Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Transkript

1 Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Ivo Frébort 4. Metody molekulární biologie I

2 Izolace DNA a RNA Specifické postupy pro baktérie, kvasinky, rostlinné a živočišné tkáně U RNA nutno zabránit kontaminaci RNasami Rozbití buněk NaOH/SDS, detergenty, sonikace, kapalný dusík Odstranění proteinů srážení fenol/chloroform, proteinasa K, centrifugace a odstranění sraženiny Zakoncentrování DNA/RNA srážení ethanolem, centrifugace a separace sraženiny Přečištění na afinitní kolonce Skladování -20/-80 o C

3 Elektroforetická separace DNA ethidium bromid polyakrylamidový gel agarosový gel agarosový gel elektroforéza v pulsním poli

4 Southern blot / Northern blot Hledání určité sekvence DNA/RNA pomocí sondy Fragmenty DNA/RNA separujeme v agarosovém gelu Převedení dsdna na ssdna - NaOH Neutralizace a přenos na membránu (nitrocelulosa, Immobilon P) Přenos pomocí kapilárních sil Inkubace se značenou oligonukleotidovou probou Značení pomocí 32 P nebo chemiluminiscenčním markerem Lokalizace hledaných fragmentů

5 Southern blot

6 Klonování Klon: soubor molekul nebo buněk, které jsou všechny identické s původní (originální) molekulou nebo buňkou Klonování genu znamená vytvořit mnoho jeho kopií (např. v populaci baktérií, kvasinek, atd.). Gen může být přesná kopie původního genu Gen může být upravenou verzí původního genu Umožňuje to technologie rekombinantní DNA

7 Plasmidy a klonovací vektory Plasmidy - přirozené extrachromosomální DNA Plasmidy jsou cirkulární dsdna Plasmidy mohou být štěpeny restrikčními enzymy za vzniku lepivých konců Umělé plasmidy mohou být konstruovány spojením fragmentů nové DNA s lepivými konci plasmidů Plasmidy lze modifikovat za vzniku nových genů Plasmidy použité jako klonovací vektory musí obsahovat: replikátor (počátek replikace) výběrový (selekční) marker (gen rezistentní na antibiotikum) klonovací místo (místo, kde vložení cizí DNA neporuší replikaci nebo nedeaktivuje důležité markery

8 Chimerické plasmidy Pojmenovány podle mytologických zvířat s částmi těl z různých tvorů Po rozštěpení plasmidu restrikčním enzymem může být vložen cizí fragment Konce plasmidového fragmentu jsou uzavřeny za tvorby "rekombinantního plasmidu" Plasmid se může replikovat ve vhodném bakteriálním hostiteli

9 Klonování do plasmidu

10 Typické klonovací plasmidy

11 Restrikční endonukleasy Baktérie dokážou zabránit ("restrict ) možnosti útoku cizí DNA pomocí restrikčních enzymů Restrikční enzymy Typu II a III štěpí řetězce DNA na místech specifické sekvence Tyto enzymy rozpoznávají sekvence 4, 6 nebo více bazí a štěpí je. Názvy těchto enzymů používají 3-písmenný kód (psaný kurzívou): 1. písmeno označuje rod, 2. a 3. písmeno druh organismu Např. EcoRI je první restrikční enzym nalezený v kmeni R baktérie Escherichia coli.

12 Restrikční štěpení a ligace DNA

13 Reakce DNA ligasy

14 Klonování pomocí linkeru

15 Řízené klonování Vložení cizí DNA v určitém směru pomocí dvou různých restrikčních endonukleas

16 Genetická transformace baktérií/kvasinek Vnesení chimerického plasmidu Tepelný šok (42 o C), LiAc Elektroporace 1,5/1,8 kv, ~5 ms

17 Klonování s využitím lacz genu

18 Modré a bílé kolonie

19 Knihovny DNA Sada fragmentů klonované DNA z určitého organismu Gen tvoří malou frakci DNA v dané buňce Nelze ho přímo izolovat V DNA knihovně je ale možné nalézt fragment DNA, který obsahuje hledaný gen Malá pravděpodobnost nutný velký počet klonů v knihovně Hledání 10 kbp fragmentu v lidské genomové knihovně nutno testovat 1,4 milionu klonů k dosažení 99% pravděpodobnosti nalezení správného klonu.

20 Genomové a cdna knihovny Chromosomal DNA

21 Izolace eukaryotní mrna

22 Příprava cdna

23 Příprava knihovny za využití bakteriofága λ

24 Vektory YAC sekvencování lidského genomu

25 Hybridizace kolonií Způsob hledání DNA fragmentu Připraví se dostatečný počet agarových ploten obsahujích klony hostitelského organismu z dané DNA knihovny Plotny se otisknou na nitrocelulosovou membránu Alkalizací se lyzují buňky a převede dsdna na ssdna Membrány se inkubují s probou značenou ssdna (většinou 32 P) odpovídající hledanému fragmentu DNA Proba se váže hybridizací na hledaný fragment

26 Hybridizace kolonií

27 Enzymová (dideoxy) metoda sekvenování DNA

28 Sekvenování DNA

29 Fluorescenční barviva pro sekvenování DNA

30 Automatický DNA sekvenátor

31 Odvození sekvence proteinu z DNA

32 Nové metody sekvenování genomu (High-throughput genome sequencing) Whole Genome Sequencing (WGS, FGS) komparativní sekvenování člověk 3 mld. bp de novo sekvenování - do 50 mil. bp mikrobiální genomy Amplicone Sequencing detekce mutací (SNP) Transcriptome Sequencing mrna/cdna, exprese genů Metagenomics studium genomů v komplexním vzorku

33 Full Genome Sequencing Race Archon X Prize for Genomics - 10 mil. USD pro toho, kdo postaví přístroj, který bude schopen sekvenovat 100 lidských genomů za 10 dní s přesností 1/100 tis., pokrytím 98% a náklady do 10 tis. USD/genom Illumina, Knome, Sequenom, 454 Life Sciences, Pacific Biosciences, Complete Genomics, Intelligent Bio-Systems, Genome Corp., ION Torrent Systems, Helicos Biosciences, IBM 454 Life Sciences 50 tis. USD Knome tis. USD Illumina 19.5 tis. USD Pacific Biosciences, Complete Genomics 5 tis. USD?? Metodiky Sequencing by synthesis Nanopore technology DNA Transistor Fluorophore technology

34 Pyrosekvenování 454 Life Sciences

35 Princip pyrosekvenování 1. DNA polymerasa po přidání datp, dctp, dgtp nebo dttp inkorporuje pouze komplementární nukleotid, uvolní se PPi. 2. ATP sulfurylasa s adenosin 5 -phosphosulfátem převede PPi na ATP. 3. Luciferasa s ATP - přeměna luciferinu na oxyluciferin a světelné kvantum. 4. Apyrasa degraduje nevyužité dntps a ATP.

36 Solexa (Illumina) princip Sekvenování pomocí značeného reversibilního terminátoru 1. Inkorporace jednoho 3 -fluorescenčně značeného nukleotidu 2. Detekce značení 3. Chemická hydrolýza/odstranění značení/terminátoru

37 SMRT Technology (ZMW - zero-mode waveguide) -1 molekula DNA polymerasy imobilizovaná v ZMW - 5 -značené nukleotidy (na fosfátu), každý specifickým fluoroforem - laserem ozářené dno ZMW excitace fluorescence poblíž polymerasy - reakce polymerasy - 10 ms fluorescence daného nukleotidu - difuse nukleotidů 1000x rychlejší, krátké signály/šum