Metody molekulární biologie v rostlinné ekologii a systematice

Transkript

1 Protokoly a návody pro praktikum Metody molekulární biologie v rostlinné ekologii a systematice Laboratoř molekulární biologie rostlin, PřF JCU, Branišovská 31, České Budějovice 2008, Miroslava Herbstová, Petr Koutecký & Jiří Košnar

2 Základní zásady práce v molekulárně biologické laboratoři při práci s DNA pracujeme pouze se sterilními autoklávovanými špičkami a zkumavkami (v krabičkách a kádinkách označených páskou s černými pruhy), kontaminovaný materiál odhazujeme do určených nádob pro PCR, ředění DNA a primerů používáme výhradně sterilní vodu (autoklávovaná Milli-Q voda nebo koupená voda od f. Top-Bio) pro omývání laboratorního nádobí používáme destilovanou vodu se savem s roztokem Syber Greenu (nanášecí pufr, LB = loading buffer), který je potencionální mutagen, a s veškerými věcmi, které s ním přicházejí do styku (elektroforetické vany, hřebínky, pipeta na nanášení vzorků ), pracujeme v rukavicích, kontaminovanými rukavicemi se nedotýkáme ničeho jiného, gely vyhazujeme zabalené v papíru do odpadkového koše k tomu určeného akrylamid je neurotoxin, dbáme zvýšené opatrnosti, pracujeme zásadně v rukavicích, kontaminovaný materiál a gely vyhazujeme do zvláštní nádoby, zásobní roztoky uchováváme v ledničce (2-8 C) dbáme zvýšené opatrnosti při práci s elektrickým proudem (elektroforéza apod.) s těkavými chemikáliemi (chloroform, isoamylalkohol, isopropanol, kyselina octová, TEMED, kyselina chlorovodíková ) pracujeme zásadně v digestoři se zapnutým odtahem s DNA a většinou dalších biochemikálií (enzymy, primery ) pracujeme výhradně na ledu, zvlášť citlivé jsou enzymy (polymeráza, restrikční enzymy ad.) a některé pufry pokud odcházíme z laboratoře poslední (i jen na chvíli), vždy zamkneme

3 Obsah Metody analýzy DNA Metody izolace DNA...1 A) Izolace DNA z čerstvého nebo sušeného rostlinného materiálu s použitím Invisorb Spin Plant Mini Kit (INVITEK)...1 B) Extrakce DNA ze sušeného rostlinného materiálu CTAB metoda...3 C) Extrakce DNA pomocí NaOH...4 D) Měření koncentrace DNA a ředění DNA...5 E) Otestování kvality DNA na agarosovém gelu...5 Polymerázová řetězová reakce... 6 Sekvenování DNA...9 ISSR, Inter simple sequence repeat...12 Analýza mikrosatelitů...14 PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)...16 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)...17 A) Protokol s využitím AFLP kitů od firmy Invitrogen...18 B) Protokol bez využití AFLP kitů...20 C) Přesrážení octanem sodným...23 Elektroforéza DNA Elektroforéza...24 Horizontální agarosová elektroforéza...24 Vertikální polyakrylamidová elektroforéza na 6,2% kontinuálním gelu...25 Práce s dokumentačním systémem Gel Imager a softwarem Scion VisiCapture...26 Isozymy Princip metody...27 Histochemické barvení...28 Základy interpretace isozymových patterns...29 Extrakce vzorků...30 Elektroforéza a barvení...31 Vysušení gelu...36 Jednotlivé enzymové systémy...37 Obsluha přístrojů Měření koncentrace DNA pomocí spektrofotometru Biowave II...44 Zacházení s gradientovým termocyclerem TC-XP Bioerg...45 Zacházení s termocyclerem Biometra T3000 se třemi bloky...46 Měření na ph-metru Hanna ph

4 Návody na roztoky a pufry 1) Elektroforéza a příprava gelů ) Izolace, ředění a srážení DNA ) AFLP ) Isozymy izolace ) Isozymy barvení ) Isozymy fixace ) Ostatní...53

5 Izolace DNA Metody izolace DNA A) Izolace DNA z čerstvého nebo sušeného rostlinného materiálu s použitím Invisorb Spin Plant Mini Kit (INVITEK) Princip Metoda využívá unikátní patentované technologie Invisorb. Umožňuje rychlou a účinnou izolaci kvalitní genomické DNA z čerstvého, mraženého nebo suchého rostlinného materiálu (např. z listů, kořenů, plodů nebo semen), také z řas a sinic. Podstatou je interakce mezi negativně nabitými fosfátovými skupinami DNA a pozitivně nabitými skupinami na povrchu membrány v kolonce, kde se DNA váže a po přečištění se uvolní vhodným elučním pufrem. Vazba nebo naopak uvolnění DNA z kolonky závisí na koncentraci solí a ph použitých pufrů. Postup Obecné Před použitím promývacích pufrů (Wash Buffer I a II) zkontrolujeme přidání ethanolu (zaškrnutí příslušného políčka na láhvi). K času pro centrifugaci přičítáme čas nutný k dosažení požadovaných otáček. Odpadní filtráty vzniklé během izolace vyléváme do připravené kádinky. Proteinasa K je součástí kitu. Dodává se se v lyofilizovaném stavu. Před prvním použitím přidáme 1 ml sterilní vody a rozpustíme převracením zkumavky v ruce, krátce stočíme. Před vlastní prací odpipetujeme do 1,5 ml eppendorfky potřebné množství elučního pufru (Ellution buffer D) a předehřejeme v termobloku na 65 C. Homogenizace V tekutém dusíku vymrazíme 1,5 ml eppendorfku s vloženým rostlinným materiálem (cca 60 mg rostlinné tkáně v čerstvém stavu nebo odpovídající množství sušeného materiálu). Vymrazíme homogenizátorek a krouživými pohyby drtíme vzorek ve vymražené eppendorfce. Jinou možností je drtit vzorek ve vymražené třecí misce. Rozdrcený materiál vymraženým skalpelem převedeme do připravené eppendorfky. K drcení vzorku je možné použít také mořský písek. V některých případech je možné drtit přímo čerstvý nebo suchý materiál za pokojové teploty přímo v lyzačním pufru (Lysis buffer P) bez použití kapalného dusíku. Lýza K rozdrcenému materiálu přidáme 400 µl lyzačního pufru (Lysis buffer P) a 20 µl proteinázy K (rozštěpení proteinů, inaktivace DNas). Lyzační pufr a proteinasu přidáváme dříve než vzorek zcela rozmrzne. Vortexujeme a necháme 30 min nebo déle inkubovat při 65 C. Během inkubace 2 3 promícháme. Připravíme si kolonky (Spin Filter) do 2,0 ml sběrných zkumavek (Receiver Tube). 1

