Porovnání metod Elecsys PTH a Elecsys PTH (1-84) na vzorcích z rutinní klinické praxe

Transkript

1 Ing. Petr Vaník Oddìlení laboratorní medicíny, ONN a.s. Nemocnice Rychnov nad Knìžnou Porovnání metod Elecsys PTH a Elecsys PTH (1-84) na vzorcích z rutinní klinické praxe PTH je klíèový hormon pro udržování kalciové homeostázy. Patøí mezi endogenní regulátory kalcium-fosfátového metabolismu, hraje významnou roli v regulaci kostních minerálù - vápníku, fosforu a hoøèíku. U zdravých osob dochází již pøi malém poklesu koncentrace ionizovaného vápníku k sekreci PTH. Parathormon reguluje hladinu vápníku pùsobením na metabolismus kostí stimulací procesu kostní remodelace. Pøi fyziologické sekreci PTH je udržována rovnováha mezi odbouráváním a novotvorbou kostí, pøi dlouhodobì zvýšené sekreci parathormonu zaèíná pøevládat katabolický úèinek a tím dochází k destrukci kostní hmoty. Zvýšená hladina parathormonu stimuluje zpìtnou resorpci vápníku v distálním tubulu a tlusté èásti vzestupného raménka Henleovy klièky ledvin. Zároveò také zvyšuje vyluèování fosfátù snížením zpìtné resorpce v proximálním tubulu. PTH v ledvinì také stimuluje èinnost enzymu 1-α-hydroxylázy, která zvyšuje pøemìnu 25-hydroxycholekalciferolu (kalcidiolu) na 1,25-dihydroxycholekalciferol (kalcitriol), a tím nepøímo ovlivòuje vstøebávání vápníku, fosforu a hoøèíku v trávicím traktu. Ribozomy bunìk pøíštítných tìlísek syntetizují Pre-pro-PTH o délce 115 aminokyselin. V endoplazmatickém retikulu a Golgiho aparátu je zkrácen na pro-pth o délce 90 aminokyselin a následnì o dalších 6 aminokyselin na molekulu PTH. Syntetizovaný PTH je skladován v sekreèních granulích v cytoplazmì, odkud mùže být v pøípadì potøeby okamžitì uvolòován. Vznik mrna pro zahájení ribozomální syntézy PTH zvyšuje nejen hypokalcemie, ale také snížení hladiny fosfátu nebo vitaminu D. Intaktní molekula PTH je tvoøena øetìzcem 84 aminokyselin s celkovou molekulovou hmotností pøibližnì 9,43 kda. Po uvolnìní z denzních granulí dochází velmi rychle (v minutách) k proteolýze a jsou vytváøeny cirkulující fragmenty. Degradace zaèíná již v pøíštítných tìlískách a pokraèuje pøedevším v játrech a ledvinách. Vzniklé fragmenty jsou z krevního øeèištì odstraòovány mimo jiné glomerulární filtrací. Nejèastìji dochází ke štìpení mezi 34. a 35. aminokyselinou, kdy vzniká biologicky aktivní N-fragment, vázající se na PTH receptory, s biologickým poloèasem okolo 2 minut, a C-terminální fragment, který je vyluèován glomelurální filtrací (obr. 1). Jeho biologický poloèas Obr. 1: Molekula PTH 1-84 s vyznaèeným místem štìpení v plazmì se u zdravých osob pohybuje mezi minutami, u pacientù s renálním selháváním se mùže výraznì prodlužovat. V krvi zdravých osob je 5-25 % intaktního PTH, % C-terminálního fragmentu a pouze zlomek N-terminálního fragmentu. Bìhem metabolismu PTH vzniká také èást non 1-84 fragmentù, které mají neúplnou N-terminální èást molekuly. Jedná se pøedevším o fragment 7-84 a dále pak fragmenty 5-84, 8-84, nebo U zdravých osob je množství tìchto neúplných fragmentù celkem zanedbatelné, ale u pacientù s onemocnìním ledvin mùže být v obìhu i nìkolik desítek procent rùzných non 1-84 fragmentù. Samostatnou kapitolu tvoøí molekula amino-pth, která má modifikované aminokyseliny v oblasti Zvýšená tvorba amino- -PTH se mùže vyskytovat u nádorù pøíštítných tìlísek. Laboratorní stanovení PTH je využíváno pøi sledování pacientù s poruchami kalciového nebo kostního metabolismu, dále u pacientù pøi operacích pøíštítných tìlísek (primární hyperparathyroidismus) a také u pacientù s chronickým renálním onemocnìním (sekundární hyperparathyroidismus), kteøí vyžadují pravidelné sledování koncentrace PTH. Základním terapeutickým postupem u pacientù se selháním ledvin je pravidelná dialyzaèní léèba. Pro dosažení co nejlepších výsledkù je snaha o optimalizaci dialýzy, jejímž cílem je provedení co nejúèinnìjšího odstranìní katabolitù a vody, a zároveò bezpeèného procesu z hlediska eliminace komplikací v prùbìhu hemodialýzy. Mezi parametry, které mohou ovlivnit úèinnost dialyzaèního procesu patøí nejen volba dialyzátoru a dialyzaèního roztoku, ale také rychlost prùtoku krve nebo délka 18 Labor Aktuell 02/14

