (-) F regular (+) ΔF f F anom (-) R

64 Anomální rozptyl

65 Poslední krok: Mapa elektronové hustoty Výpočet mapy elektronové-hustoty Metoda FFT Možnost postavit proteinovou strukturu: Rozlišení ~5Å: Pozorujeme pouze Alfa-spirálu Rozlišení ~3Å: Vidíme hlavní řetězec, a některé boční řetězce Rozlišení ~2Å: Obyčejně dostatečné na postavení modelu Rozlišení ~1Å: Atomy jsou diskrétní koule

66 Model (Model building) Mapy elektronové hustoty Å α-spirála -3.5 Ǻ tryptofán, tyrozín Å C α -N-CO-C α Å atom - hlavní řetězec, aminokyseliny, -počítačová grafika FRODO, O, Coot, Quanta - ARP/wARP Vypřesnění modelu (Refinement) R free w - CNS (XPLOR), REFMAC, SHELXL - reciproký prostor, reálny prostor - fixovaná geometrie, energie ( 2 2 ) F o F c 2

67 Building a protein model Find structural elements: α-helices, β-strands Fit amino-acid sequence

68 Building a protein model Find structural elements: α-helices, β-strands Fit amino-acid sequence

69 Effects of resolution on electron density d = 4 Å Note: map calculated with perfect phases

70 Effects of resolution on electron density d = 3 Å Note: map calculated with perfect phases

71 Effects of resolution on electron density d = 2 Å Note: map calculated with perfect phases

72 Effects of resolution on electron density d = 1 Å Note: map calculated with perfect phases

73 Map fitting as a function of resolution 1.0Å 2.5Å 3.0Å 4.0Å At 1.0Å, there is no problem fitting individual atoms (and the N atom is bigger than the carbons). At 2.5Å the ring is easily fitted, at 3.0Å less easily, and at 4Å the fit is very uncertain. The size of the fitted objects depends on the resolution: * High resolution: atoms * Medium resolution: residues, side-chains * Low resolution: secondary structure elements, molecules

74 Solvent. Tlumivý roztok. Protein Solvent Mapa elektronové hustoty v 4 Å rozlišení

75 Skeleton

76 Refinement. Upřesňování Cíl:získat spolehlivý model proteinové struktury pro daná difrakční data. Měníme postupně parametry struktury (souřadnice atomů) aby shoda mezi experimentálními intenzitami a vypočítanými z modelu byla co nejlepší. E target = w E + w E geometry geometry X ray X ray Musí vypadat jako protein (constrains) musí fitovat naše data

77 Refinement process Badphases poor electron density map errors in the protein model Interpretation of the electron density map improved model improved phases improved map even better model iterative process of refinement

78 Refinement programs Least-squares Maximum likelihood M ( ) 2 2 F F 2 = w hkl hkl o c REFMAC (CCP4) CNS (XPLOR) Real space refinement M M ( F F ) 2 = w hkl hkl o c ( ρ ρ ) 2 = hkl w hkl o c

79 R-factor, R free -factor Vážený a konvenční R-faktor. Kriteria správnosti. Čím menší tím lepší. wr = ( 2 2 F ) w F o wf 2 o c 2 1/ 2 R = hkl F obs ( hkl) kf hkl F obs calc ( hkl) ( hkl) Test sada is se vytvoří náhodným výběrem 5 až 10% reflexí. Tato se použije pouze na výpočet R(free). Zbývající reflexe, Pracovní sada, se použije na vlastní rafinaci struktury. R free may not exceed R work too much (~5%) R work must be lower than ~resolution*10 %

80 Ilustrace, verifikace, analýza - RASMOL, MOLSCRIPT SwissPDBViewer, Raster3D -PROCHECK - Ramachandran plot Software. Academic. CCP4 PDB - Protein Database

81 Validation Free R-factor (cross validation) Number of parameters/ observations Ramachandran plot Chemically likely (WhatCheck, PROCHECK) Hydrophobic inside, hydrophilic outside Binding sites of ligands, metals, ions Hydrogen-bonds satisfied Chemistry in order Final B-factor values

82 Art I

83 Art II

84 Výpočet struktur - shrnutí Redukce dat Fázování strukturních faktorů Výpočet elektronové hustoty, DM, obálka, skeleton Budování modelu Rafinace struktury, váhy, maximum likelihood Verifikace

85 Sumár

86 Protein crystals Regular arrays of protein molecules Wet :20-80% solvent Few crystal contacts Protein crystals contain active protein Enzyme turnover Ligand binding Example of crystal packing

87 Problematic proteins Multiple domains Flexible Similarly, floppy ends may hamper crystallization: change construct Membrane proteins Lipid bilayer hydrophilic hydrophilic hydrophobic Glycoproteins Flexible and heterogeneous!!

88 Examples of crystal packing Acetylcholinesterase ~68% solvent β2 Glycoprotein I ~90% solvent (extremely high!)

89 Molekuly života

90 Remarks Time consuming Don t work for all proteins But if do, favored over NMR H-atoms don t scatter much (too few electron) Usual resolution ~2Å