6 Izolace DNA Filtrace Lyzační směs přeneseme na kolonku (nejen roztok, ale i rozdrcenou tkáň). Centrifugujeme 1 min při rpm (dle potřeby déle). Kolonky vyhodíme. Odstranění RNA Pokud je potřeba pro další analýzy odstranit RNA, přidáme 5 40 µl RNAasy A (firma Promega; 10mg/ml; není součástí kitu). Množství závisí na typu a výchozí navážce materiálu. Vortexujeme a necháme 5 min inkubovat při pokojové teplotě. Navázání DNA Přidáme 200 µl Binding Buffer P a vortexujeme. Umístíme nové kolonky do 2,0 ml sběrných zkumavek. Suspenzi přeneseme na kolonku a inkubujeme 1 min. Centrifugujeme 1 min při rpm. Promytí I Odstraníme filtrát a kolonky umístíme zpět do 2,0 ml sběrných zkumavek. Přidáme 550 µl promývacího pufru I (Wash Buffer I) a centrifugujeme 1 min při rpm. Odstraníme filtrát a kolonku umístíme zpět do 2,0 ml sběrné zkumavky. Promytí II Přidáme 550 µl promývacího pufru II (Wash Buffer II) a centrifugujeme 1 min při rpm. Odstraníme filtrát a kolonku umístíme zpět do 2,0 ml sběrné zkumavky. Tento krok opakujeme ještě jednou. Vysušení Pro odstranění zbytků ethanolu z promývacího pufru centrifugujeme 2 min při rpm. Eluce Kolonky umístíme do sterilních 1,5 ml eppendorfek (nejsou součástí kitu). Pokud předpokládáme delší skladování DNA, použijeme tzv. safe-lock eppendorfky. Přidáme µl elučního pufru (Elution Buffer D) předehřátého na 65 C. Inkubujeme min při pokojové teplotě v uzavřené digestoři bez odtahu. Centrifugujeme 1 min při rpm. Pozn.: Při centrifugaci nelze zavřít víčka. Při vkládání eppendorfek do centrifugy směrujeme otevřená víčka ve směru otáčení rotoru, abychom zabránili ulámání víček během centrifugace. Pro získání maximálního výtěžku DNA je možné eluovat nejprve 50 µl elučního pufru a v druhém kroku dalšími 50 µl elučního pufru. Pokud nám nejde o celkový výtěžek DNA, ale o co nejvyšší koncentraci DNA, pak k eluci v druhém kroku použijeme první eluát (tj. roztok DNA pipetujeme znovu na kolonku). Inkubujeme 5-10 min a centrifugujeme. 2

7 Izolace DNA B) Extrakce DNA ze sušeného rostlinného materiálu CTAB metoda Princip Metoda je založena na schopnosti CTAB (cetyltrimetylamoniumbromid) vytvářet komplex s nukleovými kyselinami, který je při vysoké koncentraci solí rozpustný (0,7M NaCl), ale při snížené koncentraci solí (0,45M NaCl) vytváří sraženinu. CTAB zároveň působí jako detergent, který uvolňuje DNA z membrán a proteinů. Na základě rozdílné rozpustnosti CTAB v porovnání s DNA je lze oddělit a získat dostatečně čistou rostlinnou DNA. Tuto metodu lze použít k izolaci většího množství DNA. Postup Homogenizace Viz extrakce DNA kitem Invisorb Spin Plant Mini Kit (INVITEK). Vlastní extrakce DNA K rozdrcenému materiálu přidáme 700 µl roztoku CTAB a 10 µl 2-merkaptoethanolu. Pracujeme v digestoři. Zkumavky uzavřeme, krátce promícháme na vortexu a inkubujeme 30 min v termobloku při 60 C. Během prvních minut inkubace přidáme ke každému vzorku na špičku špachtle polyvinylpyrolidonu (PVP). Po inkubaci přidáme 500 µl směsi chloroform: isoamylalkohol (24:1). Pracujeme v digestoři Dobře uzavřené zkumavky 2 3 převrátíme a necháme cca 5 min stát. Centrifugujeme 10 min při rpm. Supernatant (cca 500 µl) opatrně přepipetujeme do nových označených 1,5 ml eppendorfek. Je třeba dát pozor, abychom pipetovali jen průhledný supernatant. Pracujeme stále v digestoři a použité špičky a eppendorfky vyhazujeme do zvláštní nádoby na nebezpečný odpad. Přidáme 500 µl vychlazeného isopropanolu (z mrazáku). 1 2 převrátíme (netřepeme) a necháme cca 30 min stát v 20 C. Centrifugujeme 5 min při rpm. Supernatant opatrně slijeme do kádinky (v digestoři), na dně eppendorfky lze vidět drobný matně bílý pelet DNA. Otevřené eppendorfky převrátíme dnem nahoru na filtrační papír (buničinu) pro odstranění zbytku kapaliny. Přidáme 400 µl vychlazeného 96% ethanolu (z mrazáku). Inkubujeme 15 min v termobloku při 37 C. Centrifugujeme 5 min při rpm. Supernatant opět opatrně slijeme do kádinky (už není nutné v digestoři). Přidáme 200 µl vychlazeného 70% ethanolu (z mrazáku) a necháme cca 5 min stát. Centrifugujeme 5 min při rpm. Supernatant opět opatrně slijeme do kádinky a eppendorfky necháme cca min stát a vyschnout. 3

8 Izolace DNA Přibližně 1 2 min vysušíme pelet v otevřených eppendorfkách na termobloku při 37 C. Sušení ukončíme ve chvíli, kdy lze pelet poklepem (cvrnknutím) v uzavřené eppendorfce oddělit od stěny. Vysušený pelet rozpustíme ve 200 µl TE pufru nebo sterilní vody. Uzavřené eppendorfky inkubujeme 30 min na termobloku při 37 C pro úplné rozpuštění. Krátce promícháme na vortexu a krátce stočíme na stolní centrifuze. DNA uchováváme v ledničce nebo dlouhodobě při 20 C ( 80 C). C) Extrakce DNA pomocí NaOH Extrakce DNA pomocí NaOH je velmi levnou a rychlou metodou přípravy DNA. Hojně se používaná pro extrakci DNA z mechů. Princip Hydroxid sodný naruší buněčné stěny, DNA se uvolní do roztoku a stává se denaturovanou, řetězce jsou separované. Postup Obecné Takto získanou DNA obvykle není možné dlouhodobě skladovat (degraduje). Lze ji použít pro běžné metody založené na PCR. Pro některé aplikace náročné na kvalitu DNA (např. AFLP) ji použít nelze. Izolace Část nebo celou rostlinku mechu vložíme do eppendorfky, uzavřeme a vymrazíme v tekutém dusíku. Vymrazíme homogenizátorek a krouživými pohyby drtíme vzorek na jemný prášek. K rozdrcenému materiálu přidáme 5 µl 0,5M NaOH a drtíme vzorek v roztoku. Přidáme dalších 15 µl 0,5M NaOH a pokračujeme v drcení další 1 2 min. Centrifugujeme 2 min rpm. Supernatant přepipetujeme do nové eppendorfky a ředíme 1:10 roztokem 100mM Tris- HCl, ph 8,3. Podle potřeby dál ředíme roztokem 100mM Tris-HCl pufru. Skladujeme v mrazáku při 20 C max. 1 měsíc. 4

9 Izolace DNA D) Měření koncentrace DNA a ředění DNA Měření koncentrace DNA koncentraci DNA měříme pomocí spektrofotometru Biowave II (Biochrom) zaznamenáme: - koncentraci DNA v ng/µl - poměr A260/A280 udává znečištění proteiny, u čisté DNA je 1,8 až 2,0 - poměr A260/A230 pokud je méně než 1,8, značí to přítomnost organických kontaminant (poly)fenoly, thiokyanáty, sacharidy, močovina apod.; u čisté DNA se Ředění DNA ředění vypočteme např. podle vzorečku: C puv Vpož = zř = C V pož pohybuje v rozmezí 1,8 2,0( 2,2) pip C pův... koncentrace původní (originálního vzorku) C pož... koncentrace požadovaná (na kterou chci ředit) V pož... objem požadovaný V pip... objem pipetovaný (vzorku) zř... zředění Např. chceme 100 µl DNA o koncentraci 30 ng a máme k dispozici DNA o koncentraci 215 ng/µl = 7,17 = V pip V pip = 100 7,17 = 13,95 Smícháme tedy 13,95 µl koncentrované DNA (našeho původního originálního vzorku) a µl sterilní Milli-Q vody, tj. V pož V pip (100 µl 13,95 µl). E) Otestování kvality DNA na agarosovém gelu připravíme 0,8 % agarosový gel cca 5 µl nenaředěné DNA smícháme se 2 µl nanášecího pufru LB (loading buffer) a naneseme na gel jako žebříček naneseme 6 µl Lambda/HindIII firmy NEB 5