2 dialýzy. Clearence endogenního kreatininu zdravých ledvin je okolo litrù za týden, pøi léèení hemodialýzou 3x týdnì je clearence kreatininu asi 150 litrù. Pro odstranìní pøebyteèné vody z organismu je limitující délka dialýzy, aby nedošlo k náhlému poklesu intravaskulárního objemu. Pøi nastavení všech parametrù dialyzaèního procesu na co možná nejoptimálnìjší hodnoty dokáže hemodialýza velmi úspìšnì eliminovat vodu a nízkomolekulární katabolity, ale zároveò s tím také dochází v prùbìhu nìkolika desítek hodin k výrazným zmìnám koncentrace vápníku a fosfátù, a to opakovanì (obr. 2). Úskalím pøi hemodialýze je odstranìní látek s vyšší molekulovou hmotností nebo i nízkomolekulárních látek vázaných na proteiny. Základní dialyzaèní technika nedokáže témìø vùbec eliminovat látky s molekulovou hmotností nad 12 kd a vyšší. Proto jsou u pacientù sledovány látky, které jsou touto technikou obtížnì odstraòovány. Jedná se buï o retinované netoxické látky nebo o uremické toxiny, které jsou pøímo zodpovìdné za urèitý biologicky negativní úèinek. Ke specifickým uremickým toxinùm patøí napøíklad β-2-mikroglobulin, nìkteré proteiny imunologických reakcí, homocystein a v neposlední øadì také parathormon. Metody pro laboratorní stanovení hladiny PTH mùžeme rozdìlit do 3 generací podle toho, jakou èást molekuly jsou schopny detekovat. I. generace, používaná pøedevším v prvních RIA metodách, nebyla zcela specifická pro celou molekulu PTH. Docházelo ke zkøíženým reakcím s biologicky neúèinným C-fragmentem, chybìla standardizace metody. Tyto prùkopnické metody byly využívány spíše U tìchto metod je snaha o posunutí vazebného místa protilátky co nejvíce k N-terminálnímu konci molekuly PTH, což by mìlo vést ke stanovení celé molekuly PTH, tzv. biointaktního PTH (obr. 3). Metoda Roche Cobas PTH intaktní se øadí mezi metody II. generace, která stanovuje molekulu PTH ještì pøed rozštìpením mezi aminokyselinami v pozicích 34 a 35. Protilátka znaèená rutheniovým komplexem se váže na C-terminální èást molekuly v pozici 37-42, biotinylovaná protilátka reaguje s N-koncem v pozici Typickým zástupcem metod III. generace je souprava Roche Cobas PTH (1-84). Na C-konec molekuly se v pozicích váže protilátka znaèená rutheniovým komplexem, druhá protilátka s navázaným biotinem je senzitivní k pozicím 1-5 N-konce molekuly parathormonu. Základní charakteristiky obou metod jsou uvedeny v tabulce 1. Obr. 2: Zmìny vybraných parametrù v prùbìhu hemodialýzy jako doplòkové testy pøi vyšetøování funkce pøíštítných tìlísek. Metody II. generace byly vyvinuty se snahou o zmìøení celé molekuly - intaktního PTH. Vazebná místa pro protilátky byla orientována i na biologicky aktivní èást molekuly. Problémem však zùstávají non 1-84 fragmenty, které mohou vést k falešnì vyšším výsledkùm u nìkterých skupin pacientù. K eliminaci falešných reakcí non 1-84 fragmentù jsou vyvíjeny metody III. generace. Od letošního roku došlo v systému EHK SEKK u kontrolního vzorku pro kostní markery k rozlišení používaných metod mezi PTH intaktní a PTH (1-84). Podle uvedených údajù pro cyklus BM1/14 používá 23 èeských a slovenských laboratoøí stanovení PTH (1-84), což je pøi celkovém poètu 111 úèastníkù témìø 21 % (obr. 4). V mezinárodním kontrolním systému RI- QAS uvedlo metodu mìøení nìkterým ze systémù III. generace 48 úèastníkù, což je 7,5 % ze všech 648 laboratoøí (obr. 5). V naší práci jsme zmìøili hladinu parathormonu u 85 pacientù, pøevážnì s chronickým poškozením ledvin. Pøevažující diagnóza u pacientù byla N289 (onemocnìní ledvin a moèovodu NS), 42 vzorkù bylo od pacientù z nefrologické ambulance a 43 vzorkù z dialyzaèního støediska. Pro mìøení jsme použili soupravu Roche Cobas PTH intaktní (II. generace) a Roche Cobas PTH (1-84) - biointaktní PTH (III. generace). Vyšetøení bylo provedeno zároveò z jednoho odbìru na imunonalytickém systému Cobas e 601. Výsledky mìøení Obr. 3: Vazebná místa pro protilátky kompletní molekuly PTH 1-84 a non 1-84 fragmentù 5-84, 7-84 a Zelenì - vazebná místa pro PTH intaktní; modøe - vazebná místa pro PTH (1-84); èervenì - místo štìpení v pozici Labor Aktuell 02/14 19