10 PCR Polymerázová řetězová reakce PCR (Polymerase Chain Reaction) Princip Polymerázová řetězová reakce byla objevena v roce 1983 Kary Mullisem (Nobelova cena za chemii). Jde o jednoduchou metodu zmnožení (amplifikace) určité části DNA in vitro. Základní uspořádání PCR vyžaduje vytvoření směsi reagencií a následné cyklické střídání teplot této směsi. Složky PCR (PCR mix) templátová DNA naše studovaná DNA nebo její část, kterou chceme namnožit (gen, část genu nebo nekódující sekvence) DNA polymeráza enzym, který buduje nový řetězec DNA podle vzoru templátu PCR pufr udržuje stabilní ph a obsahuje chemikálie pro optimální aktivitu a stabilitu DNA polymerázy MgCl 2 Mg 2+ ionty slouží jako kofaktor DNA polymerázy nukleotidy (dntp) směs deoxynukleosid trifosfátů (datp, dctp, dgtp, dttp), základních stavebních jednotek DNA primery oligonukleotidy (krátké úseky jednořetězcové DNA), zpravidla o délce bazí párující se s komplementární sekvencí v templátové DNA a sloužící jako počáteční místo replikace DNA, bez kterého by DNA polymeráza nemohla začít syntézu nového řetězce; k extenzi primeru dochází ve směru 5' 3' nově vznikajícího vlákna. PCR teplotní program Cyklické střídání teplot umožňuje přístroj zvaný termocykler. Na počátek cyklu se zařazuje počáteční denaturace (94 98 C, 1 10 min); následuje vlastní cyklus: - denaturace (94 98 C, 20 s 1 min): dvoušroubovice DNA se rozplétá na dva řetězce Pozn.: Pro GC bohaté DNA templáty může být denaturace prodloužena na 3-4 min. - nasednutí primerů (annealing) (45 60 C, cca s): primery se specificky párují s komplementární oblastí na templátové DNA Teplota nasedání primerů by měla být o 5 C nižší než teplota tání (denaturace), tzv. melting temperature (T m ) primerů. Pro primery kratší než 25 bp se T m vypočítá podle rovnice: T m = 4(G+C) + 2(A+T) - syntéza DNA (elongace, extenze) (většinou 72 C, 1 min) optimální teplota pro činnost DNA polymerázy; na tvorbu bazí je potřeba 1 min Finálním krokem je : - konečná elongace (72 C, 5 15 min): dokončení syntézy částečných produktů - zchlazení PCR reakce (4 15 C) Střídáním tří teplot dochází k exponenciálnímu množení požadovaného úseku DNA vymezeného dvojicí použitých primerů. Počet cyklů u běžné PCR se pohybuje od 25 do 40. Výsledkem PCR je pak kopií příslušného úseku DNA z každé molekuly templátové DNA. DNA lze vizualizovat po inkorporaci UV fluorescenčního barviva (např. Syber Green, ethidiumbromid ) do dvoušroubovice DNA pod UV světlem. 6

11 PCR Optimalizace PCR Cílem optimalizace je specifický průběh PCR reakce, tj. aby vznikal pouze jediný produkt odpovídající amplifikovanému úseku. Výsledek PCR reakce proto ověřujeme na gelu. V případě, že produkt PCR reakce není zřetelný nebo je výsledkem více produktů odlišné délky (nespecifické produkty), reakce neproběhla optimálně. Je nutné změnit reakční podmínky tak, aby PCR proběhla úspěšně. Je několik možností: změna koncentrace DNA snížením koncentrace DNA snížíme i koncentraci případných inhibitorů PCR, které mohou být přítomny ve vzorku, PCR může úspěšně proběhnout i s množstvím DNA menším než 1 ng; někdy naopak pomůže zvýšit koncentraci DNA až na 50 ng změna teploty nasednutí primeru (annealingu) snížením umožníme lepší vazbu primerů na templátovou DNA, přílišné snížení však může vést k tvorbě nespecifických produktů. Ideální je provést gradientový pokus a následně vybrat nejvhodnější teplotu. zvýšení koncentrace MgCl 2 hořčík stabilizuje komplex DNA polymeráza, zvýšení koncentrace na mm (standardní koncentrace je mm) může přinést úspěch. přidání aditiv některé látky (DMSO, formamid, betaine, glycerol, BSA, (NH 4 ) 2 SO 4 ) mohou zvyšovat stabilitu polymerázy, specifičnost vazby primerů. modifikace cyklu prodloužení (zkrácení) doby elongace, zvýšení počtu cyklů, apod. touch-down protokol do teplotního programu se na počátek amplifikace zařadí 3 5 cyklů s vyšší teplotou nasedání primerů. V prvních cyklech vzniká určité minimum jen specifických produktů, tím se redukuje nespecifické nasedání primeru a snižuje se tvorba nespecifických produktů. V dalších cyklech se použije nižší teplota, která zajistí dostatečný výtěžek. úprava tzv. ramping time (rychlosti přechodu z jedné teploty na druhou) např. AFLP vyžaduje pomalé ohřívání vzorku (při rychlém zahřívání část primerů odpadne), pro dostatečný výtěžek je nutné snížit ramping time na 1 C/s (standardně bývá 3 C/s). PCR protokol s využitím Plain PP Master Mixu (Top-Bio) Plain PP Master Mix již obsahuje PCR pufr, hořčík, nukleotidy a DNA polymerázu. Jeho použitím se výrazně snižuje čas nutný pro přípravu PCR reakce. Snížením počtu pipetovacích kroků je eliminována chybovost při přípravě. Postup Po celou dobu pracujeme na ledu. Všechny potřebné reagencie necháme rozmrznout. Mezitím si označíme PCR zkumavky nebo stripy. Do 1.5 ml eppendorfky připravíme PCR směs pro příslušný počet vzorků + 1 vzorek (rezerva pro pipetovací chybu). Např. máme 10 vzorků, PCR směs připravíme pro 11 vzorků. Jednotlivé složky pipetujeme v pořadí: voda, primery a Plain PP Master Mix. Promícháme na vortexu a krátce stočíme na stolní centrifuze. 7

12 PCR Příprava PCR směsi pro jeden vzorek: reagencie objem (µl) výsledná koncentrace sterilní Milli-Q voda 9,5-2 Plain PP Master Mix 12,5 1 5' primer 1 0,1-1µM 3' primer 1 0,1-1µM Plain PP Master Mix ve finální koncentraci obsahuje 75mM Tris/HCl, ph 8,8; 20mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0,01% Tween20; 2,5mM MgCl 2 ; 200µM datp, 200µM dctp, 200µM dttp, 200µM dgtp; 1,25 U Taq DNA polymerázy. Příslušný objem PCR směsi (v tomto případě 24 µl) rozpipetujeme do jednotlivých 0,2 ml PCR zkumavek a přidáme 1 µl DNA. Promícháme, krátce stočíme v centrifuze. Zkumavky vložíme do termocykleru s příslušným teplotním programem. Po proběhnuté reakci smísíme cca 5 µl DNA s 2 µl LB pufru a otestujeme amplifikovaný produkt nanesením směsi na 1,5% agarosový gel v TBE pufru. Jako standard naneseme 6 µl 100bp ladderu firmy NEB. 8

13 Sekvenování Sekvenování DNA Princip Sekvenováním zjistíme pořadí bazí (A,C,T,G) v konkrétním úseku DNA. Postup můžeme rozdělit do několika kroků: 1. PCR. Pomocí dvojice primerů amplifikujeme vybraný úsek DNA. Primery jsou specifické pro jedno konkrétní místo v jaderné nebo chloroplastové DNA. V jaderné (nukleární DNA, ndna) se nejjednodušeji a nejčastěji sekvenují oblasti tzv. internal transcribed spaceru (ITS), které jsou přítomny až v desítkách tisíc kopií. Úseky chloroplastového genomu se také velmi jednoduše amplifikují, protože kruhových molekul cpdna je v izolátu zpravidla velké množství. Často se sekvenují nekódující úseky (introny nebo spacery) jako např. trnl-trnf, psba-trnh atd. 2. Přečištění (purifikace) PCR produktu. Zbylé primery a neinkorporované nukleotidy (dntp) odstraníme pomocí komerčního kitu. To je velmi důležité, protože při následné sekvenační reakci je použit pouze jeden primer a také koncentrace dntp musí být vybalancována vzhledem k ostatním složkám, především fluorescenčně značeným nukleotidům (ddntp). 3. Cyklické sekvenování (cycle sequencing). Modifikovaná PCR reakce, při které použijeme pouze jeden sekvenační primer a PCR produkt jako templát. Nedochází tedy k exponenciální, ale pouze k lineární amplifikaci templátu. Kromě klasických dntp jsou v sekvenační směsi přítomny i ddntp (2,3 -dideoxynukleotidtrisfosfáty). Ty jsou fluorescenčně značeny (každá baze jinou barvou) a při inkorporaci do vznikajícího řetězce DNA zamezí jeho dalšímu prodlužování. Výsledkem sekvenační reakce je tak směs různě dlouhých řetězců DNA a každý je fluorescenčně označen barvou podle toho, kterou bazí končí. Tyto produkty jsou pak elektroforeticky rozděleny na automatickém sekvenátoru a je možno přečíst posloupnost jednotlivých bazí. Sekvenuje se vždy jen s jedním primerem. Sekvenátor umožní číst cca 700 bazí, záleží na kvalitě PCR produktu a na sekvenci bazí. Pokud chceme sekvenovat delší úsek než cca 700 bazí, je třeba provést dvě sekvenační reakce s různými primery, s tzv. forward a reverse primerem. PCR produkt bude osekvenován z obou stran. Získané sekvence se potom spojí dohromady pomocí speciálního programu. 4. Purifikace produktů sekvenační reakce. Před analýzou na automatickém sekvenátoru je třeba produkty cyklického sekvenování přečistit, např. na Sephadexu. 5. Sekvenační analýza na automatickém sekvenátoru. V kapilárním sekvenátoru ABI PRISM 3130xl firmy Applied Biosystems jsou produkty cyklického sekvenování elektroforeticky rozděleny podle délky. 9

14 Sekvenování Protokol na PCR amplifikaci Viz obecný protokol k PCR. Přečištění PCR produktu pomocí JETquick kitu (GENOMED) PCR produkt přečistíme pomocí kitu GENOMED Jetquick PCR Purification Spin Kit, který využívá tzv. spin column technique, tj. kolonky s membránou, na kterou se váže DNA. Alternativou je QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit, případně můžeme přečistit fragment vyřízlý z gelu pomocí QIAquick Gel Extraction Kit. Obecné Před započetím práce zkontrolujeme přidání ethanolu do pufru H2 (zaškrtnutí políčka na lahvičce). Do 1,5 ml eppendorfky odpipetujeme potřebný objem elučního pufru a předehřejeme na C. v termobloku. Předehřátí pufru je důležité v případě eluce PCR produktu delšího než 5 kb. Postup Ke zbylým 20 µl PCR produktu přidáme 80 µl roztoku H1 a důkladně promícháme na vortexu. Pozn.:V případě jiného objemu PCR reakce přepočteme množství H1 roztoku, aby zůstal poměr zachován. Vložíme kolonku do označené 2 ml eppendorfky bez víčka (z kitu), přepipetujeme do ní směs z předchozího bodu. Centrifugujeme 1 minutu při rpm. Odstraníme filtrát (to, co proteklo kolonkou), DNA zůstala vázána na membráně. Vložíme kolonku zpět do 2 ml eppendorfky a přidáme 500 µl roztoku H2. Centrifugujeme 1 minutu při rpm. Opět odstraníme filtrát (DNA vázaná na membráně je promyta). Vložíme kolonku zpět do 2 ml eppendorfky a centrifugujeme 1 minutu při maximálních otáčkách ( rpm), abychom důkladně odstranili roztok H2 z kolonky. Vložíme kolonku do nové (a označené!) 1,5 ml eppendorfky (není součástí kitu) a přímo těsně nad střed membrány pipetujeme µl TE pufru (příp. sterilní vody) předehřátého na C. 5 min inkubujeme na stole. Centrifugujeme 2 min při rpm (DNA je eluována). DNA dále skladujeme při 20 C. Příprava vzorků pro sekvenování DNA Pro optimální průběh sekvenační reakce je potřeba zvolit správný poměr koncentrace primeru ku PCR produktu. Změříme koncentraci DNA pomocí spektrofotometru Biowave II. Pracujeme na ledu a v Biohazard boxu. Do 0,2 ml eppendorfek určených pro sekvenaci pipetujeme přečištěnou DNA v množství dle délky PCR produktu (viz tabulka), 3 5 pmol primeru a sterilní vodu do celkového objemu 15 µl. 10

15 Sekvenování Templát Množství Kit 3.1 Kit 1.1 PCR produkty bp 1 3 ng 1 3 ng bp 3 10 ng 3 10 ng bp 5 20 ng 5 20 ng bp ng ng >2000 bp ng ng ssdna ng ng dsdna ng ng Množství templátové DNA závisí na naměřené koncentraci (pro každý vzorek podle koncentrace PCR produktu spočítáme kolik µl je potřeba, aby v reakci bylo přítomno např. 20 ng DNA a podle toho upravíme množství vody pro příslušný vzorek). Poklepem na eppendorfku prsty promícháme a krátce stočíme na stolní centrifuze a odneseme do sekvenčního centra v přízemí UMBR AV ČR, kde provedou cyklické sekvenování, přečištění sekvenční reakce a také sekvenční analýzu v 16 ti kapilárním sekvenátoru. Sekvenční centrum používá 2 sekvenační kity. Standardně používáme k sekvenaci 3.1 Cycle Sequencing Kit. 1.1 Cycle Sequencing Kit je lepší použít pokud je pro nás důležitý počátek sekvence studovaného úseku. 11

16 ISSR ISSR, Inter simple sequence repeat Princip Jedná se o metodu založenou na PCR, která využívá mikrosatelitové sekvence jako primery (16-25 bp). Mikrosatelity (SSR) jsou jednoduché krátké opakující se sekvence několika nukleotidů (1 4 báze), tzv. repetice. Tyto repetitivní jednotky se vyskytují často, náhodně, v celém genomu u všech eukaryot a liší se počtem opakování. Během PCR dochází k amplifikaci úseků DNA mezi dvěmi stejnými mikrosatelitovými repetitivními sekvencemi, které jsou umístěny v řetězci DNA v opačném směru. Výsledkem jsou různě dlouhé úseky DNA mezi mikrosatelity. Technické provedení této metody je podobné jako u RAPD analýzy (RAPD random amplified polymorphic DNA; metody sledující délku fragmentů DNA amplifikovaných pomocí určitého krátkého náhodně zvoleného primeru), kdy jsou využity tzv. arbitrární primery. Jde tedy o metodu univerzální, nevyžadující žádné znalosti o genomu zkoumaného organismu. ISSR nachází využití při studiu genetické diverzity, fylogeneze, mapování genomu a v evoluční biologii. ISSR primery nesou sekvenční motiv komplementární k sekvenci mikrosatelitů. Na jejich konci bývá často připojena kotva, tzv. anchor motiv. Nejčastěji 1 3 báze odlišné od repetitivní mikrosatelitní sekvence, které při PCR amplifikaci zajistí specifické nasednutí na konec komplementárního templátového mikrosatelitního motivu. Vlastní postup zahrnuje běžnou PCR za využití obvykle jednoho primeru. Méně často se používá kombinace dvou ISSR primerů. Produkty PCR amplifikace jsou vizualizovány na běžném agarózovém gelu. Výsledná sada vzniklých fragmentů odráží variabilitu v distribuci a délce mikrosatelitů v genomu. Analýzu každého vzorku je nutné provést ve dvou nezávislých PCR a do statistického hodnocení zahrnout pouze proužky, které se objeví v obou těchto nezávislých opakováních. 12