3 Tab. 1: Základní charakteristiky metod pro stanovení parathormonu taktní. Odchylka mìøení vzrùstá s hladinou PTH, u vysokých koncentrací parathormonu jsme metodou PTH intaktní namìøili i dvojnásobné hodnoty ve srovnání s PTH (1-84). Pokud jsou u zdravých jedincù uvádìny obdobné oèekávané hodnoty: PTH (1-84) : (1,58-6,03 pmol/l) a PTH intaktní: (1,6-6,9 pmol/l), je velmi dùležité u zvýšených hodnot získaných metodou PTH intaktní zvažovat možnost ovlivnìní získaných výsledkù renálním selháváním. Pokud laboratoø vyšetøuje PTH pøedevším u dialyzovaných pacientù, mìla by posoudit možnost mìøit PTH nìkterou z metod tøetí generace, u kterých nedochází k ovlivnìní stanovení nespecifickými reakcemi a dokážou mìøit koncentraci kompletní molekuly biointaktního PTH. Také na výsledkových listech bychom mìli uvádìt, zda se jedná o hodnotu získanou metodou PTH intaktní nebo PTH Obr. 4: Výsledky EHK SEKK, cyklus BM 1/14 Obr. 5: Výsledky EHK RIQAS, vzorek 4/14 jsou zhodnoceny pomocí programu Med- Calc a uvedeny v pøiložených tabulkách a grafech. Z našich výsledkù vyplývá, že hodnoty namìøené metodou Roche PTH (1-84) u pacientù s chronickým renálním onemocnìním jsou v prùmìru o 40 % nižší než hodnoty získané metodou Roche PTH in- 20 Labor Aktuell 02/14

4 Graf 1: Statistické zhodnocení všech vzorkù Graf 2: Statistické zhodnocení skupiny dialyzovaných pacientù Labor Aktuell 02/14 21

5 Graf 3: Statistické zhodnocení skupiny pacientù z nefrologické ambulance Literatura: 1) Broulík P., Dvojí úèinek parathormonu na kostní tkáò, Interní med.10(5), ) Cobas Roche PTH (1-84) originální návod diagnostické soupravy, Roche, ) Cobas Roche PTH intaktní originální návod diagnostické soupravy, Roche, ) Ïurovcová E. a kol., Stanovenie parathormónu u pacientov s chronickou oblièkovou chorobou, Labor Aktuell 03/12 5) D Amour P., Brosaard J.H., Rousseau L., et al.: Amino-terminal form of parathyroid hormone (PTH) with immunologic similarities to hpth (1-84) is overproduced in primary and secondary hyperparathyreoidism. Clin. Chem 2003; 49 6) Kreze A., Praktická endokrinológia, SAP, ) Racek, J. a kol., Klinická biochemie, Galén, ) RIQAS Randox Laboratories, 9) SEKK s.r.o. Pardubice, 10) Silbernagl S. - Despopoulos A., Atlas fyziologie èlovìka, Avicenum, ) Sluková S., Možnosti a limity dialýzy, Postgraduální medicína, PM 1/ Labor Aktuell 02/14