17 ISSR Postup PCR amplifikace Připravíme PCR směs pro příslušný počet vzorků + 1 rezerva jako negativní kontrola. Pracujeme stále na ledu. Pro 1 reakci o objemu 20 µl je složení následující: PCR voda... 3,8 µl primer (koncentrace 2,5 pm)... 4,8 µl PCR enhancer... 0,4 µl Plain PP Master Mix µl Promícháme, krátce centrifugujeme a pipetujeme po 19 µl do PCR stripů. Přidáme po 1 µl DNA vzorku. Promícháme poklepnutím prstem na strip a krátce centrifugujeme na stolní centrifuze. Vložíme do termocykleru a spustíme odpovídající teplotní program s použitím tzv. touchdown protokolu. Vizualizace na agarosovém gelu Připravíme 1,8 % agarózový gel. Po skončení programu stripy vyndáme z cykleru a krátce centrifugujeme. Smícháme 1 µl LB s 3 µl PCR produktu, promícháme a naneseme na gel. Jako žebříček použijeme 4 µl 100 bp Ladderu (před a za vzorky). Napětí nastavíme na 40 V, po vyjetí vzorků z jamek zvýšíme na 80 V, elektroforézu necháme běžet cca 4 h. Pořizujeme dvě fotky gelu, první na obvyklou expozici a druhou přeexponovanou (vyniknou i slabší, tj. méně amplifikované produkty). 13

18 Mikrosatelity Analýza mikrosatelitů Princip Mikrosatelitní DNA neboli mikrosatelity, také nazývané STR (short tandem repeats krátká tandemová opakování) nebo SSR (simple sequence repeats), jsou krátké segmenty DNA, ve kterých se mnohokrát opakují specifické motivy nukleotidových sekvencí. Nejčastěji jsou tvořeny opakováním mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidů, např. (A) n, (AT) n, (ATA) n apod. Počet opakování jednotky (repetice) v konkrétním místě DNA (lokusu) definuje alelu. Každý jedinec má v jaderné DNA dvě kopie každého mikrosatelitu, jeden zděděný po matce, druhý po otci. U diploidních jedinců tak můžeme odhalit dvě alely, u tetraploidních až čtyři atd. Délku alel(y) zjistíme PCR amplifikací daného lokusu pomocí primerů přiléhajících k mikrosatelitní sekvenci. Pro analýzu mikrosatelitů tedy potřebujeme znát okolní sekvence. PCR fragmenty pak rozdělíme podle délky v automatickém sekvenátoru tzv. fragmentační analýzou. Ke každému vzorku se přidá fluorescenčně značený standard (500-LIZ), obsahující fragmenty DNA o známé délce, aby bylo později možné identifikovat délku každého fragmentu (alely) a jednoznačně ji srovnávat s délkou fragmentů v jakémkoliv jiném běhu. Mikrosatelity jsou považovány za jedny z nejvhodnějších genetických markerů díky jejich hojnému výskytu v celém genomu, extrémní variabilitě (polymorfismu) a kodominantní dědičnosti (umožňuje rozlišit heterozygoty). V populační biologii nacházejí využití při identifikaci příbuzných jedinců, až po odvozování demografických parametrů. Jaderné mikrosatelity jsou často velmi druhově specifické, musíme tedy pracovat s druhem, pro nějž jsou primery již publikované. Používají se na vnitrodruhové úrovni. Chloroplastové mikrosatelity se naopak vyskytují v místech mezi konzervovanými sekvencemi. Na základě tzv. konsenzuálních primerů můžeme určité lokusy amplifikovat pro druhy z mnoha různých čeledí. Jsou tedy využitelné pro hodnocení variability mezi druhy. Postup 1) PCR Pro amplifikaci konkrétního úseku DNA, který obsahuje repetitivní mikrosatelitovou sekvenci použijeme dva specifické primery, jeden z primerů je fluorescenčně značený (používáme barvy 6-FAM, VIC, NED a PET). Pokud je třeba analyzovat více mikrosatelitových lokusů (často se analyzuje 8 10), je výhodné pokusit se sestavit tzv. multiplex PCR. Je to v podstatě běžná PCR reakce, do které přidáme více primerových páru najednou a amplifikujeme tak více lokusů (až třeba pět) v jedné PCR reakci. Můžeme tak výrazně snížit finanční i časové náklady na analýzu. Pro úspěšnou a dostatečnou amplifikaci všech lokusů musíme zaručit, aby (1) primery měly přibližně stejnou teplotu annealingu, (2) primery v jedné PCR reakci nevytvářely dimery, (3) lokusy s překrývajícím se rozsahem předpokládaných délek fragmentů byly označeny jinou fluorescenční barvou. 14

19 Mikrosatelity Do 1.5 ml eppendorfky napipetujeme směs pro příslušný počet vzorků + 1. Pracujeme stále na ledu. sterilní Milli-Q voda... 5,7 µl 2 Plain PP Master Mix (Top-Bio).. 7,5 µl forward primer (10 pmol/µl)... 0,4 µl reverse primer (10 pmol/µl)... 0,4 µl Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a po 14 µl pipetujeme do PCR zkumavek (případně stripů). Přidáme 1 µl naředěné DNA (5 ng/µl), promícháme na vortexu a vložíme do termocykleru s příslušným teplotním programem. Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost amplifikace na 1% agarosovém gelu v TBE pufru. Příprava pro fragmentační analýzu Připravíme směs osahující 0,25 µl velikostního standardu (Size standard, 500-LIZ), 0,5 µl od každého PCR produktu a doplníme deionizovaným formamidem (tzv. Hi-Di formamid = high deionized) na výsledný objem 10 µl. Postupujeme tak, že si nejprve připravíme směs formamidu a velikostního standardu pro příslušný počet vzorků +1. Promícháme, krátce stočíme, a rozpipetujeme do označených 0,5 ml eppendorfek. Přidáme PCR produkt(y). Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a odneseme do sekvenačního centra. 15

20 PCR-RFLP PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) Princip Metoda využívá tzv. restrikčních endonukleas, které specificky štěpí řetězec DNA. Např. enzym EcoRI rozštěpí DNA vždy, pokud nalezne sekvenci 3 -GAATTC-5. Vlastní postup se skládá z PCR amplifikace určitého úseku DNA a jeho štěpení vybranou restriktasou. Restrikční fragmenty dělíme elektroforeticky podle velikosti. Pokud PCR produkt obsahuje právě jedno štěpné místo, získáme dva kratší fragmenty nebo více fragmentů, pokud je štěpných míst více. Restrikční místa mohou mutacemi zanikat i vznikat. Hledáme polymorfismus ve štěpných místech a ten pak interpretujeme jako genetickou podobnost studovaných organismů. Postup 1) PCR amplifikace Viz obecný protokol pro PCR. Výsledek PCR ověřujeme standardním způsobem. Pro PCR-RFLP je důležité, aby byl na gelu pouze jeden specifický pruh. 2) Restrikce Každá restriktáza má svůj specifický restrikční pufr, ve kterém vykazuje maximální aktivitu. Restrikční pufry jsou dodávány s příslušným enzymem, např. od firmy Fermentas, Takara nebo NEB (plakát na zdi vedle mrazáku) a zajišťují stálé optimální ph během restrikce. Stálou optimální teplotu pro restrikční reakci pak zajistíme v termostatu nebo termocykleru. Pracujeme stále na ledu. Do sterilní 1,5 ml eppendorfky připravíme restrikční směs pro příslušný počet vzorků + 1. sterilní Mili-Q voda... 9,4 µl restrikční pufr (koncentrace 10 )... 2 µl (1,22 ) restrikční enzym (10 U/µl)... 1 µl Promícháme, krátce stočíme na stolní centrifuze a rozpipetujeme do jednotlivých 0,2ml PCR zkumavek po 12,4 µl. Přidáme 4 µl amplifikačního produktu, promísíme, stočíme a zkumavky vložíme na 4 5 h nebo přes noc do termocykleru nastaveného na teplotu 37 C. Po skončení restrikce přidáme 3 µl nanášecího pufru LB (barvička zastaví restrikční reakci) a naneseme na 1,7% agarosový gel v TBE pufru spolu se 6 µl 100 bp žebříčku. Pro větší rozlišení lze použít vertikální polyakrylamidový gel. 16

21 AFLP AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Princip Jde o restrikční metodu, která umožňuje analýzu polymorfismu v celkové genomové DNA a nevyžaduje znalosti o struktuře geonomu (specifické primery apod.). DNA je štěpena dvěma různými restrikčními enzymy a z velkého množství vzniklých fragmentů je pomocí dvou následných PCR selektována část fragmentů. (desítky až stovky). Sleduje se přítomnost nebo nepřítomnost fragmentu určité délky. Prvním krokem AFLP metody je restrikce. Pro štěpení DNA se používají restriktasy MseI a EcoRI, které štěpí DNA řetězec tzv. s přesahem, tj. na koncích fragmentů vznikají jenovláknové přesahy několika bazí. Na tyto volné konce se komplementárně vážou tzv. adaptory, krátké syntetické úseky dvouřetězcové DNA o známé sekvenci. Spojení adaptorů s konci restrikčních fragmentů zajišťuje enzym T4 DNA ligasa. Následuje tzv. preselektivní amplifikace, kdy PCR reakce probíhá s dvojicí primerů, které mají sekvenci komplementární k sekvenci adaptorů a obsahují jednu tzv. selektivní bázi navíc (obecně se používá C pro MseI primer a A pro EcoRI primer). Výsledkem PCR jsou fragmenty s MseI adaptorem na jednom konci a EcoRI adaptorem na druhém konci. Díky prodloužení o jednu selektivní bázi vzniká pouze 1/16 restrikčních fragmentů. Preselektované fragmenty vstupují do druhé, tzv. selektivní PCR, ve které jsou použity primery komplementární k adaptorům prodloužené o tři selektivní báze (C + dvě náhodně zvolené báze pro MseI a A + dvě náhodně zvolené báze pro EcoRI). Tím je počet fragmentů znovu redukován. EcoRI primery jsou fluorescenčně značené, což umožňuje separaci fragmentů v automatickém sekvenátoru tzv. fragmentační analýzou. Fragmenty jsou rozděleny podle délky, jejíž přesné určení umožní přidání fluorescenčně značeného standardu obsahujícího fragmenty DNA o známé délce ke každému vzorku. Obvykle se hledá několik primerových kombinací, které pak budou odlišeny různou fluorescenční barvou EcoRI primeru a mohou být na sekvenátoru analyzovány zároveň ve směsných vzorcích. Automatický sekvenátor ABI PRISM 3130xl firmy Applied Biosystems umožňuje současně analýzu čtyř různých primerových kombinací. Díky možnosti detekovat variabilitu na nízkých úrovních lze AFLP použít pro studium procesů v populacích, odlišení blízkých taxonů, při fylogeografických studiích apod. Existují ale i práce využívající AFLP pro studium fylogeneze i na rodové úrovni. Nevýhodou metody je poměrně vysoká cena, časová náročnost metody i požadavky na kvalitu DNA a přesné reakční podmínky při restrikci i PCR. V současnosti je možné v naší laboratoři použít dva protokoly: 17

22 AFLP A) Protokol s využitím AFLP kitů od firmy Invitrogen Obecné poznámky: Sekvenační centrum vyžaduje pro fragmentační analýzu, aby byl výsledný počet vzorků v násobcích 16. Během celého postupu pracujeme stále na ledu. Enzymy vyndáváme z mrazáku až těsně před jejich použitím a ihned poté vracíme zpět. Fluorescenčně značené primery chráníme před světlem (zkumavky obalujeme alobalem a necháváme rozmrzat např.v tmavé skříni). Pro práci používáme alikvoty. 1) Restrikce Využijeme AFLP Core Reagent Kit I. Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 2,5 µl na vzorek. sterilní H 2 O... 1,1 µl 5 Reaction buffer... 1,0 µl EcoRI/MseI enzyme mixture... 0,4 µl Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 2,5 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek. Přidáme 2,5 µl DNA (koncentrace ng/µl); výsledný objem 5 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze. Vložíme do termocykleru a inkubujeme 3 hodiny při teplotě 37. 2) Ligace Využijeme AFLP Core Reagent Kit I. Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 5 µl na vzorek. Adaptor/Ligation Solution... 4,8 µl T4 DNA ligase... 0,2 µl Směs promícháme, krátce centrifugujeme a přidáme po 5 µl ke vzorkům po restrikci; celkový objem 10 µl. Vložíme do termocykleru a spustíme restrikci: 12 hodin při teplotě 37. Pozn.: Nejlépe spustit odpoledne a nechat proběhnout přes noc, aby bylo možné ráno pokračovat preselektivní amplifikací. Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost restrikce/ligace na 1,8 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 3 5 µl směsi po ligaci spolu se 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět smír restrikčních fragmentů (zejména v oblasti bp). 3) Preselektivní amplifikace Využijeme AFLP Pre-amp Primer Mix I. Připravíme si preamplifikační směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 5 µl. PA mix... 4 µl PCR buffer (10 )... 0,5 µl DNA polymerasa (1 U/µl)... 0,1 µl 18

23 AFLP Směs promícháme, krátce centrifugujeme, a rozpipetujeme po 4,6 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek. Přidáme 0,4 µl DNA po ligaci; výsledný objem 5 µl. Vložíme do termocykleru a spustíme program pro preselektivní amplifikaci: 1 72 C 2 min C 1 s 56 C 30 s 72 C 2 min ramping 2 C/s 1 60 C 30 min 1 10 C hold Směs po preselektivní amplifikaci naředíme 10 naředíme (2 µl preamplifikační směsi + 18 µl sterilní H 2 O). Zbytek nenaředěného vzorku uschováme v 20 C pro případné opakování. Úspěšnost preselektivní amplifikace ověříme na 1,8 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 3 µl (neředěné) preamplifikační směsi spolu s 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět smír preamplifikačních fragmentů, na několika místech intenzivnější. 4) Selektivní amplifikace Připravíme si mix pro odpovídající počet vzorků + 1. Obvykle děláme pro každý vzorek 4 varianty, které se liší použitými primery (neznačený MseI a fluorescenčně značený EcoRI). Výsledný objem směsi je 7,5 µl na jeden vzorek v jedné variantě. Sterilní H 2 O... 5,1 µl PCR buffer (10x)... 1 µl dntp (10 mm)... 0,2 µl EcoRI primer (1 pmol/µl)... 0,5 µl MseI primer (5 pmol/µl)... 0,5 µl DNA polymerasa (1 U/µl)... 0,2 µl Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 7,5 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek. Přidáme 2,5 µl ředěné DNA po preselektivní amplifikaci, výsledný objem směsi 10 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze. Vložíme do cykleru a spustíme program pro selektivní amplifikaci: 1 94 C 2 min 65 C 30 s 72 C 2 min s ramping 2 C/s 8 94 C 1 s C 30 s touch-down by 1 C 72 C 2 min ramping 2 C/s C 1 s 56 C 30 s 72 C 2 min ramping 2 C/s 1 60 C 30 min 1 10 C hold 19

24 5) Příprava pro fragmentační analýzu AFLP Připravíme směs produktů selektivní amplifikace, které pocházejí z jednoho původního vzorku (jedné směsi po preamplifikaci), ale liší se fluorescenční barvou. Smícháme po 1 µl (nebo optimalizované objemy) od každé ze čtyř barev. Pokud není možné odnést vzorky na fragmentační analýzu v krátké době, přesrážíme selektivní PCR produkt octanem sodným (viz protokol C). Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Formamid je v laboratoři k dispozici v alikvotech pro přípravu 17 vzorků. Výsledný objem směsi je 10,5 µl na vzorek. Hi-Di formamid... 10,25 µl GeneScan 500LIZ Size standrad...0,25 µl Ke směsi přidáme 0,5 µl smíchané DNA po selektivní amplifikaci. Takto připravené vzorky ihned odneseme do sekvenančního centra na fragmentační analýzu. B) Protokol bez využití AFLP kitů Obecné poznámky viz protokol A. ATP je skladováno při 80 C, proto potřebné množství necháme rozmrznout v předstihu. 1) Restrikce DNA naředíme TE pufrem tak, abychom měli 50 ng DNA v celkovém objemu 40 µl. Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 10 µl na vzorek. R/L buffer (koncentrace 10x)... 5 µl sterilní H 2 O... 4,25 µl EcoRI (koncetrace 20U/µl)... 0,25 µl (= 5 U) MseI (10U/µl)...0,5 µl (= 5 U) Směs promícháme a rozpipetujeme po 10 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek. Přidáme 40 µl DNA, výsledný objem 50 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze. Vložíme do cykleru a inkubujeme 16 hodin při teplotě 37 C Pozn.: Nejlépe spustit odpoledne a nechat proběhnout přes noc, aby bylo možné ráno pokračovat ligací. 2) Ligace Připravíme si ligační směs pro odpovídající počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 10 µl na vzorek. sterilní H 2 O... 6,2 µl R/L buffer (koncentrace 10x)... 1 µl EcoRI 3 adaptor (50 pmol/µl)... 0,1 µl EcoRI 5 adaptor (50 pmol/µl)... 0,1 µl MseI 3 adaptor (250 pmol/µl)... 0,2 µl MseI 5 adaptor (250 pmol/µl)... 0,2 µl ATP (10 mm)... 1,2 µl T4 ligasa (1 U/µl)... 1 µl (= 5 pmol) (= 5 pmol) (= 50 pmol) (= 50 pmol) (= 1,2 pmol) = 1 U 20

25 Směs promícháme a rozpipetujeme po 10 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek. Přidáme 50 µl DNA po restrikci. Výsledný objem ligační směsi je 60 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze. Vložíme do cykleru a spustíme program pro ligaci: 3 hodiny při 37 C. AFLP Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost restrikce/ligace na 1,8 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 10 µl směsi po ligaci spolu se 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět smír restrikčních fragmentů (zejména v oblasti bp). Směs po ligaci 10x naředíme (5 µl ligační směsi + 45 µl T0.1E pufru). Zbytek nenaředěného vzorku po ligaci uschováme v 20 C pro případné opakování (naředěných 50 µl stačí pro 10 preamplifikačních reakcí). 3) Preselektivní amplifikace Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 45 µl na vzorek. Sterilní H 2 O... 30,5 µl PCR buffer (10x)... 5 µl MgCl 2 (25 mm)... 8 µl (= 4 mm) dntp (10 mm)... 1 µl (= 0.2 mm) EcoRI+A primer (500 ng/µl)... 0,15 µl (= 75 ng) MseI+C primer (500 ng/µl)... 0,15 µl (= 75 ng) DNA polymerasa (5 U/µl)... 0,2 µl (= 1 U) Směs promícháme a rozpipetujeme po 45 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek. Přidáme 5 µl naředěné DNA po ligaci. Výsledný objem směsi je 50 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze. Vložíme do cykleru a spustíme program pro preselektivní amplifikaci: 1 94 C 1 min C 30 s 60 C 30 s 72 C 60 s ramping 1 C/s 1 72 C 9 min 1 10 C hold Úspěšnost preselektivní amplifikace ověříme na 1,2 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 10 µl preamplifikační směsi spolu s 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět smír preamplifikačních fragmentů, na několika místech intenzivnější. Směs po preselektivní amplifikaci 20 ředíme (5 µl preamplifikační směsi + 95 µl TE pufru). Zbytek nenaředěného vzorku uschováme v 20 C pro případné opakování. 21

26 AFLP 4) Selektivní amplifikace Připravíme si mix pro odpovídající počet vzorků + 1. Obvykle děláme pro každý vzorek 4 sady vzorků, které se liší použitými primery (neznačený MseI a fluorescenčně značený EcoRI). Výsledný objem směsi je 7,5 µl na jeden vzorek v jedné sadě. Sterilní H 2 O... 4,5 µl PCR buffer (10x)... 1 µl MgCl 2 (25 mm)... 0,6 µl (= 1,5 mm) dntp (10 mm)... 0,2 µl (= 0.2 mm) MseI+CNN primer (300 ng/µl)... 0,1 µl (= 30 ng) EcoRI+ANN primer (5 ng/µl)... 1 µl (= 5 ng) DNA polymerasa (5 U/µl)... 0,1 µl (= 0,5 U) Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 7,5 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek. Přidáme 2,5 µl ředěné DNA po preselektivní amplifikaci, výsledný objem směsi je 10 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze. Vložíme do cykleru a spustíme program pro selektivní amplifikaci: 1 94 C 2 min C 30 s C 30 s touch-down by 1 C 72 C 60 s ramping 1 C/s C 9 min 56 C 30 s 72 C 60 s ramping 1 C/s 1 72 C 15 min 1 10 C hold 5) Příprava pro fragmentační analýzu Připravíme směs produktů selektivní amplifikace, které pocházejí z jednoho původního vzorku (jedné směsi po preamplifikaci), ale liší fluorescenční barvou. Smícháme po 1 µl (nebo optimalizované objemy) od každé ze čtyř barev. Pokud není možné odnést vzorky na fragmentační analýzu v krátké době, přesrážíme selektivní PCR produkt octanem sodným (viz protokol C). Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Formamid je v laboratoři k dispozici v alikvotech pro přípravu 17 vzorků. Výsledný objem směsi je 10,5 µl na vzorek. Hi-Di formamid... 10,25 µl GeneScan 500LIZ Size standrad...0,25 µl Ke směsi přidáme 0,5 µl smíchané DNA po selektivní amplifikaci. Takto připravené vzorky ihned odneseme do sekvenančního centra na fragmentační analýzu. 22

27 AFLP C) Přesrážení octanem sodným Všechny centrifugační kroky probíhají při 4 C v předem vychlazené centrifuze. Na stěnu 1,5 ml eppendorfky pipetujeme 1 µl 3M octanu sodného. Do kapky octanu sodného přidáme 3 µl směsi DNA po selektivní amplifikaci. Přidáme 25 µl čistého 96% ethanolu. Promícháme na vortexu, krátce stočíme na stolní centrifuze. Necháme stát 20 min v mrazáku při 20 C. Centrifigujeme 30 min při rpm. Eppendorfky v centrifuze orientujeme do stejné pozice, abychom měli DNA usazenou vždy na stejném místě. Pomalu a opatrně slijeme supernatant, DNA zůstává usazená na stěně eppendorfky. Přidáme 100 µl 70% ethanolu. Centrifigujeme 5 min při rpm. Pomalu a opatrně slijeme supernatant, DNA zůstává na stěně eppendorfky. Otevřené eppendofky necháme stát ve stojánku 5 min při laboratorní teplotě a následně dosušíme 10 min v termobloku při 65 C. Skladujeme v lednici (4 C). Před přípravou pro fragmentační analýzu rozpustíme ve 3 µl sterilní destilované vody (nebo TE pufru). 23

28 Elektroforéza DNA Elektroforéza DNA Horizontální agarosová elektroforéza pracujeme v rukavicích, protože všechny věci mohou být kontaminovány SyberGreenem (potencionální mutagen!) do Erlenmeyerovy baňky na předvážkách navážíme příslušné množství agarosy (nejčastější navážky viz tabulka) % gel agarosa [g] 0.7 0,21 0,35 0,42 0,84 1,4 0,8 0,24 0,4 0,48 0,96 1,6 1,0 0,3 0,5 0,6 1,2 2 1,5 0,45 0,75 0,9 1,8 3 1,8 0,54 0,9 1,08 2,16 3,6 3,0 0,9 1,5 1,8 3,6 6 1 TBE [ml] přidáme příslušné množství 1 TBE pufru (odměříme odměrným válcem), lehce kroužením promícháme vložíme na několik minut do mikrovlnky na W; v uvařeném gelu nesmí být viditelné krystalky ( nitky ) agarosy mezitím si připravíme vaničku na nalití gelu položíme ji na nalévací stolek (vodováhy v rozích) podle počtu nanášených vzorků vybereme hřeben s dostatečným počtem zubů a umístíme ho do zářezů ve vaně uvařený gel ochladíme kroužením Erlenkou pod tekoucí vodou (používáme rukavici, abychom se nespálili) na teplotu cca 50 C (odhadneme tak, že udržíme ruku na dně baňky) gel pomalu naléváme do vaničky s hřebínky, špičkou odstraníme případné bublinky v gelu a necháme tuhnout cca 30 minut po ztuhnutí opatrně vyjmeme hřebínky, vaničku s gelem vložíme do elektroforetické vany a zalijeme pufrem (1 TBE) tak, aby celý gel byl těsně pod hladinou a všechny jamky byly zality krajní jamky necháváme prázdné, do druhé jamky pipetujeme cca 6 µl 100bp Ladderu (žebříčku) a do dalších jamek pak směs DNA s nanášecím pufrem LB (Loading Buffer) po nanesení všech vzorků na gel přiklopíme víko s přívodními kabely, připojíme elektroforézu ke zdroji; napětí nastavíme v modu SET na V (dle velikosti gelu) otáčením knoflíku pro spuštění elektroforézy vypneme mod SET ; po vyjetí vzorků z jamek napětí zvýšíme ve chvíli, kdy čelo (nejrychlejší barvička) dojíždí ke konci gelu, vypneme proud, sejmeme víko elektroforetické aparatury, vyndáme gel a umístíme do komory UV transiluminátoru dokumentačního systému Gel Imager 24

29 Elektroforéza DNA Vertikální polyakrylamidová elektroforéza na 6,2% kontinuálním gelu Pozor, akrylamid je toxický! Obecné Viz protokol na isozymy. Postup Do 1,5 ml eppendorfky připravíme 10% roztok APS (ammonium persulfate). APS... 0,022 g... 0,033 g... 0,056 g destilovaná voda µl µl µl Do vysoké 250 ml kádinky připravíme následující směs: 1 gel 2 gely 4 gely Mili-Q voda... 19,85 ml... 39,7 ml... 59,55 ml akrylamid (40%) + BIS (1 %)... 3,9 ml... 7,8 ml... 11,7 ml 20 TBE pufr... 1,25 ml... 2,5 ml... 3,75 ml Opatrně, ale důkladně promícháme kroužením (netřepat a nedělat bubliny, kyslík brzdí polymeraci). V digestoři přidáme iniciátor (APS) a katalyzátor (TEMED) polymerace. 1 gel 2 gely 4 gely 10% APS µl µl µl TEMED µl µl µl Opatrně promícháme a ihned naléváme gel, zastrčíme hřebeny mezi skla. Necháme gel 2 3 hodiny polymerovat. Stejně tak necháme polymerovat zbytek roztoku v kádince, nevyléváme ho do odpadu! Po ztuhnutí gelu vypláchneme jamky 1 TBE pufrem, naneseme vzorky a 100bp ladder. Do horní i spodní elektroforetické vany nalijeme 1 TBE pufr. Aparaturu není nutné chladit. Elektroforézu spustíme na konstantní napětí 50 V, po vyjetí vzorků z jamek (cca 20 min.) zvýšíme napětí na 150 V. Elektroforéza trvá cca 3 hodiny. Po skončení elektroforézy od sebe oddělíme skla. Gel ze skla nezvedáme prsty, ale opatrně nadzvedneme špachtlí nebo nožem jeden roh a střičkou stříkáme pod gel destilovanou vodu, dokud se gel od skla zcela neodlepí (sklo držíme rovně, aby gel po odlepení nesklouznul). Pracujeme nad miskou, do které odtéká přebytečná voda. Odlepený gel necháme opatrně sklouznout na navlhčenou plochu UV transluminátoru a vyfotíme. 25

30 Elektroforéza DNA Práce s dokumentačním systémem Gel Imager a softwarem Scion VisiCapture Při manipulaci s gelem, nalévací vaničkou a elektroforetickou vanou pracujeme v rukavicích! Po skončení elektroforézy vypneme zdroj a odpojíme od něj kabely. Vyjmeme vaničku s gelem z elektroforetické vany. Do komory fotodokumentačního zařízení umístíme již samotný gel a otočíme ho o 90 (horní jamky jsou blíž levé straně komory transluminátoru), opatrným posouváním po ploše se zbavíme případných vzduchových bublin pod gelem, gel srovnáme. Bez rukavic (!) spustíme program Scion VisiCapture. Klikneme na Image a vybereme Start Live Capturing. Při otevřených dvířkách komory si gel připravíme k focení, přímo na objektivu kamery můžeme vyladit zoom (velikost gelu nebo jeho části) a clonu (jas). Zavřeme dvířka a zapneme UV světlo, popřípadě ještě doladíme obraz (expozici lze vyladit kliknutím na Image a Properties nastavením délky expozice nebo elektronického zesílení signálu, tj. gain). Klikneme na Image a gel vyfotíme tlačítkem Snap. Obrázek uložíme vybráním File a Save As do příslušné složky. Vypneme zdroj UV světla, otevřeme dvířka, gel v rukavicích (!) zabalíme do papírového ručníku a vyhodíme do odpadkového koše k tomu určeného a očistíme plochu UV transiluminátoru ethanolem. DNA žebříčky (ladders) používané v laboratoři (NEB) 100 bp DNA Ladder (NEB) Lambda DNA-Hind III Digest (NEB) 0.5µg 100 bp DNA žebříčku/jamku, 1,3% agarosový gel v 1X TAE 0.5 µg Lambda DNA-Hind III Digest/jamku, 1,0% agarosový gel 26